Очищенная термостабильная днк-полимераза из thermococcus gorgonarius, ее получение и применение

 

Изобретение относится к области энзимологии и генной инженерии и обеспечивает получение нативной или рекомбинантной формы термостабильной ДНК-полимеразы, применяемой в диагностических и других исследованиях, основанных на ПЦР-амплификации нуклеиновых кислот. Из архебактерии Thermococcus gorgonarius выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, характеризующаяся способностью практически полностью сохранять активность в течение 2 ч инкубации при t=95^oС в присутствии стабилизатора и отличающаяся высокой точностью репликации. Выделена и охарактеризована последовательность ДНК, кодирующая новую ДНК-полимеразу. В результате экспрессии этой нуклеотидной последовательности в Е.coli получена рекомбинантная форма фермента. Показана возможность использования новой ДНК-полимеразы из Thermococcus gorgonarius в методах амплификации и/или секвенирования ДНК, при котором обеспечивается точность копирования, более чем вдвое превышающая этот показатель для любой из известных ДНК-полимераз. 8 с. и 3 з.п.ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)

Формула изобретения

1. Очищенная термостабильная ДНК-полимераза, получаемая из Тhermococcus gorgonarius, которая катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 3’-5’-экзонуклеазной (корректорной) активностью, сохраняет около 90% своей активности после инкубации в течение двух часов при температуре около 95°С в присутствии стабилизатора, имеет кажущуюся молекулярную массу около 92000-96000 дальтон и характеризуется, по крайней мере, в два раза более высокой точностью репликации, нежели ДНК-полимераза, получаемая из Pyrococcus furiosus.

2. ДНК-полимераза по п.1, отличающаяся тем, что указанным стабилизатором является неионный детергент.

3. ДНК-полимераза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что стабилизатором является Thesit и/или Nonident P40.

4. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3, которая имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6 и нуклеотидной последовательности, генетически выраженной по отношению к SEQ ID NO: 6.

5. Выделенная последовательность ДНК по п.4, отличающаяся тем, что имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.

6. Вектор для экспрессии термостабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gcrgonarius, представляющий собой плазмиду рВТас2, в которую встроена последовательность ДНК по п.4.

7. Рекомбинантный штамм Е. coli (LE392 pUBS520/pBtac2Tgo, депонированный под номером DSM №11328) - продуцент термсотабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius.

8. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий стадии культивирования природного штамма-продуцента, суспендирования и разрушения клеток, выделения и очистки фермента при помощи многостадийной хроматографической обработки надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Thermococcus gorgonarius, а хроматографическую обработку осуществляют путем пропускания надосадочной жидкости через колонку с гепарин-сефарозой С1 6В (Pharmacia) с последующим снятием фермента с колонки и дальнейшей его очистки путем последовательного пропускания через колонку с ДЭАЭ-сефацелем (Pharmacia) и колонку с фосфоцеллюлозой (Whatman).

9. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий культивирование рекомбинантного штамма по п.7, и очистку его ДНК-полимеразы.

10. Способ амплификации ДНК, предусматривающий добавление термостабильной ДНК-полимеразы к подлежащей амплификации матричной ДНК в присутствии двух специфичных к последовательности олигонуклеотидов и дНТФ, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.

11. Способ секвенирования ДНК, характеризующийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу добавляют к подлежащей cеквенированию матричной ДНК в присутствии дезоксинуклеотидов и дидезоксинуклеотидов и, по крайней мере, одного специфичного к последовательности олигонуклеотида, причем или дНТФ, или ддНТФ, или специфичный к последовательности олигонуклеотид является меченым, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.

Приоритет по пунктам: 03.10.96 по пп.1-11.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63