Молекула днк, кодирующая протопорфириноген-оксидазу растения, способ ее получения и способ получения растения (варианты)

 

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений. Введение в геном растения молекулы ДНК, кодирующей протопорфириноген-оксидазу, обеспечивает придание трансформируемому растению устойчивости к гербицидам. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 5 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)е

Формула изобретения

1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая протопорфириноген-оксидазу (протокс) растения, выбранная из группы, включающей фермент протокс сои с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11, фермент протокс хлопчатника с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:15, фермент протокс сахарной свеклы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:17, фермент протокс рапса с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:19, фермент протокс риса с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21, фермент протокс сорго с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, и фермент протокс пшеницы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:9.

2. Выделенная молекула ДНК по п.1, кодирующая протокс, нуклеотидная последовательность которого гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, представленных в SEQ ID NO:9, в SEQ ID NO:11, в SEQ ID NO:15, в SEQ ID NO:17, в SEQ ID NO:19, в SEQ ID NO:21 или в SEQ ID NO:23; или протокс, имеющий по крайней мере одну аминокислотную модификацию, которая происходит в положении, выбранном из группы, включающей (а) положение, соответствующее аланину в положении 164 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (б) положение, соответствующее глицину в положении 165 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (в) положение, соответствующее тирозину в положении 370 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (г) положение, соответствующее цистеину в положении 159 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (д) положение, соответствующее изолейцину в положении 419 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (е) положение, соответствующее валину в положении 356 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (ж) положение, соответствующее серину в положении 421 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (з) положение, соответствующее валину в положении 502 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (и) положение, соответствующее аланину в положении 211 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (к) положение, соответствующее глицину в положении 212 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (л) положение, соответствующее изолейцину в положении 466 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (м) положение, соответствующее пролину в положении 369 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (н) положение, соответствующее аланину в положении 226 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (о) положение, соответствующее тирозину в положении 432 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (п) положение, соответствующее валину в положении 517 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (р) положение, соответствующее тирозину в положении 428 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; (с) положение, соответствующее пролину в положении 365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и (т) положение, соответствующее тирозину в положении 449 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18; или протокс, имеющий две модификации, первая из которых происходит в указанном выше положении, а вторая происходит в положении, выбранном из группы, включающей: (I) положение, соответствующее серину в положении 305 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (II) положение, соответствующее треонину в положении 249 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (III) положение, соответствующее пролину в положении 118 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (IV) положение, соответствующее аспарагину в положении 425 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и (V) положение, соответствующее тирозину в положении 498 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

3. Способ получения трансгенного растения и потомства трансгенного родительского растения, включающий трансформацию родительского растения выделенными молекулами по пп.1 и 2 и необязательно передачу признака толерантности к гербицидам потомству трансгенного родительского растения с использованием известных методов селекции.

4. Способ получения выделенной молекулы ДНК по любому из пп.1 и 2, который включает (а) получение нуклеотидного зонда, обладающего способностью специфически гибридизоваться с геном или мРНК протокса растения, причем зонд включает область, соседнюю с кодирующей последовательностью протеина протокса растения, длиной по крайней мере 10 нуклеотидов; (б) зондирование других кодирующих последовательностей протокса в популяциях клонируемых фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК из выбранного организма с использованием нуклеотидного зонда, полученного согласно стадии (а), и (в) выделение и размножение молекулы ДНК, которая включает область ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью протопорфириноген-оксидазы (протокса).

5. Способ получения растений, тканей растений, семян растений и частей растений, которые продуцируют устойчивую к ингибиторам форму фермента протокса растения, заключающийся в том, что выделенными молекулами ДНК по пп.1 и 2 трансформируют клетки растения с последующим получением растений, тканей растений, семян растений и частей растений с помощью методов прямой селекции, при которых устойчивые к гербицидам линии выделяют, изучают свойства и размножают.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что выделенные молекулы по пп.1 и 2 получают следующим образом: (а) получают библиотеку геномной или кДНК из пригодного организма-источника с использованием приемлемого клонирующего вектора; (б₁) гибридизуют библиотеку с молекулой-зондом; (б₂) выявляют позитивные гибридизации зонда с клонами ДНК из библиотеки, которые представляют собой клоны, потенциально содержащие нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности протопорфириноген-оксидазы (протокса) или используют ДНК, полученную на стадии (а) в качестве матрицы для ПЦР с праймерами, представляющими собой маловырожденные части аминокислотной последовательности протопорфириноген-оксидазы (протокса).

Приоритет п.1 в части SEQ ID NOs:9-12 от 28.02.96, в части SEQ ID Nos:15-24 - от 27.02.97; п.2 в части признаков (а)-(д) и (1)-(V) от 28.02.96, в части признаков (е)-(т) - от 27.02.97; п.3 - от 28.02.96 или от 27.02.97 в соответствии с приоритетом пп.1 и 2; пп.4-6 - от 27.02.97.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150, Рисунок 151, Рисунок 152, Рисунок 153, Рисунок 154, Рисунок 155, Рисунок 156, Рисунок 157, Рисунок 158, Рисунок 159, Рисунок 160, Рисунок 161, Рисунок 162, Рисунок 163