Способ лечения острого повреждения легких и способ лечения фиброза, моноклональное антитело, гибридома атсс нв12382

 

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии и пульмонологии, и касается лечения острого повреждения легких и фиброза. Для этого предлагают вводить пациенту терапевтическую дозу антитела, специфически связывающего αvβ6. Предложена также гибридома - продуцент указанного антитела. Способ обеспечивает подавление интегринового рецептора αvβ6, что приводит к купированию процессов фиброза и также явлений острого повреждения легких. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 3 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к области медицины, в частности касается способов лечения острого повреждения легких и фиброза с использованием антагонистов αvβ6. Данная работа частично поддерживается грантами NIH (Национального института здравоохранения) HL47412 и HL53949. Правительство США может иметь определенные права на данное изобретение.

Уровень техники Интегрины представляют собой гетеродимерные рецепторы клеточной адгезии, состоящие из двух субъединиц, α и β. Интегрин αvβ6 представляет собой рецептор фибронектина и тенасцина, экспрессирующийся в основном в эпителиальных клетках. В здоровых тканях взрослых приматов редко определяются мРНК и белок β6, хотя β6 экспрессируется во время развития эмбриона, заживления ран и в некоторых эпителиальных опухолях. Когда β6-субъединица экспрессируется в линии клеток карциномы толстой кишки, в которой она в норме отсутствует, экспрессия субъединицы обусловливает повышенную способность к пролиферации. Карбоксильный концевой участок из 11 аминокислот, уникальный для β6-субъединицы, является необходимым для активности интегрина αvβ6 в отношении повышения пролиферации (см. статью Agrez и соавт., J. Cell Biol., 127: 547-556, 1994). Экспрессия β6 индуцируется в альвеолярных эпителиальных клетках типа II при повреждениях, вызываемых инъекцией живых бактерий, и экспрессию β6 наблюдают в локальных участках субклинического воспаления, а также в ряде клинических образцов, полученных от пациентов с хроническим или острым воспалением легких или почек (см. статью Breuss и соавт., J. Cell Sci., 108:2241-2251, 1995).

Huang и соавт. (J. Cell Biol., 133:921-928, 1996) обнаружили, что у мышей, гомозиготных по нулевой мутации в гене, кодирующем β6-субъединицу, было ювенильное облысение, связанное с инфильтрацией макрофагов в кожу, и у них накапливались активированные лимфоциты вокруг проводящих дыхательных путей в легких.

Фиброз легких представляет собой обычное нарушение, обусловленное, как полагают, деструктивными эффектами продуктов, выделяющихся из лейкоцитов (см. , например, статью Marshall и соавт., Int. J. Biochem. Cell Bio., 29: 107-120, 1997). Индуцированные блеомицином повреждение легких и фиброз легких ассоциированы и могут зависеть от рекрутинга и активации лимфоцитов (см. статью Schrier D.J. и соавт., Am. J. Pathol., 116:270-278, 1984). Среди предлагаемых способов терапии повреждений паренхимы легких и фиброза легких находится применение "антицитокиновых" терапевтических подходов (см. статью Coker и соавт., Thorax, 52(2):294-296, 1997).

Однако современные способы терапии острого повреждения легких и фиброза легких являются в значительной мере неадекватными (см., например, King и соавт. "Идиопатический фиброз легких и другие интерстициальные заболевания легких неизвестной этиологии" (Idiopathyic Pulmonary Fibrosis and other Interstitial Lung Diseases of Unknown Etiology) в Руководстве по терапии дыхательной системы (Textbook of Respiratory Medicine) под ред. Murray и Nadel, W. B. Saunders, Philadelphia, PA, стр. 1827-1839, 1994). Таким образом, существует необходимость в способах терапии острого легочного повреждения и фиброза легких. Настоящее изобретение направлено на решение данной задачи и других проблем.

Сущность изобретения Одним объектом изобретения является способ лечения острого повреждения легких у пациента, предусматривающий введение пациенту терапевтической дозы антагониста αvβ6. В изобретении представлены также способы ингибирования метастазов в легких, предусматривающие введение пациенту терапевтической дозы антагониста αvβ6. Следующим объектом изобретения является способ лечения фиброза у пациента, который включает введение пациенту терапевтической дозы антагониста αvβ6. Другим объектом изобретения является моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой АТСС НВ12382.

Еще одним объектом изобретения является гибридома АТСС НВ12382.

Перечень чертежей и иных материалов На фиг. 1.1 представлен график сравнения содержания гидроксипролина в легких у мышей, экспрессирующих нулевую мутацию гена субъединицы интегрина β6, с контрольными мышами в присутствии блеомицина (blm) или физиологического раствора (sal).

Фиг. 1.2 представляет собой фотографию трехцветного окрашивания срезов легких при низком увеличении, которая демонстрирует непроницаемое накопление коллагенового экстрацеллюларного матрикса в легких леченных блеомицином мышей дикого типа (β6+/+), но не у мышей β6-/- через 30 дней после лечения.

На фиг. 2 представлен график сравнения повышения содержания воды в легких у мышей дикого типа (β6+/+) относительно мышей β6-/- в присутствии блеомицина (blm) или физиологического раствора (sal).

На фиг. 3 представлен график сравнения рекрутинга лимфоцитов у мышей дикого типа (β6+/+) и мышей β6-/- после введения блеомицина (blm) или физиологического раствора (sal).

Сведения, подтверждающие возможность использования изобретения Настоящее изобретение представляет способы и композиции для лечения острого легочного повреждения, такого как, но не ограничиваясь, повреждение легких в результате бактериального сепсиса, геморрагического шока, вдыхания токсических веществ и индуцированных блеомицином и другими лекарственными веществами повреждений легких. Кроме того, композиции, соответствующие изобретению, используют при лечении фиброза в эпителиальных органах, таких как легкие, печень, почки, мочевой пузырь и пищевод.

Данные композиции могут быть прописаны с профилактической или терапевтической целью пациентам с симптомами острого повреждения легких или фиброза, или при их риске. Например, пациентов, подвергшихся воздействию токсического аспирата (средства, применяемого при вдыхании), вероятно, следовало бы лечить после данного воздействия, тогда как пациент, получающий блеомицин, может проходить профилактическое или терапевтическое лечение. Обычно композиции, соответствующие данному изобретению, вводят ежедневно в период 1-5 дней, хотя пациенты с развившимся фиброзом легких, прогрессирующим заболеванием, могут получать терапевтические дозы в периоды от нескольких месяцев до нескольких лет. Как используют в данном контексте, "терапевтическая доза" представляет собой дозу, которая предупреждает, облегчает, ослабляет или иным образом снижает остроту симптомов у пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения представлены антагонисты αvβ6. Данные антагонисты включают, но не ограничиваются антителами, которые специфически связывают β6; антителами, которые специфически связывают лиганд αvβ6; лигандами для αvβ6; антисмысловыми нуклеиновыми кислотами и пептидными, непептидными и пептидомиметическими аналогами таких лигандов.

Антитела могут быть синтетическими, моноклональными или поликлональными и могут быть получены с помощью известных в уровне техники способов. В предпочтительном варианте осуществления антагонист представляет собой антитело, которое специфически распознает цитоплазматический участок субъединицы β6 (см., например, статью Weinacker и соавт., J. Cell Bio., 269:1-9, 1994). Для терапевтического применения "человеческие" моноклональные антитела, имеющие человеческие константный и вариабельный участки, часто являются предпочтительными в плане минимизации иммунного ответа пациента в отношении антитела. Данные антитела могут быть получены путем иммунизации трансгенных животных, которые несут гены человеческого иммуноглобулина. См. статью Jakobovits и соавт. , Ann. NY Acad. Sci., 764:525-535 (1995). В связи с синтетическими и полусинтетическими антителами данные термины предназначены для того, чтобы охватывать, но не ограничиваются фрагментами антител, антителами с переключенным изотипом, гуманизированными антителами (например, типа мышь-человек, человек-мышь и т.п.), гибридами, антителами, имеющими множество специфичностей, полностью синтетическими молекулами, подобными антителам и т.п.

Как обсуждают ниже, антитела могут быть отобраны по способности блокировать связывание лиганда с αvβ6 и/или другим свойствам, таким как способность защищать in vivo от индуцированного блеомицином фиброза легких. Примером моноклонального антитела против β6 является 10D5 (депозит АТСС No HB12382, депонированный 6 августа 1997 г.).

В других вариантах осуществления изобретения используют агонисты, представленные пептидами, полипептидами, белками или пептидомиметиками, разработанными в качестве лигандов для αvβ6 на основе наличия домена клеточной адгезии аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD). Примеры конструирования таких молекул, как лиганды для интегринов, приведены, в частности, в работах Pierschbacher и соавт. , J. Cell. Biochem., 56:150-154 (1994); Ruoslahti, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol., 12:697-715 (1996); Chorev и соавт., Biopolymers, 37: 367-375 (1995); Pasqualini и соавт. , J. Cell. Biol., 130:1189-1196 (1995), и Smith и соавт., J. Biol. Chem., 269:32788-32795 (1994).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот используют в качестве антагонистов αvβ6. Антисмыловые молекулы нуклеиновых кислот комплементарны олигонуклеотидным нитям нуклеиновых кислот, сконструированных для связывания специфической последовательности нуклеотидов с целью ингибирования образования белка-мишени. Нуклеотидная последовательность β6-субъединицы интегрина была описана в заявке USSN 07/728215, поданной 11 июля 1991 г., включенной в данный контекст в виде ссылки во всей ее полноте. Данные агенты могут быть использованы в виде монокомпонента или в комбинации с другими антагонистами. Антисмысловой антагонист может быть получен как антисмысловой олигонуклеотид, такой как РНК (см. , например, статью Murayama и соавт., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 109-114, 1997). Антисмысловые гены могут быть также получены в вирусном векторе, таком, например, как в вирусе гепатита В (см., например, статью Ji и соавт., J. Viral. Hepat., 4:167-173, 1997); в аденоассоциированном вирусе (см. , например, статью Xiao и соавт., Brain Res., 756:76-83, 1997) или в других системах, включающих, но не ограниченных системой доставки генов HVJ(вируc Sеndai)-липосома (см., например, статью Kaneda и соавт., Ann. NY Acad. Sci., 811:299-308, 1997); "пептидным вектором" (см., например, статью Vidal и соавт., CR Acad. Sci. III, 32:279-287, 1997); доставкой в виде гена в эписомном или плазмидном векторе (см., например, статьи Cooper и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6450-6455, 1997), Yew и соавт., Hum. Gene Ther. , 8:575-584, 1997); доставкой в виде гена в агрегате пептид-ДНК (см., например, статью Niidome и соавт., J. Biol. Chem., 272:15307-15312, 1997), доставкой в виде депротеинизированной ДНК(см., например, патенты США 5580859 и 5589466) и в липидных векторных системах (см., например, статью Lee и соавт., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:173-206, 1997).

Скрининг кандидатных антагонистов αvβ6 может быть проведен по функции рядом способов, известных в уровне техники и/или описанных в данной заявке, таких как защита от индуцированного блеомицином фиброза на модели на мышах, ингибирование пролиферации опухолевых клеток (см. статью Agrez и соавт., J. Cell Bio., 127:547-556, 1994) и ингибирование миграции клеток и/или ингибирование клеточной адгезии (см. раздел Экспериментальные примеры).

Множество подходящих препаратов антагонистов, соответствующих изобретению, может быть обнаружено в фармакологическом справочнике, известном всем фармацевтам - "Фармацевтические науки" Ремингтона (Remington's Pharmaceutical Sciences), (15-e издание, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1975), в частности в главе 87 справочника, написанной Blaug, Seymour. Данные препараты включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, безводные адсорбирующие основы, эмульсии типа масло в воде или вода в масле, эмульсии типа карбовакс (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс.

Количества активного ингредиента, необходимые для эффективной терапии, будут зависеть от многих различных факторов, включая средства введения, участок-мишень, физиологическое состояние пациента и другие применяемые лекарственные препараты. Таким образом, лечебные дозы должны быть определены с целью оптимизации безопасности и эффективности. Обычно дозами, применяемыми in vitro, можно успешно руководствоваться в плане количеств активных ингредиентов, используемых для введения in situ. Тестирование на животных эффективных доз для лечения определенных нарушений будет служить следующим критерием для предсказания дозы для человека. Различные мнения обсуждаются, например, в монографии Goodman и Gilman "Фармакологические основы терапии" (Pharmacological Basis of Therapeutics), 7-ое изд., MacMillan Publishing Company, New York, (1985) и в справочнике "Фармацевтические науки" Ремингтона (Remington's Pharmaceutical Sciences), (18-oe издание, Mack Publishing Co, Easton, Penn., 1990). Способы введения обсуждаются в данном контексте, включая пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, чрескожное, назальное, ионофоретическое введение и т.п.

Композиции, соответствующие изобретению, могут вводиться в различных дозированных лекарственных формах в зависимости от способа введения. Например, дозированные лекарственные формы, пригодные для перорального введения, включают твердые лекарственные формы, такие как порошок, таблетки, пилюли, капсулы и драже, и жидкие лекарственные формы, такие как эликсиры, сиропы и суспензии. Активные ингредиенты могут также вводиться парентерально в стерильных жидких лекарственных формах. Желатиновые капсулы содержат активный ингредиент и в качестве неактивных ингредиентов носители в виде порошка, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, натриевая соль сахарина, тальк, карбонат магния и т.п. Примерами дополнительных неактивных ингредиентов, которые могут быть добавлены для получения желательного цвета, вкуса, стабильности, буферной емкости, дисперсии или других известных желательных признаков, являются красный оксид железа, силикагель, лаурилсульфат натрия, диоксид титана, пищевой белый краситель и т.п. Подобные наполнители могут быть использованы для получения прессованных таблеток. Как таблетки, так и капсулы можно производить как продукты с задержанным выходом для получения непрерывного выхода лекарственного вещества в течение нескольких часов. Прессованные таблетки могут иметь сахарную оболочку или оболочку из пленки, чтобы замаскировать какой-либо неприятный вкус и защитить таблетку от воздействия атмосферных условий, или энтеросолюбильную оболочку для избирательного разрушения в желудочно-кищечном тракте. Жидкие лекарственные формы для перорального применения могут содержать окрашивающий и придающий вкус и запах компонент для повышения привлекательности для пациента.

Концентрация композиций, соответствующих изобретению, в фармацевтических препаратах может широко варьировать, т.е. от менее чем приблизительно 0,1%, обычно около 2% или, по меньшей мере, приблизительно 2% до таких больших значений, как 20-50% или более по массе, и должна выбираться прежде всего по объемам жидкости, вязкости и т.п. в соответствии с определенным выбранным способом введения.

Композиции, соответствующие изобретению, могут также вводиться с помощью липосом. Липосомы включают эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, фосфолипидные дисперсии, ламеллярные слои и т.п. В данных препаратах предназначенную для доставки композицию, соответствующую изобретению, инкорпорируют в липосому как ее часть, в виде монокомпонента или в сочетании с молекулой, которая связывает желаемую мишень, такой как антитело, или с другими терапевтическими или имуногенными композициями. Таким образом, липосомы, либо наполненные, либо "декорированные" желаемой композицией, соответствующей изобретению, могут быть доставлены системно или могут быть направлены на ткань, представляющую интерес, в которую липосомы могут затем доставить выбранные терапевтические/ иммуногенные пептидные композиции.

Липосомы для использования в изобретении формируют из стандартных образующих пузырек липидов, которые в основном включают нейтральные и отрицательно заряженные фосфолипиды и стерол, такой как холестерин. При выборе липидов в основном руководствуются соображениями относительно, например, размера липосом, кислотной лабильности и стабильности липосом в кровотоке. Существует ряд способов приготовления липосом, описанных, например, в статье Szoka и соавт. , Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980), и патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369, включенных в данный контекст в виде ссылки.

Суспензия липосом, содержащая композицию, соответствующую изобретению, может быть введена внутривенно, местно, наружно и т.п. в дозе, которая изменяется в соответствии inter alia со способом введения, доставляемой композицией, соответствующей изобретению, и стадией заболевания, которое лечат.

Для твердых композиций могут быть использованы традиционные нетоксичные твердые носители, которые включают, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, натриевую соль сахарина, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.п. фармацевтического качества. Для перорального введения фармацевтически приемлемую нетоксичную композицию получают путем включения каких-либо обычно используемых наполнителей, таких как вышеперечисленные носители, и в основном 10-95% активного ингредиента, как в одной или более композиций, соответствующих изобретению, и более предпочтительно в концентрации 25-75%.

Для аэрозольного введения композиции, соответствующие изобретению, предпочтительно применяют в мелко измельченной форме вместе с поверхностно-активным веществом и газом-вытеснителем (пропеллантом). Типичным процентным содержанием композиций, соответствующих изобретению, является 0,01-20% по массе, предпочтительно 1-10%. Поверхностно-активное вещество должно быть, конечно, нетоксичным и растворимым в пропелланте. Представителями таких агентов являются сложные эфиры или частичные сложные эфиры жирных кислот, содержащих от 6 до 22 атомов углерода, такие как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая, олеостеариновая и олеиновая кислоты с алифатическим многоатомным спиртом или его циклическим ангидридом. Могут быть использованы смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-20% от массы композиции, предпочтительно 0,25-5%. Баланс композиции обычно обеспечивает пропеллант. Возможно также включение носителя, если это желательно, как, например, при использовании лецитина для интраназальной доставки.

Конструкции, соответствующие изобретению, могут дополнительно доставляться в системе депо-типа, инкапсулированной форме или в имплантате известными в уровне техники способами. Аналогично конструкции могут быть доставлены с помощью насоса в представляющую интерес ткань.

Любой из вышеописанных составов может подходить для способов лечения и терапевтических средств, соответствующих данному изобретению, при условии, что активный агент в составе композиции не инактивируется составом и состав является физиологически совместимым.

Следующие примеры представлены для иллюстрации некоторых аспектов данного изобретения и не предназначаются для ограничения его объема.

Экспериментальные примеры I. Введение.

Фиброз легких представляет собой обычное нарушение, которое, как полагают, обусловлено деструктивными действиями продуктов, выделяемых лейкоцитами. Хотя респираторный эпителий повреждается при развитии фиброза, ранее не показано, что сами эпителиальные клетки участвуют в данном процессе. Мы исследуем эффекты блеомицина, лекарства, которое, как известно, вызывает фиброз легких, на мышах, экспрессирующих нулевую мутацию одного гена субъединицы интегрина (β6), который полностью ограничен эпителиальными клетками. Мыши β6-/- со всей очевидностью защищены от индуцированного блеомицином фиброза. Терапевтические средства с направленностью на этот интегрин могут, следовательно, обеспечить новые подходы к лечению данного в большинстве случаев неизлечимого нарушения.

Интегрин αvβ6 экспрессируется исключительно на эпителиальных клетках в основном во время органогенеза и в ответ на повреждения. Мыши β6-/- проявляют повышенные воспалительные реакции на повреждения кожи и дыхательных путей, но нормально развиваются и размножаются (см. статью Huang X.Z. и соавт. , J. Cell Biol., 133:921-925, 1996).

II. Инактивация гена субъединицы интегрина β6 защищает мышей от индуцированного блеомицином фиброза легких.

Легочную токсичность блеомицина (0,03 единицы (u) в 60 мкл физиологического раствора) или физиологического раствора-носителя (60 мкл), введенного путем внутритрахеальной инъекции, исследуют у соответствующих по возрасту и полу мышей дикого типа (β6+/+) и мышей β6-/- линии 129SVEMS/ter. Фиброз легких оценивают через 15, 30 и 60 дней после лечения посредством исследования морфологии легких и измерения содержания гидроксипролина, показателя отложения коллагена. Фиброз является значительным у леченных блеомицином мышей дикого типа к 30-му дню и развивается к 60-му дню (фиг. 1.1 и 1.2). Напротив, у мышей β6-/- морфология легких остается почти нормальной в течение эксперимента с лишь небольшими участками фиброза, а содержание гидроксипролина в легких существенно не отличается от определенного у леченных физиологическим раствором животных в любой точке времени. Данный факт не является уникальным для мышей линии 129, поскольку аналогичные результаты получают для потомства, полученного при перекрестном скрещивании линий 129 и С57В1/6. Данные неожиданные результаты указывают на то, что экспрессия интегрина αvβ6 является необходимой для индукции фиброза легких.

Для определения роли αvβ6 на ранних стадиях индуцированного блеомицином фиброза измеряют содержание воды в легких, как показателя легочного отека, обусловленного повышенной проницаемостью сосудов, на 1, 5 и 15 дни после введения блеомицина или физиологического раствора. У мышей дикого типа содержание воды в легких максимально повышается на 5-й день и остается повышенным до 15-го дня после введения блеомицина (фиг. 2). Относительно фиброза легких мыши β6-/- в значительной степени защищены от данного раннего эффекта блеомицина, что указывает на роль эпителиального αvβ6 в развитии индуцированного блеомицином истечения из сосудов.

Ранее нами показано, что мыши β6-/- демонстрируют повышенные воспалительные реакции мононуклеарных клеток в коже и дыхательных путях (см. статью Huang X. Z. и соавт. , J. Cell Biol., 133:921-928, 1996). Индуцированные блеомицином повреждение легких и фиброз легких ассоциированы и могут зависеть от рекрутинга и активации лимфоцитов (см. статью Schrier D.J. и соавт., Am. J. Pathol. , 116:270-278, 1984). Для определения, является ли устойчивость мышей β6-/- к индуцированным блеомицином повреждениям и фиброзу обусловленной рекрутингом или активацией лимфоцитов, подсчитывают лимфоциты CD4+ и CD8+ и оценивают активацию лимфоцитов путем измерения экспрессии рецептора интерлейкина-2 (CD25) в клетках, полученных из измельченных легких мышей, леченных физиологическим раствором или блеомицином на 5- и 15-й дни после лечения. В легких мышей β6-/- имеется больше клеток CD4+, CD8+ и CD25+, чем у животных дикого типа, что согласуется с нашим предшествующим сообщением. Блеомицин индуцирует значительное повышение числа лимфоцитов, экспрессирующих CD4 и CD8, и заметное повышение процента лимфоцитов, экспрессирующих CD25 (фиг. 3), у мышей как дикого типа, так и β6-/-. У мышей как дикого типа, так и β6-/- рекрутинг и активация легочных лимфоцитов имеет максимум через 5 дней после введения блеомицина и начинает снижаться через 15 дней. Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, данные результаты допускают, что маловероятным является то, что недостаточные рекрутинг и активация лимфоцитов у мышей β6-/- представляют собой основу их защиты от эффектов блеомицина в плане повреждения легких.

Взаимодействие интегринов с их лигандами матрикса модулирует ряд важных функций клетки, включая пролиферацию (см. статью Agrez M. и соавт., J. Cell Biol., 127:547-556, 1994), жизнеспособность (см. статью Lukacs N.W. и соавт. , Eur. J. Immunol. , 25:245-251, 1995) и экспрессию цитокинов (см. статью Miyake S. и соавт., J. Exp. Med., 177:863-868, 1993) и металлопротеиназ (см. статью Werb Z. и соавт., J. Cell Biol., 109:877-889, 1989). Для β6-субъединицы описано только то, что она образует единственный гетеродимер интегрина, αvβ6 и ограничена эпителиальными клетками. Параллельно с быстрой индукцией экспрессии αvβ6 после повреждения эпителия повышаются локальные концентрации, по меньшей мере, двух лигандов интегрина (фибронектина и тенасцина). Ранее мы показывали, что экспрессия αvβ6 играет роль в терминации воспалительных реакций мононуклеарных клеток в коже и проводящих дыхательных путях легких (см. статью Huang X.Z. и соавт., J. Cell Biol., 133:921-928, 1996). Опубликованные результаты показывают, что интегрин также играет критическую роль в индукции повреждения легких и фиброза легких в реакции на блеомицин.

Клетки респираторного эпителия давно считают главным образом компонентами пассивного барьера, отделяющего другие клетки легких от потенциально токсичных компонентов вдыхаемого воздуха. Однако, на этой поверхности данные клетки подходящим образом расположены для инициации и модуляции локальных реакций на повреждение. На основании недавно полученных результатов предполагают, что клетки респираторного эпителия обладают способностью синтезировать и секретировать ряд белков, которые могут инициировать и модулировать реакции на повреждение, включая хемокины (например, интерлейкин-8, GROα GROλ, RANTES, GMCSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, ГМ-КСФ), МIР-1α (белок торможения миграции-1α) и МСР-1 (белок цитотоксичности макрофагов-1), другие цитокины (например, ИЛ-6 (интерлейкин-6), ИЛ-11 и ИЛ-15) и факторы роста (например, TGFβ (трансформирующий фактор роста-β). Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, одним из возможных механизмов, с помощью которого эпителиальный αvβ6 может участвовать в развитии повреждения легких и фиброза легких, является модуляция экспрессии одного или более данных белков.

Современные способы терапии фиброза легких являются в значительной мере неадекватными. Результаты данного исследования показывают, что клетки респираторного эпителия и эпителиальный интегрин αvβ6 играют важные роли в патогенезе повреждения паренхимы легких и фиброза легких и что способы терапии, специально разработанные для нарушения функции интегрина, применимы при лечении данных в большинстве случаев неизлечимых заболеваний легких.

III. Получение блокирующего антитела.

А. Получение моноклонального антитела.

Для получения антител против αvβ6 мышей β6-/- иммунизируют либо кератиноцитами, полученными от мышей дикого типа, либо рекомбинантным секретируемым человеческим αvβ6 (см. статью Weinacker и соавт., J. Biol. Chem., 269:6940-6948, 1994) в адъюванте Фрейнда. Мышиные спленоциты собирают и сливают с клетками мышиной миеломы SP2/0 в соответствии со стандартными процедурами. Трансфицированные β6 и псевдотрансфицированные клетки SW480 используют для скрининга полученного супернатанта с помощью проточной цитометрии. Антитела, которые, как показано, распознают β6-трансфицированные, но не псевдотрансфицированные клетки SW480, используют в последующих экспериментах.

В. Характеризация моноклональных антител.

Для создания антител против мышиного αvβ6 в качестве иммуногенов используют секретируемый человеческий αvβ6 и мышиные кератиноциты на мышах β6-/- на основе 129/С57. Проводят скрининг полученных супернатантов гибридом на дифференцированное окрашивание псевдо- и β6-трансфицированных клеток SW480. Полученные в результате антитела CSβ6 и 10D5 окрашивают как β6 человека, экспрессирующийся на клетках SW480, так и β6 мыши на кератиноцитах дикого типа. CSβ6 далее характеризуют по иммунопреципитации лизата (³⁵S)-меченных мышиных кератиноцитов. Данное антитело преципитирует гетеродимеры соответствующей молекулярной массы, являющиеся αvβ6, отделяя их от β6+/+ - кератиноцитов, но не от β6-/- -кератиноцитов, указывая на то, что данные антитела являются специфическими в отношении интегрина αvβ6.
Как Csβ6, так и 10D5 анализируют также на блокирующую активность посредством проведения анализов клеточной адгезии с β6-трансфицированными клетками SW480 и мышиными кератиноцитами на фибронектине. Однако только 10D5 проявляет блокирующую активность на мышиных клетках. 10D5 ингибирует миграцию кератиноцитов дикого типа на фибронектине до степени, идентичной показанной на β6-/- -кератиноцитах.

С. Анализ клеточной адгезии.

Обработанные полистиролом многолуночные планшеты для микротитрования не для культур ткани на 96 лунок (Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA) покрывают витронектином, фибронектином или коллагеном. 100 мкл раствора, содержащего различные количества матрикса, вносят в лунки и инкубируют при 37^oС в течение 1 часа. После инкубирования лунки промывают PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором), затем блокируют 1% BSA (бычьим сывороточным альбумином) в бессывороточной DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) при 37^oС в течение 30 минут. Контрольные лунки заполняют 1% BSA в DMEM. Клетки собирают таким же образом, как для анализа миграции, и ресуспендируют в бессывороточной КGМ, а затем добавляют в каждую покрытую белком лунку в присутствии или в отсутствие РМА (форболмиристатацетат, ФМА). Для экспериментов по блокированию клетки инкубируют с антителами в течение 5 минут при 4^oС перед помещением в лунки. Планшеты центрифугируют (в положении верхней стороной наверх) при 10 х g в течение 5 минут перед инкубированием, в течение 1 часа при 34^oС во влажной атмосфере с содержанием 7% CO₂. Неадгезионные клетки удаляют центрифугированием в положении верхней стороной вниз при 48 х g в течение 5 минут. Связанные клетки фиксируют 1% формальдегидом и окрашивают 0,5% кристаллическим фиолетовым, после чего лунки промывают PBS. Относительное число клеток в каждой лунке оценивают, измеряя поглощение при 595 нм в ридере для микропланшетов (Bio-Rad).

D. Анализ миграции.

Анализы миграции клеток проводят с использованием покрытых матриксом планшетов с сообщающимися лунками (поры 8 мкм, Costar, Cambridge, MA). Внутреннюю поверхность мембраны покрывают коллагеном (10 мкг/мл), фибронектином (10 мкг/мл) или витронектином (10 мкг/мл) в PBS в течение 1 часа при 37^oС и блокируют с помощью 1% BSA. Сначала культивируемые кератиноциты собирают с помощью трипсина/EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и инактивируют трипсин ингибитором трипсина сои. Клетки суспендируют в бессывороточной КGМ и помещают в верхнюю камеру при густоте 3,6•10⁴/лунку в 100 мкл среды в присутствии или в отсутствие форболмиристатацетата (РМА, 10 нг/мл). В экспериментах по ингибированию антитела добавляют в верхнюю и нижнюю камеры в присутствии РМА. Через 6 часов инкубирования клетки фиксируют 2% параформальдегидом и окрашивают 0,5% кристаллическим фиолетовым в 1% формальдегиде. Клетки из верхней камеры удаляют и клетки на нижней поверхности подсчитывают с использованием сетки 10х при сильном увеличении (40х). Просчитывают множество полей зрения и усредняют данные для каждого исследованного условия.

IV. β6-нокаутированные мыши имеют пониженную частоту метастазов.

Линию трансгенных мышей, у которых спонтанно развивается метастазирующий рак молочной железы (мыши MMTV-mTAg), перекрестно скрещивают в β6-нокаутированными мышами. У потомства мышей с отсутствием β6 развиваются быстрорастущие первичные опухоли молочной железы при значительно сниженных частоте и степени развития метастазов в легких по сравнению с однопометными животными, которые экспрессируют β6. Данные иммуногистохимии показывают, что β6 сильно экспрессируется на границе метастатических поражений. Это предполагает, что β6 требуется для максимального метастазирования на данной модели.

Поскольку β6-нокаутированные мыши имеют хроническое воспаление легких, возможно, что снижение метастазирования обусловлено присутствием воспаления в легких, которое нарушает рост метастазов. Для подтверждения данного тезиса проводят два эксперимента.

1. Линию β6-экспрессирующих клеток, выделенную из первичной опухоли, инъецируют сингенным мышам, которые либо являются диким типом, либо β6-нокаутированными. Метастазы в легких быстро появляются у мышей обеих групп, что предполагает, что присутствие воспаления у нокаутированных мышей не нарушает роста опухолевых клеток в легком.

2. Клеточные линии, выделенные из опухолей либо β6-нокаутированных мышей, либо мышей дикого типа, инъецируют сингенным мышам дикого типа. Линии клеток дикого типа неизменно приводят к появлению опухолей легких, тогда как линии нокаутированных клеток не приводят. Результаты данного эксперимента предполагают, что опухолевые клетки β6 требуются для максимального метастазирования в данной системе.

Все ссылки (включая книги, статьи, тезисы, патенты и патентные заявки), приведенные в данном контексте, таким образом, специально включены в виде ссылок во всей их полноте для всех целей.

Поскольку изобретение описано в связи с его специфическими вариантами осуществления, будет понятно, что оно может быть далее модифицировано и данная заявка предназначена для того, чтобы охватить любые варианты, способы применения или адаптации изобретения, следуя в основном принципам изобретения и включая такие новые направления, отходящие от данного описания, как те, которые находятся в границах принятой практики в уровне техники, к которой относится изобретение, и как те, которые могут относиться к основным признакам, представленным в данном описании, и как те, которые входят в объем изобретения и рамки прилагаемой формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Способ лечения острого повреждения легких у пациента, отличающийся тем, что пациенту вводят терапевтическую дозу антитела, специфически связывающего αvβ6.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антитела используют моноклональное антитело.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело вводят терапевтически.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело вводят профилактически.

5. Способ лечения фиброза у пациента, отличающийся тем, что пациенту вводят терапевтическую дозу антитела, специфически связывающего αvβ6.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фиброз представлен фиброзом легких.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что фиброз легких является результатом острого повреждения легких.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антитела используют моноклональное антитело.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что антитело вводят терапевтически.

10. Способ по п.5, отличающийся тем, что антитело вводят профилактически.

11. Моноклональное антитело против β6 субъединицы интегрина αvβ6, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 12382.

12. Культура гибридомы АТСС НВ 12382 - продуцент моноклонального антитела против β6 субъединицы интегрина αvβ6.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3