Очищенная днк-полимераза, рекомбинантная днк-полимераза, способы их получения, выделенная последовательность днк и набор для полимеразной цепной реакции

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается модифицированной ДНК-полимеразы. Заявлена очищенная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5'-3'-экзонуклеазы, по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и получаемая из Carboxydothermus hydrogenoformans. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности приведены в описании. Термофильная ДНК-полимераза входит в набор для проведения ПЦР с обратной транскрипцией РНК. Изобретение позволяет получить обратную транскриптазу, действующую при высоких температурах и обеспечивающую продуцирование кДНК без делеций. 6 с. и 4 з.п.ф-лы, 7 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)

Формула изобретения

1. Очищенная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием и по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и получаемая из Carboxydothermus hydrogenoformans, и где указанная полимераза имеет кажущуюся молекулярную массу между 64 и 71 кД, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID No: 11.

2. ДНК-полимераза по п.1, отличающаяся тем, что указанная ДНК-полимераза проявляет активность обратной транскриптазы при практическом отсутствии ионов марганца.

3. ДНК-полимераза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанная полимераза проявляет активность обратной транскриптазы, зависимую от марганца.

4. ДНК-полимераза по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что активность обратной транскриптазы, зависимая от магния, выше активности обратной транскриптазы указанной полимеразы, зависимой от марганца.

5. ДНК-полимераза по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанная полимераза обладает пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием, при этом последнюю получают из природной полимеразы, обладающей активностью 5’-3’-экзонуклеазы.

6. Рекомбинантная ДНК-полимераза, проявляющая активность обратной транскриптазы в присутствии ионов магния и/или ионов марганца, обладающая пониженной активностью 5’-3’-экзонуклеазы или ее отсутствием и по существу не обладающая активностью рибонуклеазы Н и где указанная полимераза имеет кажущуюся молекулярную массу между 64 и 71 кД, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID No: 11, где указанную полимеразу получают из штамма Е. coli, обозначенного как Е. coli GA 1.

7. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая ДНК-полимеразу по любому из пп.1-6, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 10.

8. Способ получения ДНК-полимеразы по любому из пп.1-5, включающий стадии (а) культивирования природного штамма Carboxydothermus hydrogenoformans; (b) суспендирования клеток природного штамма в буфере; (с) разрушения клеток; (d) очистки ДНК-полимеразы хроматографическими способами, включая использование одной или нескольких сефарозных колонок.

9. Способ получения ДНК-полимеразы по п.6, включающий культивирование рекомбинантного штамма Е. coli, трансформированного вектором, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 10, очистку и выделение ДНК-полимеразы.

10. Набор для осуществления полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией PHK (RT-PCR), где набор содержит термофильную ДНК-полимеразу по любому из пп.1-6 и другие традиционные дополнительные компоненты для осуществления RT-PCR.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56