Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-апк)

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) из ферментативно продуцированного N-замещенного пенициллина. Способ включает стадии экстракции N-замещенного пенициллинового производного, находящегося в ферментационном бульоне или жидкости, в органический растворитель, обратной экстракции N-замещенного пенициллинового соединения в воду, обработки водной фазы пенициллинацилазой и выделения 6-АПК кристаллизацией из полученного таким образом рабочего раствора. Способ также включает экстракцию продукта из боковой цепи в органический растворитель и выделение 6-АПК из полученной таким образом водной фазы с использованием кристаллизации. Использование заявленного способа позволяет получать 6-АПК без предварительного выделения N-замещенного пенициллина в кристаллической форме. 8 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение, в котором реализуется деацилирование у 6-амино-группы, относится к способу получения пенициллинов, ферментацией пенициллина, продуцированного микроорганизмом в присутствии предшественника боковых цепей, и деацилированием ферментативно продуцированного N-замещенного пенициллина.

6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является важным промежуточным продуктом в фармацевтической промышленности, который получают в общем случае путем химического или ферментативного расщепления ("деацилирование") пенициллина G или пенициллина V.

Сами пенициллины получают ферментацией, используя штаммы Penicillium chrysogenym. В стандартном способе выделения пенициллина G питательный бульон фильтруют и промывают, а пенициллин G экстрагируют бутилацетатом или метилизобутилкетоном после подкисления фильтрата. Затем растворитель обесцвечивают с помощью активированного угля, и пенициллин-G-кислоту подвергают обратной экстракции водой после нейтрализации водным раствором соли калия, такой как ацетат калия. Этот раствор смешивают с достаточным количеством бутанола, понижают содержание воды, используя выпаривание (отгонку) азеотропа бутанол-вода, после чего образующиеся кристаллы пенициллина G выделяют фильтрацией с последующим промыванием и высушиванием.

В другом процессе кристаллический материал получают непосредственно из органического раствора путем добавления ацетата калия и выпаривания (отгонки) азеотропа, после чего кристаллы отфильтровывают, промывают бутанолом, отфильтровывают и сушат. Тот же самый процесс приемлем и для пенициллина V. Однако благодаря большей стабильности пенициллина V в кислой среде пенициллин V может быть также кристаллизован в форме кислоты, а не в форме калиевой соли, без потерь, неприемлемых в экономическом отношении.

В общем случае 6-аминопенициллановую кислоту получают из раствора, в котором растворен твердый пенициллин G или V и который затем обрабатывают иммобилизованной пенициллин-G-ацилазой или пенициллин-V-ацилазой соответственно. Далее конверсионный раствор подают в кристаллизатор, где и образуется твердый продукт путем осаждения при рН примерно от 3,5 до 4,5. Обычно в этом процессе кристаллизации понижают величину рН ступенчато для того, чтобы избежать загрязнения конечного продукта 6-АПК соединениями с высоким уровнем содержания предшественников боковой цепи и окрашенными соединениями. Для того, чтобы избежать этого неприемлемого загрязнения, добавляют далее такие растворители как метанол, этанол и изопропиловый спирт. Очевидно, что эти пути производства 6-АПК являются длительными и дорогостоящими.

Настоящее изобретение раскрывает улучшенный способ производства 6-АПК, который не требует выделения пенициллина G или V в виде твердого промежуточного продукта и в котором становятся ненужными операции для коррекции цвета.

Описание изобретения Настоящее изобретение раскрывает улучшенный способ производства 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) из ферментационного бульона пенициллин-продуцирующего микроорганизма.

В общем случае принципиально новый способ производства и очистки включает в себя следующие стадии: пенициллин-продуцирующий микроорганизм вводят в ферментацию в присутствии подходящего предшественника боковой цепи. Ферментационный бульон фильтруют, после чего фильтрат экстрагируют органическим растворителем для получения органической фазы, содержащей основную часть N-замещенной пенициллановой кислоты. Далее N-замещенную пенициллановую кислоту подвергают обратной экстракции водой. Водную фазу необязательно освобождают от легких компонентов, удаляя следы растворителя. Остальную водную фазу раствора обрабатывают ферментом, получая 6-АПК и боковую цепь, как, например, фенокси- или фенилуксусную кислоту.

Далее 6-АПК осаждают из водного конверсионного раствора после подкисления этого раствора и выделяют в виде кристаллического продукта. Однако более предпочтительный пример настоящего изобретения включает в себя подкисление конверсионного раствора и последующую экстракцию боковой цепи органическим растворителем до осаждения 6-АПК из водной фазы путем смещения значения рН.

В способе согласно настоящему изобретению более детально описаны следующие стадии.

Ферментационный бульон, содержащий N-замещенный пенициллин, получают из любого ферментационного процесса, например при ферментации штамма Penicillium chrysogenum в присутствии подходящего предшественника боковой цепи, такого как фенилуксусная или феноксиуксусная кислота.

Биомассу отделяют от ферментационного бульона, используя любую подходящую технологию, такую как фильтрация, получая содержащую пенициллин ферментационную жидкость. Предпочтительно, чтобы для достижения указанного разделения использовалась стадия фильтрации. Твердые остатки необязательно промывают.

Ферментационный бульон или жидкость подкисляют до значений рН от 2-4, предпочтительно до 2,5-3, добавлением кислоты, такой как серная кислота, соляная кислота или азотная кислота, или их комбинации. Затем отделяют N-замещенный пенициллин от подкисленной водной фазы экстракцией в органическом растворителе. Предпочтительно используемым органическим растворителем является амилацетат, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, циклогексанон, изобутанол или н-бутанол. Экстракцию можно существенно улучшить добавлением подходящего деэмульгатора.

В одном из примеров настоящего изобретения часть органического растворителя можно прибавить к ферментационному бульону или жидкости до подкисления. Показано, что было бы полезно исключить из процесса осадитель, в ряде случаев указанное осаждение протекает как нежелательный побочный эффект подкисления ферментационного бульона или жидкости. Осаждение является нежелательным, так как может привести к потере продукта и вызвать дальнейшие операционные трудности.

На следующей стадии N-замещенный пенициллин, находящийся в органическом растворителе, подвергают обратной экстракции водой при рН 6-10, предпочтительно при рН 7-9. Основанием, используемым для регулирования величины рН, может быть аммиак или раствор гидроксида щелочного или щелочноземельного металла.

После разделения фаз водную фазу освобождают от легких компонентов, удаляя органический растворитель, что необязательно.

Далее водную фазу или раствор обрабатывают подходящей пенициллинацилазой.

Организмы, которые, как было найдено, продуцируют пенициллинацилазу, являются, например, разновидностями Acetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Aphanocladium, Bacillus s.p., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Providentia, Pseudomonas или Xanthomonas. Ферменты, полученные из Acetobacter pasteurioanum, Alcaligenes faecalis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Providentia rettgeri и Xanthomonas citrii, были испытаны и оказались особенно успешными в способе, соответствующем настоящему изобретению. В литературе пенициллинацилазы обозначаются также как пенициллинамидазы.

Пенициллинацилаза может использоваться в виде свободного фермента, например, как это было описано в Европейском патенте 0222462 и Международной заявке на патент 97/04086.

В настоящем изобретении главным образом показано, что можно осуществить ферментативное превращение ферментативно продуцированного соединения N-замещенного пенициллина, такого как пенициллин G, в 6-АПК без необходимости предварительного выделения соединения N-замещенного пенициллина в кристаллической форме.

Настоящим изобретением также предусмотрена стадия непосредственной обработки ферментационной жидкости пенициллин-ацилазой, то есть без использования стадии предварительной экстракции и стадии обратной экстракции.

Обрабатываемый раствор, полученный ферментативной реакцией, указанной выше, содержит 6-АПК, боковую цепь, такую как фенил- или феноксиуксусная кислота, окрашенные продукты и следы неконвертированного продукта.

В одном из примеров настоящего изобретения продукт 6-АПК выделяют из обрабатываемого раствора кристаллизацией в кислой среде. Как правило, кристаллизация 6-АПК из водного раствора 6-АПК осуществляется посредством изменения величины рН до величины, соответствующей кислой среде, прибавлением титрованного раствора к раствору 6-АПК до тех пор, пока значение рН не достигнет значений 2,5-4,5, предпочтительно 3-4.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения кристаллизация 6-АПК из водного раствора осуществляется добавлением раствора 6-АПК в емкость для кристаллизации, в которой поддерживают фиксированное значение рН в области 2,5-5, используя подходящий титрованный раствор.

В еще более предпочтительном аспекте настоящего изобретения описанная кристаллизация осуществляется постадийным изменением величины рН раствора 6-АПК до конечных значений в области 2,5-4,5 добавлением раствора 6-АПК к ряду связанных между собой емкостей для кристаллизации, то есть добавлением раствора 6-АПК в первую емкость с одновременным добавлением содержимого первой емкости во вторую емкость и с одновременным добавлением содержимого второй емкости в третью емкость и т.д., причем в связанных между собой емкостях область значений рН поддерживается с применением подходящего титрованного раствора, начиная от величины рН в первой емкости, которая отличается примерно на 0,5-2 единицы от величины рН раствора 6-АПК, и кончая величиной рН в последней емкости, значение которой заключено в интервале 2,5-4,5. Удобно, чтобы величина рН водного раствора 6-АПК регулировалась в соответствии с нужным значением с использованием серии из 2-6 связанных между собой емкостей.

Например, для того, чтобы осуществить кристаллизацию 6-АПК из конверсионного раствора, можно применить понижение значений рН от 8 до 3 с использованием титрованного раствора кислоты, которая является такой кислотой как серная кислота, соляная кислота и/или азотная кислота, применяя серию из 3-4 кристаллизационных емкостей.

Для двух предпочтительных аспектов, описанных выше, предпочтительна их реализация в виде непрерывного процесса.

В следующем предпочтительном аспекте настоящего изобретения боковую цепь в виде фенила или феноксиуксусной кислоты удаляют до кристаллизации 6-АПК экстракцией органическим растворителем. Конверсионный раствор подкисляют и затем экстрагируют органическим растворителем, например амилацетатом, бутилацетатом, этилацетатом, метилизобутилкетоном, циклогексаноном, изобутанолом или н-бутанолом. Подкисление конверсионного раствора осуществляется кислотой, такой как серная кислота, соляная кислота или азотная кислота, или их сочетанием, предпочтительно серной кислотой, до величины рН < 3, предпочтительно < 2. Неожиданно было найдено, что в процессе этой стадии экстракции была достигнута также высокая эффективность удаления окрашенных примесей.

В одном из аспектов настоящего изобретения экстракцию органическим растворителем осуществляют в процессе, состоящем из нескольких стадий (от двух до четырех стадий) экстракции с интенсивным перемешиванием, например, при использовании комбинации высокоэффективного смесителя, например высокоинтенсивного ножничного смесителя (high shear mixer), с разделением центрифугированием, причем указанные стадии предпочтительно проводятся во встречном циркуляционном режиме.

Органический растворитель, содержащий фенил- или феноксиуксусную кислоту и окрашенные соединения, может содержать небольшие количества 6-АПК. Указанная 6-АПК необязательно может быть подвергнута обратной экстракции водой, предпочтительно в две-четыре стадии, во встречном циркуляционном режиме. Воду, используемую для этой обратной экстракции, подкисляют до значений рН < 6, предпочтительно < 3. Предпочтительное отношение воды к растворителю составляет 1: 5, более предпочтительное -1:20, самое предпочтительное -1:10. Полученная таким образом водная фаза может быть подана на кристаллизацию 6-АПК или возвращена для экстракции боковой цепи.

После экстракции боковой цепи органическим растворителем продукт 6-АПК может быть кристаллизован из водной фазы несколькими путями, такими, как указанные выше для кристаллизации 6-АПК из водного раствора.

В предпочтительном режиме этой операции рН водной фазы увеличивают от значений в интервале от 2,5 до 5, предпочтительно от 3,5 до 4,5, посредством одностадийного добавления раствора 6-АПК в кристаллизационную емкость, в которой поддерживается требуемая величина рН, или в систему из 2-6 связанных между собой кристаллизационных емкостей с нарастающими значениями рН. Удобно проводить эти операции в непрерывном режиме.

При использовании этого аспекта согласно изобретению количество боковой цепи, например, фенил- или феноксиуксусной кислоты и окрашенных соединений, присутствующих в кристаллах 6-АПК, является низким по сравнению с обычными способами, в которых не экстрагируется боковая цепь и осуществляется периодический режим кристаллизации из нейтрального раствора.

Все вышеупомянутые стадии, то есть экстракция, обратная экстракция и кристаллизация, могут осуществляться в периодическом режиме или в периодическом режиме загрузки с подпиткой, но предпочтительным способом является непрерывный, что вызвано причинами, связанными со стабильностью процесса.

Полученные кристаллы 6-АПК выделяют фильтрованием или центрифугированием и высушивают в обычной сушилке непрерывного действия или в сушилке периодического действия.

Формула изобретения

1. Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) из ферментативно продуцированного микроорганизмом N-замещенного пенициллина, отличающийся тем, что из полученного ферментационного бульона или жидкости экстрагируют N-замещенное пенициллиновое соединение органическим растворителем, полученную органическую фазу подвергают обратной экстракции водой для выделения N-замещенного пенициллинового соединения, полученную водную фазу обрабатывают пенициллинацилазой для образования конверсионного раствора с получением 6-АПК и отщепленной боковой цепи и выделяют 6-АПК путем кристаллизации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после обработки пенициллинацилазой образующуюся боковую цепь экстрагируют из конверсионного раствора органическим растворителем перед стадией выделения 6-АПК.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что конверсионный раствор перед экстракцией подкисляют до значения рН ниже 3.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что кристаллизацию 6-АПК осуществляют из конверсионного раствора или водной фазы путем внесения раствора 6-АПК в кристаллизационную емкость, в которой поддерживается фиксированное значение рН в интервале 2,5-4,5 с использованием титрованного раствора.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что кристаллизацию 6-АПК осуществляют в серии связанных между собой кристаллизационных емкостей, поддерживая с помощью подходящего титрованного раствора интервал значений рН, начиная со значения рН в первой емкости, которое отклоняется примерно на 0,5-2 единицы от значения рН подаваемого на кристаллизацию раствора 6-АПК, и кончая значением рН в последней емкости в интервале 2,5-4,5.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ферментационный бульон или жидкость перед экстракцией подкисляют до значений рН 2-4, предпочтительно 2,5-3.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что часть органического растворителя добавляют к ферментационному бульону или жидкости до их подкисления.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что перед обработкой пенициллинацилазой из водной фазы удаляют следы растворителя.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют амилацетат, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, циклогексанон, изобутанол или н-бутанол.