Антитромботическое средство и гуманизированное моноклональное антитело против фактора фон виллебранда

 

Изобретение относится к медицине. Заявлены антитромбозные агенты, содержащие гуманизированные антитела, продуцируемые гибридомой AJvW-2, которые связывают фактор фон Виллебранда и которые могут применяться для лечения тромботических заболеваний, а также способ их получения. Изобретение позволяет использовать усовершенствованные формы гуманизированных иммуноглобулинов, которые не являются иммуногенными для человека. 6 с. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Гуманизированные моноклональные антитела против человеческого фактора фон Виллебранда, клетки, продуцирующие эти антитела, и антитромботические средства, содержащие упомянутые выше антитела в качестве активного ингредиента.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Если в результате повреждения обнажается субэндотелиальная ткань, тромбоциты, циркулирующие в кровотоке, немедленно прилипают к субэндотелию. Это приводит к запуску ряда процессов, участвующих в активации тромбоцитов, включая агрегацию тромбоцитов и высвобождение внутриклеточных гранул, после чего образуется тромб и кровотечение останавливается. Образование тромбов необходимо для обеспечения физиологического гемостатического механизма. Однако тромб может вызывать ряд тромботических заболеваний, таких как инфаркт миокарда, грудная жаба, инфаркт головного мозга и тромбоз головного мозга.

Для лечения тромботических заболеваний было разработано много антитромботических средств. Однако многие традиционные антитромботические средства в клинических условиях обладают низкой эффективностью и низкой специфичностью к тромбу, вызывая в качестве побочного эффекта кровотечение.

Важным белком плазмы крови, который функционирует на ранней стадии образования тромба, является фактор фон Виллебранда (ФфВ). Геморрагические повреждения, связанные с наличием количественных и качественных изменений в ФфВ, являются показателями болезни фон Виллебранда (БфВ). Известно несколько антител против ФВ: NMC-4, описанные Fujimura et al., J. Nara Med. Assoc., vol. 36, 662 (1985); RFF-VIIIRAG:1, описанные Tuddenham et al., Blood, vol. 177, no.1, 113 (1992), и моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 и AJvW-4, описанные Nagano et al., PCT/JP95/02435 (включенных сюда в качестве ссылки).

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам на основе антител, продуцируемых гибридомой AJvW-2. Это мышиное моноклональное антитело является эффективным ингибитором физиологической активности ФфВ и может применяться для лечения тромботических заболеваний. К сожалению, применение мышиных моноклональных антител, таких как полученные из AJvW-2, имеет некоторые недостатки при лечении человека, особенно при повторных терапевтических курсах. Кроме того, мышиные антитела имеют тенденцию к короткому периоду полужизни у людей и утрачивают важные функциональные характеристики иммуноглобулинов при использовании у людей. Более важным является то, что мышиные моноклональные антитела содержат существенные аминокислотные последовательности, которые при введении человеку являются иммуногенными. Многочисленные исследования показали, что после инъекции чужеродных антигенов иммунный ответ, вызванный введением пациенту антител, может быть весьма сильным, сводящим на нет терапевтический эффект антител после начального лечения. Более того, если мышиные или другие антигенные (по отношению к человеку) моноклональные антитела используют для лечения болезней человека, то последующие обработки неродственными мышиными антителами могут быть неэффективными или даже опасными из-за неблагоприятных эффектов.

Хотя было показано, что получение так называемых химерных антител (например, мышиных вариабельных областей, соединенных с человеческими константными областями) является довольно успешным, иммуногенность остается значительной проблемой (см., LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224 (1989); М. N. Saleh et al., Human Antibod. Hybridomas e: 19 (1992)).

Как правило, получение человеческих иммуноглобулинов, взаимодействующих с высоким сродством с фактором фон Виллебранда, с помощью традиционных методов получения человеческих моноклональных антител является предельно сложным. Таким образом, существует потребность в усовершенствованных формах гуманизированных иммуноглобулинов, специфичных к фактору фон Виллебранда, которые по существу являются не иммуногенными для человека, которые, кроме того, можно легко и экономично получать с помощью способа, подходящего для терапевтических композиций и других применений. Настоящее изобретение удовлетворяет эти и другие потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Целью данного изобретения является предоставление гуманизированных иммуноглобулинов, таких как моноклональные антитела против фактора фон Виллебранда, гуманизированные формы мышиного антитела AJvW-2, полинуклеотидных последовательностей, кодирующих эти иммуноглобулины; способа получения иммуноглобулинов; фармацевтических композиций, включающих эти иммуноглобулины в качестве активного ингредиента; лекарственного средства для лечения тромботических заболеваний, включающего антитело в качестве активного ингредиента; и способа лечения таких заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ На фиг. 1(A) представлена последовательность тяжелой цепи вариабельной области AJvW-2, SEQ ID NО:1.

На фиг. 1(B) представлена последовательность легкой цепи вариабельной области AJvW-2, SEQ ID NO:2.

На фиг. 2(A) представлена последовательность тяжелой цепи вариабельной области гуманизированного AJvW-2, SEQ ID NО:3.

На фиг. 2(B) представлена последовательность легкой цепи вариабельной области гуманизированного AJvW-2, SEQ ID NO:4.

На фиг. 3 представлен график характеристик конкурентного связывания мышиных и гуманизированных антител AJvW-2 (IgG4 и IgG2m3) с фактором фон Виллебранда.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В соответствии с настоящим изобретением предоставляются гуманизированные иммуноглобулины, специфично взаимодействующие с человеческим фактором фон Виллебранда. Эти иммуноглобулины, обладающие связывающим сродством к ФфВ, составляющим по меньшей мере приблизительно от 10⁷ М^-1 до 10¹⁰ М^-1, предпочтительно, от 10⁸ М^-1 до 10¹⁰ М^-1 или выше, являются способными, например, ингибирсвать связывание ФфВ с белком GPIb в присутствии ристоцетина или ботроцетина.

Настоящее изобретение предоставляет новые антитромботические композиции, содержащие гуманизированные иммуноглобулины, способные специфично связываться с ФфВ человека, и которые ингибируют RIPA (агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином), BIPA (агрегацию тромбоцитов, индуцированную ботроцетином) и SIPA (агрегацию тромбоцитов, индуцированную напряжением сдвига) реакции человеческих тромбоцитов.

Иммуноглобулины могут иметь две пары комплексов легкая цепь/тяжелая цепь, причем по меньшей мере одна цепь включает один или несколько мышиных гипервариабельных участков, функционально связанных с сегментами каркасных участков человека. Например, мышиные гипервариабельные участки, содержащие или не содержащие дополнительные природные мышиные аминокислотные остатки, могут быть введены в человеческие каркасные области для получения гуманизированных иммуноглобулинов, способных связывать антиген с уровнем сродства, превышающим приблизительно 10⁷ М^-1. Эти гуманизированные иммуноглобулины способны блокировать связывание CDR-предоставляющего мышиного моноклонального антитела с ФфВ (например, AJvW-2).

Иммуноглобулины настоящего изобретения, включая связывающие фрагменты и другие их производные, могут быть легко получены с помощью ряда методов рекомбинантных ДНК, с первичной экспрессией в трансфицированных клетках, предпочтительно в иммортализованных эукариотических клетках, таких как миеломные или гибридомные клетки. Полинуклеотиды, включающие первую последовательность, кодирующую каркасные участки гуманизированного иммуноглобулина, и второй набор последовательностей, кодирующий гипервариабельные участки целевого иммуноглобулина, могут быть получены синтетически или путем объединения соответствующих сегментов кДНК и геномной ДНК.

Гуманизированные иммуноглобулины могут использоваться по существу в чистом виде в тромболитической терапии, то есть удалении ранее образовавшейся закупорки сосудов фибрином. Они также используются для профилактики и лечения атеросклероза и повторного стеноза после вмешательства на сосудах. Они также используются для лечения пациента с риском тромботического заболевания или страдающего тромботическим заболеванием, таким как инсульт, преходящие приступы ишемии, нестабильная стенокардия, острый инфаркт миокарда, стенокардия, заболевание периферических сосудов, тромбоз глубоких вен и гемолитико-уремический синдром, включающий гемолитическую анемию, острую почечную недостаточность и тромбоцитопеническую тромбогемолитическую пурпуру. Они также используются для профилактики ишемических осложнений, вызванных острым и подострым тромбозом, или повторным стенозом, после эндоваскулярного вмешательства, такого как РТСА, реконструкция просвета (stent), атероэктомия, коронарное шунтирование, и для профилактики ишемических осложнений, вызванных повторной закупоркой после тромболитического лечения при остром инфаркте миокарда в качестве дополнительной терапии.

Гуманизированные иммуноглобулины или их комплексы могут быть получены в фармацевтически приемлемой дозированной форме, которая варьирует в зависимости от способа введения.

Гуманизированные иммуноглобулины имеют человеческую каркасную область и один или несколько гипервариабельных участков (CDR) из иммуноглобулина AJvW-2. Однако могут также использоваться CDR из других антител, которые конкурируют с AJvW-2, блокируют связывание ФфВ с GPIb белком в присутствии ристоцитина или ботроцетина и/или связываются с тем же эпитопом на ФфВ, что и AJvW-2. Иммуноглобулины могут производиться промышленно в больших количествах и находить применение, например, в лечении тромботических заболеваний у человека с помощью различных методик.

Известно, что основная структурная единица антитела включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую (приблизительно 50-70 кДа) цепь. Амино-концевой фрагмент каждой цепи включает вариабельную область, состоящую приблизительно из 100-110 или более аминокислот, в первую очередь, ответственных за распознавание антигена. Карбокси-концевой фрагмент каждой цепи определяет границы константной области, в основном ответственной за эффекторную функцию.

Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, соответственно изотип антитела определяют как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В легкой и тяжелой цепях вариабельная и константная области соединены посредством J участка, состоящего приблизительно из 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает D участок, состоящий приблизительно из 10 или более аминокислот (см. Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Chapter 7, pgs.131-166, Raven Press, N. Y. (1984), эта публикация включена в данном документе в качестве ссылки.

Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающий центр антитела. Все цепи демонстрируют одинаковую основную структуру из относительно консервативных каркасных участков, соединенных посредством трех гипервариабельных участков или CDR (см. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. et al., U.S. Department of Health and Human Services (1987), and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987), эти публикации включены сюда в качестве ссылки). CDR из двух цепей каждой пары соединяются посредством каркасных участков, обеспечивая связывание со специфическим эпитопом.

В данном документе термин "иммуноглобулин" относится к белку, состоящему из одного или нескольких полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулинов. Распознанные гены иммуноглобулинов включают гены константных участков каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также многочисленные гены вариабельных областей иммуноглобулинов. Иммуноглобулины могут также существовать в разных формах помимо антител, включая, например, Fv, Fab, F(ab')₂, а также в виде бифункциональных гибридных антител (например, Lanzavecchia et al. , Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)), и в виде единичных цепей (например. , Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988), и Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), эти публикации включены в сюда в качестве ссылки). (См. Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2^nd ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), и Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), эти публикации включены сюда в качестве ссылки).

Химерные антитела представляют собой антитела, для которых гены легкой и тяжелой цепи были сконструированы, как правило, методом генной инженерии, из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих разным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов мышиных моноклональных антител могут соединяться с человеческими константными (С) сегментами, такими как γ₁ и γ₃. Таким образом, типичное терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V, или антигенсвязывающего домена мышиного антитела, и С, или эффекторного домена человеческого антитела, хотя могут использоваться другие виды млекопитающих.

В данном документе термин "каркасный участок" относится к таким фрагментам вариабельных областей легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными (т. е. отличными от CDR) среди различных иммуноглобулинов у одного вида, как определено Kabat et al., op. cit. В данном документе термин "человеческий каркасный участок" представляет собой каркасный участок, который по существу идентичен (приблизительно на 85% или более) каркасному участку встречающегося в природе человеческого антитела.

В данном документе термин "гуманизированный иммуноглобулин" относится к иммуноглобулину, включающему человеческий каркасный участок, по меньшей мере один CDR из нечеловеческого антитела, и в котором любая присутствующая константная область по существу идентична константной области человеческого иммуноглобулина, т.е. идентичность составляет по меньшей мере приблизительно 85-90%, предпочтительно по меньшей мере 95%. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, возможно за исключением CDR, являются по существу идентичными соответствующим частям одной или нескольких последовательностей природного человеческого иммуноглобулина. Например, гуманизированный иммуноглобулин не охватывает химерное антитело мышиная вариабельная область/человеческая константная область.

При применении для лечения человека гуманизированные антитела имеют по меньшей мере три потенциальных преимущества по сравнению с мышиными и, в некоторых случаях, химерными антителами.

1. Из-за того что эффекторный фрагмент является человеческим, он может лучше взаимодействовать с другими частями человеческой иммунной системы (например, более эффективно разрушает клетки-мишени посредством комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)).

2. Человеческая система не будет распознавать каркасный участок или С-область гуманизированного антитела как чужеродные, и, следовательно, гуморальный ответ против такого введенного антитела будет меньше, чем против полностью чужеродного мышиного антитела или частично чужеродного химерного антитела.

3. Было опубликовано, что введенные мышиные антитела имеют гораздо более короткий период полужизни в кровотоке человека, чем нормальные антитела (Shaw D. et al., J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)). Введенные гуманизированные антитела, возможно, будут иметь период полужизни по существу равный периоду полужизни природных человеческих антител, что позволит снизить величину дозы и частоту ее введения.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным полинуклеотидам, кодирующим CDR тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулинов, способных связывать ФфВ подобно моноклональному антителу AJvW-2. Полинуклеотиды, кодирующие эти участки, обычно связаны с полинуклеотидами, кодирующими соответствующие человеческие каркасные участки. Что касается человеческого каркасного участка, аминокислотную последовательность каркасного участка или вариабельной области CDR-предоставляющего нечеловеческого иммуноглобулина сравнивают с соответствующими последовательностями из коллекции последовательностей человеческого иммуноглобулина и выбирают последовательность, обладающую высокой степенью гомологии. Типичные полинуклеотиды, которые с целью экспрессии кодируют полипептидные цепи, включающие CDR тяжелой и легкой цепи моноклонального антитела AJvW-2, включены в фиг. 1 и 2. Благодаря генетической вырожденности и некритическим аминокислотным заменам другие полинуклеотидные последовательности могут быть легко заменены на последовательности, приведенные на фиг. 1 и 2, как описано ниже.

Конструирование гуманизированных иммуноглобулинов может проводиться следующим образом. Если аминокислота попадает в одну из следующих категорий, аминокислота каркасного участка человеческого иммуноглобулина, предназначенного для использования (акцепторный иммуноглобулин), заменяется на аминокислоту каркасного участка CDR-предоставляющего нечеловеческого иммуноглобулина (донорный иммуноглобулин): (a) аминокислота в человеческом каркасном участке акцепторного иммуноглобулина является необычной для человеческих иммуноглобулинов в этой позиции, тогда как соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является обычной для человеческих иммуноглобулинов в этой позиции; (b) позиция аминокислоты находится в непосредственной близости от одного из CDR или (c) в модели четвертичной структуры иммуноглобулина аминокислота способна взаимодействовать с CDR (см. Queen et al., op. cit., и Со et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991), соответственно обе эти публикации включены сюда в качестве ссылки).

Для подробного описания получения гуманизированных иммуноглобулинов см. Queen et al., op. cit., и Со et al., op. cit.

Полинуклеотиды обычно дополнительно включают полинуклеотидную последовательность, управляющую экспрессией, действующим образом связанную с последовательностями, кодирующими гуманизированный иммуноглобулин, включая естественно связанные или гетерологичные промоторные участки. Предпочтительно последовательности, управляющие экспрессией, представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, которые способны трансформировать эукариотические клетки-хозяева или могут быть трансфицированы в эти клетки, однако можно также использовать контрольные последовательности для хозяев-прокариотов. После внедрения вектора в соответствующий организм-хозяин этот хозяин поддерживается в условиях, подходящих для обеспечения высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и при необходимости легкие цепи, тяжелые цепи, димеры легкая/тяжелая цепь или интактные антитела, связывающие фрагменты, или другие формы иммуноглобулинов впоследствии собирают и очищают.

Последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения, способные в конечном счете экспрессировать целевые гуманизированные антитела, могут быть образованы из ряда различных полинуклеотидов (геномных или кДНК, РНК, синтетических нуклеотидов и др.) и компонентов (например, V, J, D и С областей), а также с помощью ряда различных методов. В настоящее время наиболее распространенным методом получения является соединение соответствующих геномной и синтетической последовательностей, однако могут также использоваться последовательности кДНК (см. European Patent Publication No.0239400 и Riechmann L. et al., Nature, 332, 323-327 (1988), обе эти публикации включены сюда в качестве ссылки).

Последовательности ДНК человеческой константной области могут быть выделены в соответствии с хорошо известными методами из ряда клеток человека, но предпочтительно из иммортализованных В-клеток (см. Kabat op. cit. и WP 87/02671). CDR для получения иммуноглобулинов настоящего изобретения подобным образом могут быть получены из моноклональных антител, способных связываться с ФфБ подобно AJvW-2, и могут продуцироваться а любом подходящем источнике из организма млекопитающего, включая мышей, крыс, кроликов, или другого позвоночного животного, способном продуцировать такие антитела, с помощью хорошо известных методов. Подходящие клетки-источники для получения полинуклеотидных последовательностей и клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулина могут быть получены из ряда источников, таких как American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth edition (1985), Rockville, Maryland, USA, эта публикация включена сюда в качестве ссылки).

Кроме гуманизированных иммуноглобулинов, подробно описанных в данном документе, другие "по существу гомологичные" модифицированные иммуноглобулины могут быть легко сконструированы и получены в масштабе производства с использованием различных методов получения рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Например, каркасные участки могут быть изменены относительно нативных последовательностей на уровне первичной структуры посредством замещений некоторых аминокислот, концевых и промежуточных добавлений и делеций и т.п. Кроме того, в качестве основы для гуманизированных иммуноглобулинов настоящего изобретения может использоваться ряд различных человеческих каркасных участков, по одному или их сочетания. Как правило, модификацию генов можно легко выполнить с помощью хорошо известных методов, таких как направленный мутагенез (см. Gillman and Smith, Gene, 8, 81-97 (1979), и Roberts S. et al., Nature, 328, 731-734 (1987), обе публикации включены сюда в качестве ссылок).

Альтернативно могут быть получены полипептидные фрагменты, включающие только часть первичной структуры антитела, эти фрагменты обладают одной или несколькими функциями иммуноглобулинов (например, фиксация комплемента). Эти полипептидные фрагменты могут быть получены путем протеолитического расщепления интактных антител с помощью хорошо известных в данной области методов или путем вставки с помощью направленного мутагенеза стоп-кодонов в целевые положения вектора, такие как после СН1, для получения Fab фрагментов, или после шарнирного участка для получения F(ab')₂ фрагмента. Одноцепочечные антитела могут быть получены путем соединения VL и VH с помощью ДНК линкера (см. Huston et al., op cit., и Bird et al., op cit.). Кроме того, вследствие того что, подобно многим генам, гены, относящиеся к иммуноглобулинам, содержат разделенные функциональные участки, причем каждый обладает одной или несколькими различными биологическими активностями, эти гены могут быть соединены с функциональными участками других генов для продуцирования гибридных белков, обладающих новыми свойствами.

Как установлено ранее, полинуклеотиды экспрессируются в клетках-хозяевах после оперативного связывания (т.е. такого расположения, которое обеспечивает функционирование) с последовательностью, управляющей экспрессией. Эти экспрессирующие векторы обычно реплицируются в организмах-хозяевах либо как эписомы, либо как интегральные части хромосомальной ДНК хозяина. Обычно экспрессирующие векторы содержат селекционные маркеры, например, тетрациклин или неомицин, позволяющие детектировать клетки, трансформированные с использованием целевой последовательности ДНК (см., например, патент США 4704362, эта публикация включена сюда в качестве ссылки). Е. coli является одним из прокариотических хозяев, использующихся в особенности для клонирования полинуклеотидов настоящего изобретения. Другие подходящие для использования микробные хозяева включают бациллы, такие как Bacillus subtilus и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах можно сделать экспрессирующие векторы, которые, как правило, будут содержать последовательности, управляющие экспрессией, совместимые с клеткой-хозяином (например, точка начала репликации). Кроме того, будет присутствовать любое количество из ряда хорошо известных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторкая система из фага лямбда. Промоторы обычно контролируют экспрессию, необязательно вместе с последовательностью оператора, и имеют последовательности сайта связывания рибосомы и подобные для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Для экспрессии можно также использовать другие микроорганизмы, такие как дрожжи. Saccharomyces является предпочтительным хозяином с подходящими векторами, имеющими последовательности, управляющие экспрессией, такие как промоторы, включая промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, точку начала репликации, терминирующие последовательности и другие, по необходимости.

Для экспрессии и получения полипептидов настоящего изобретения кроме микроорганизмов можно также использовать культуры клеток тканей млекопитающих (см. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), эта публикация включена сюда в качестве ссылки). Эукариотические клетки в настоящее время являются предпочтительными, потому что разработан ряд клеточных линий хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, они включают клеточные линии СНО, различные клеточные линии COS, клетки HeLa, предпочтительно миеломные клеточные линии, и др. или трансформированные В-клетки гибридом. Экспрессирующие векторы этих клеток могут включать последовательности, управляющие экспрессией, такие как точка начала репликации, промотор и энхансер (Queen et al. , Immunol. Rev., 89, 46-68 (1986), эта публикация включена сюда в качестве ссылки), и необходимые информационные сайты процессинга, такие как сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования, и последовательности терминатора транскрипции. Предпочтительными последовательностями, управляющими экспрессией, являются промоторы, полученные из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовируса, вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса и т.п.

Векторы, содержащие нужные полинуклеотидные последовательности (например, последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь, и последовательности, управляющие экспрессией), могут быть трансфицированы в клетку-хозяина с помощью хорошо известных методов, которые варьируют в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с использованием хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработка фосфатом кальция или электропорация могут использоваться для других клеток-хозяев (см., в основном, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982), эта публикация включена сюда в качестве ссылки).

После экспрессии целые антитела, их димеры, индивидуальные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов настоящего изобретения, могут быть очищены в соответствии со стандартными методами данной области, включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т. п. (см., в основном, Scopes R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982), эта публикация включена сюда в качестве ссылки). Для фармацевтических применений предпочтительными являются по существу чистые иммуноглобулины, имеющие по меньшей мере приблизительно 90-95% однородности, и наиболее предпочтительными являются иммуноглобулины, имеющие по меньшей мере приблизительно 98-99% однородности. После очистки, частичной или до требующейся степени однородности, полипептиды могут использоваться терапевтически (в том числе экстракорпорально), или при разработке и проведении аналитических процедур, иммунофлюоресцентного окрашивания и т.п. (см. , в основном, Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 and 1981).

Иммуноглобулины настоящего изобретения обычно находят конкретное применение для лечения тромботических заболеваний у человека. Гуманизированные иммуноглобулины и включающие их фармацевтические композиции данного изобретения в особенности являются полезными для парентерального введения, т.е. для подкожного, внутримышечного, внутривенного или внутриглазного введения. Композиции для парентерального введения обычно включают раствор иммуноглобулинов или их смесь, растворенную в приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Можно использовать ряд водных растворителей, например, воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% раствор глицина, 5% раствор глюкозы, раствор человеческого альбумина и т.п. Эти растворы являются стерильными и не содержат твердого вещества. Эти композиции могут быть стерилизованы с помощью традиционных, хорошо известных методов стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые дополнительные вещества, требующиеся для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, необходимые для доведения рН, забуферивающие агенты, тонизирующие агенты, агенты, модулирующие токсичность, и т.п., например ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия, цитрат натрия и др. Концентрация иммуноглобулина в этих композициях может сильно варьировать, т.е. от менее чем приблизительно 0,5%, обычно минимально приблизительно 1%, до 15 или 20% по массе, в основном, ее выбирают на основе объемов жидкостей, вязкостей и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.

Таким образом, типичная фармацевтическая композиция, предназначенная для инъекции, может быть составлена так, чтобы содержание стерильной забуференной воды составляло 1 мл и иммуноглобулина 1-100 мг. Типичная композиция для внутривенного вливания может быть составлена так, чтобы содержание стерильного раствора Рингера составляло 250 мл и иммуноглобулина 150 мг. Современные методы получения композиций, предназначенных для парентерального введения, известны или очевидны для специалистов в данной области, более подробно они описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15^th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), эта публикация включена сюда в качестве ссылки.

Иммуноглобулины данного изобретения можно замораживать или лиофилизировать для хранения и восстанавливать их в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что эта методика является эффективной в случае традиционных иммуноглобулинов, и могут применяться известные в данной области методы лиофилизации и воссоздания. Специалисту в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут привести к различным степеням утраты иммунологической активности (например, в случае традиционных иммуноглобулинов антитела IgM имеют тенденцию к утрате активности в большей степени, чем антитела IgG), и используемые уровни должны быть выверены так, чтобы компенсировать эту утрату.

Композиции, содержащие гуманизированные иммуноглобулины настоящего изобретения или их смесь, могут быть введены с целью лечения или профилактики. В случае применения с целью лечения композиции вводят пациенту, уже страдающему от тромбозного заболевания, в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере для частичного подавления заболевания и его осложнений и не вызывающем кровоизлияний. Такое количество определяют как "терапевтически эффективная доза". Количество, эффективное для такого применения, зависит от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно варьирует приблизительно от 0,1 до 200 мг/кг на дозу пациента, которая обычно используется. Возможны конкретные дозировочные режимы с дозами 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг и т.д., вводимыми ежедневно, 2 или 3 раза в неделю, еженедельно, один раз в две недели, ежемесячно и т.д., дозировочный режим выбирает опытный врач в зависимости от тяжести заболевания и других факторов.

Нужно помнить, что вещества данного изобретения, как правило, могут применяться при серьезных болезненных состояниях, то есть в угрожающих жизни или в потенциально угрожающих жизни ситуациях. В таких случаях, с точки зрения минимизации поступающих извне веществ и снижения возможности отторжения "чужеродного вещества", что достигается в результате присутствия гуманизированных иммуноглобулинов настоящего изобретения, введение существенных избытков этих иммуноглобулинов является возможным и может быть желательным с точки зрения лечащего врача.

Однократные или многократные введения композиций могут проводиться в соответствии с уровнями дозы и схемой, выбранными лечащим врачом. В любом случае, фармацевтические композиции должны предоставлять количество иммуноглобулина(ов) данного изобретения, достаточное для эффективного лечения пациента.

В отдельных воплощениях композиции, включающие гуманизированные иммуноглобулины настоящего изобретения, могут использоваться для детектирования ФфВ. Так, гуманизированный иммуноглобулин, который связывается с антигенной детерминантой, определенной с помощью антитела AJvW-2, можно пометить и использовать для идентификации анатомических участков, которые содержат значительные концентрации ФфВ. Например (но не для ограничения), к гуманизированному иммуноглобулину могут быть присоединены один или несколько меченых компонентов. Примеры меченых компонентов включают, не ограничиваются ими, радионепроницаемые красители, радиоконтрастные агенты, флуоресцентные молекулы, спин-меченные молекулы, ферменты или другие меченые компоненты, предназначенные для диагностических применений, особенно в радиологическом и магнитного резонанса методах формирования изображения.

Гуманизированные иммуноглобулины настоящего изобретения дополнительно могут иметь широкий ряд применений in vitro. Например, иммуноглобулины могут использоваться для детектирования ФфВ.

Иммуноглобулины, предназначенные для диагностических целей, могут быть или мечеными, или немечеными. Немеченые иммуноглобулины могут использоваться в сочетании с другими мечеными антителами (вторичными антителами), которые могут взаимодействовать с гуманизированным иммуноглобулином, такими как антитела, специфичные к константным областям человеческого иммуноглобулина. Альтернативно иммуноглобулины могут быть непосредственно помечены. Можно использовать широкий ряд меток, таких как радионуклиды, флуоресцирующие агенты, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, лиганды (в особенности гаптены) и т.д. Многочисленные типы иммунологических анализов являются доступными и хорошо известными специалистам в данной области.

Могут также поставляться наборы для применения с обсуждаемыми иммуноглобулинами для защиты от или детектирования клеточной активности или для присутствия выбранного антигена. Таким образом, может быть предоставлена композиция настоящего изобретения, содержащая обсуждаемый иммуноглобулин, как правило, в лиофилизированном виде или в контейнере, либо одна, либо вместе с дополнительными антителами, специфичными для целевого клеточного типа. Иммуноглобулины, которые могут быть конъюгированными с меткой или токсином или неконъюгированными, включены в наборы вместе с буферами, такими как Tris, фосфатный, карбонатный и т.д., стабилизаторами, консерваторами, биоцидами, инертными белками, например, сывороточным альбумином или подобными, и набором инструкций для применения. Обычно эти вещества присутствуют в количестве, меньшем чем приблизительно 5 мас.% от количества активного иммуноглобулина, и обычно они присутствуют в общем количестве, составляющем по меньшей мере 0,001 мас.%, опять же от концентрации иммуноглобулина. Зачастую является желательным включение инертного наполнителя или эксципиента для разбавления активных ингредиентов, причем эксципиент может присутствовать в количестве, составляющем приблизительно от 1 до 99 мас.% от общей массы композиции. Если в анализе используется вторичное антитело, способное связываться с иммуноглобулином, то оно обычно находится в отдельном сосуде. Вторичное антитело обычно является конъюгированным с меткой, и содержащую его композицию обычно готовят так же, как и иммуноглобулиновые композиции, описанные выше.

Предлагаемые ниже примеры являются иллюстрацией, но не ограничением. Понятно, что, хотя эти примеры относятся к гуманизированному антителу AJvW-2, также рассматривается получение гуманизированных антител с высоким связывающим сродством к антигену ФфВ с использованием CDR из других моноклональных антител, которые связываются с тем же эпитопом ФфВ.

ПРИМЕРЫ Пример 1: клонирование и секвенирование кДНК вариабельных областей мышиного AJvW-2
кДНК вариабелькых областей тяжелой и легкой цепи мышиного AJvW-2 клонируют на мРНК, выделенной из клеток гибридомы, методом якорной ПЦР (Со et al. , J. Immunol., 148:1149 (1992)). Используемые 5' - праймеры отжигают с поли-dG - хвостами, добавленными к кДНК, и 3' - праймеры с константными участками. Затем амплифицированные фрагменты генов вставляют в плазмиду pUC18. Определяют нуклеотидные последовательности в нескольких независимых клонах кДНК как _L, так и v_H. Для тяжелой цепи была идентифицирована единственная уникальная последовательность, типичная для вариабельной области мышиной тяжелой цепи. Для легкой цепи были идентифицированы две уникальные последовательности, обе являются гомологичными последовательностям вариабельной области мышиной легкой цепи. Однако одна последовательность не является функционально активной из-за пропуска нуклеотида, который вызывает сдвиг рамки считывания в месте соединения V-J, она была идентифицирована как непродуктивная аллель. Другая последовательность была типичной для функциональной вариабельной области мышиной каппа-цепи. Последовательности кДНК вариабельных областей тяжелой цепи и функциональной легкой цепи и транслированные аминокислотные последовательности показаны на фиг. 1. Последовательность мышиной V_K принадлежит к мышиной каппа-цепи подгруппы V по Kabat. Последовательность мышиной v_H принадлежит к тяжелой цепи подгруппы III(B) no Kabat.

Пример 2: конструирование вариабельных областей гуманизированного AJvW-2
Для сохранения связывающего сродства мышиного антитела в гуманизированном антителе следуют общей методике Queen et al. (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029 (1989), и патенты США 5585089 и 5693762). Выбор остатков каркасного участка может быть критичным для сохранения связывающей активности. В принципе, в качестве матрицы для пересадки CDR может служить последовательность каркасного участка из любого человеческого антитела; однако было показано, что прямая подстановка CDR в такой каркасный участок может приводить к значительной утрате связывающего сродства к антигену (Tempest et al., Biotechnology, 9:266 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med., 17: 217 (1992)). Чем более гомологичным является человеческое антитело по отношению к первичному мышиному антителу, тем с меньшей вероятностью человеческий каркасный участок будет вносить в мышиные CDRs искажения, вызывающие уменьшение сродства. На основе гомологии последовательностей, установленной с помощью базы данных Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed. , U.S. Department of Health and Human Services, 1991), человеческое антитело I3R было выбрано для предоставления каркасного участка, обладающего оптимальной степенью гомологии по отношению к мышиному антителу AJvW-2. Другие высоко гемологичные цепи человеческих антител также являются подходящими для предоставления каркасного участка гуманизированного антитела, особенно легкие каппа-цепи человеческой подгруппы I и тяжелые цепи человеческой подгруппы III, как определено по Kabat.

Для конструирования молекулярной модели вариабельного домена использовали компьютерные программы ABMOD и ENCAD (Zilber et al., Biochemistry, vol. 29, 10032 (1990); Levitt et al., J. Mol. Biol., 168:595 (1983)), эту модель использовали для определения местонахождения аминокислот в каркасном участке AJvW-2, которые находятся достаточно близко к CDR, чтобы иметь возможность взаимодействовать с ними. Для конструирования вариабельных областей тяжелой и легкой цепи гуманизированного AJvW-2, CDR мышиного антитела AJvW-2 встраивают в каркасные участки человеческого антитела I3R. В тех положениях каркасного участка, которые, как можно предположить на основании компьютерной модели, имеют существенный контакт с CDR, аминокислоты мышиного антитела заменяют на первоначальные аминокислоты человеческого каркасного участка. В случае гуманизированного AJvW-2 эту замену производят для остатков 28, 48, 49 и 67 тяжелой цепи и для остатков 48, 70 и 71 легкой цепи. Кроме того, остатки каркасного участка, которые в базе данных по человеческим антителам только изредка встречаются в этих положениях, заменяют на человеческие консенсусные аминокислоты в этих положениях. В случае гуманизированного AJvW-2 эту замену производят для остатков 1, 78 и 118 тяжелой цепи и для остатков 62, 73 и 83 легкой цепи.

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела AJvW-2 приведены на фиг. 2. Однако многие из остатков, для которых возможен контакт с CDR, подвержены замещению на другие аминокислоты, и тем не менее позволяют антителу сохранять, в основном, сродство к антигену. В следующей таблице перечисляется ряд положений каркасного участка, в которых альтернативные аминокислоты являются подходящими (ЛЦ = легкая цепь, ТЦ = тяжелая цепь).

Подобным образом, многие остатки каркасного участка тяжелой и легкой цепей гуманизированного AJvW-2, не имеющие контакта с CDR, могут предоставлять замещения аминокислот из соответствующих положений человеческого антитела I3R, из
других человеческих антител, на человеческие консенсусные аминокислоты, из мышиного антитела AJvW-2, из других мышиных антител, без значительной утраты сродства и неиммуногенности гуманизированного антитела. В следующей таблице перечисляется ряд дополнительных положений каркасного участка, в которых альтернативные аминокислоты являются подходящими (ЛЦ = легкая цепь, ТЦ = тяжелая цепь).

Подборка различных аминокислот может использоваться для получения вариантов гуманизированного AJvW-2, которые имеют различные комбинации сродства, специфичности, неиммуногенности, легкости получения в промышленности и других целевых свойств. Таким образом, примеры в вышеприведенных таблицах предлагаются в качестве иллюстрации, но не ограничения.

Пример 3: конструирование гуманизированного AJvW-2
В случае, если были сконструированы, как описано выше, аминокислотные последовательности гуманизированных вариабельных областей, конструируют гены, кодирующие их, включая сигнальные пептиды, сплайсинговые донорные сигналы и соответствующие сайты рестрикции (фиг. 2). Гены тяжелых и легких цепей вариабельной области конструируют и амплифицируют с использованием восьми перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, длина которых варьирует приблизительно от 65 до 80 оснований (см. Не et al. J. Immunol., 160:1029 (1998)). Олигонуклеотиды парами подвергают отжигу и наращивают с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, получая четыре двухцепочечных фрагмента. Полученные фрагменты подвергают денатурации, отжигу и наращивают с использованием фрагмента Кленова, получая два фрагмента. Эти фрагменты подвергают денатурации, попарно отжигают и снова наращивают, получая полноразмерный ген. Полученный продукт амплифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя Taq полимеразу, подвергают гель-очистке, расщепляют с помощью XbaI, снова подвергают гель-очистке и проводят субклонирование в XbaI сайте экспрессионного вектора pVk, pVg4 или pVg2.M3. Вектор pVk, предназначенный для экспрессии легкой цепи, был описан ранее (см. Со et al., J. Immunol. , 148: 1149 (1992)). Вектор pVg4, предназначенный для экспрессии тяжелой цепи, конструируют путем замены фрагмента XbaI-BamHI вектора pVgl, содержащего ген константной области g1 (см. Со et al., J. Immunol., 148:1149 (1992)), на фрагмент человеческого гена константной области g4, величиной приблизительно 2000 п. о. (пар оснований) (Ellison and Hood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1984 (1982)), который наращивают из сайта HindIII, предшествующего экзону С_H1 гена q4 на 270 п.о., и расположенного после сайта NsiI, следующего за экзоном С_H4 этого гена. Вектор pVg2.M3, предназначенный для экспрессии цепи гамма 2, был описан ранее (см. Cole et al., J. Immunol., 159: 3613 (1997)). pVg2.M3 представляет собой вариант человеческого дикого IgG2, полученный путем замены аминокислот Val и Gly в положениях 234 и 237 на Аlа. Этот вариант обладает пониженной способностью к взаимодействию с рецепторами его Fc и, следовательно, обладает минимальной эффекторной активностью антитела.

Структуру конечных плазмид подтверждают путем нуклеотидного секвенирования рестрикционного картирования. Все манипуляции с ДНК проводят с помощью стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области.

Для сравнительных исследований были получены два гуманизированных AJvW-2, IgG4 и IgG2.M3. Для получения клеточной линии, продуцирующей гуманизированный AJvW-2, соответствующие плазмиды, несущие гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в мышиную миеломную клеточную линию Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581). Перед трансфекцией плазмиды, содержащие гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи, подвергают линеаризации с помощью рестрикционных эндонуклеаз. Линеаризацию плазмид, содержащих гены, кодирующие каппа-цепь и тяжелую цепь гамма 2, проводят с помощью FspI; линеаризацию плазмид, содержащих гены, кодирующие цепь гамма 4, проводят с помощью BstZ17I. Приблизительно 20 мкг каждой плазмиды трансфицируют в 1•10⁷ клеток в PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером). Трансфекцию осуществляют методом электропорации с использованием устройства Gene Pulser (BioRad) при 360 В и емкости 25 мкФ (микрофарад) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки от каждой трансфекции помещают в четыре 96-луночных культуральных планшета и через два дня вносят селекционную среду (DMEM, 10% FCS, добавка 1хHT (Sigma), 0,25 мг/мл ксантина, 1 мкг/мл микофенольной кислоты).

Приблизительно через две недели проявившиеся клоны проверяют на продукцию антител с помощью ELISA. Антитела получают от интенсивно продуцирующих клонов путем выращивания клеток в нормальной среде (DMEM с 10% FCS) до слияния, затем замены среды на бессывороточную среду (Hybridoma SMF; Gibco) и культивирования до достижения в культуре максимального титра антител. Супернатант пропускают через колонку с белок А-сефарозой (Pharmacia); антитела элюируют 0,1 М глицином, 100 мМ NaCl, pH 3, нейтрализуют и затем среду заменяют на физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS). Чистоту антител подтверждают путем анализа их в акриламидном геле, их концентрацию определяют путем считывания OD₂₈₀ (поглощения оптической плотности при 280 нм), полагая, что 1,0 мг белка антитела соответствует значению OD₂₈₀, равному 1,4.

Пример 4: свойства гуманизированного AJvW-2
Сродство мышиных и гуманизированных антител AJvW-2 к фактору фон Виллебранда (ФфВ) определяют путем конкурентного связывания с биотинилированным мышиным антителом AJvW-2. Процедура проведения этого эксперимента описана ниже.

1. Раствор ФфВ разбавляют до 8 мкг/мл с помощью TBS (20 мМ Tris, рН 7,4,0,15 М NaCl). 50 мкл вносят в каждую лунку 96-луночного планшета NUNC Maxisorp (VWR Scientific Product) и инкубируют в течение ночи при 4^oС.

2. Планшет промывают один раз TBS, блокируют путем добавления 200 мкл/лунку блокирующего раствора (TBS + 5% БСА) и инкубируют 3 часа при комнатной температуре.

3. Планшет промывают три раза TBS.

4. Мышиный AJvW-2 предварительно биотинилируют, используя сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноат (Pierce, Rockford, IL, продукт номер 21335), в соответствии с инструкциями производителя. Биотинилированные антитела разбавляют до 0,5 мкг/мл в TBS+0,1% БСА.

5. Восемь 4-кратных серийных разведений холодных конкурирующих мышиных и гуманизированных антител, готовят в TBS + 0,1% БСА, начиная с 25 мкг/мл.

6. К каждой лунке планшета, покрытого ФфВ, добавляют следующие растворы: 25 мкл TBS+1% БСА+10% ДМСО, 100 мкл холодного конкурирующего антитела (мышиного, гуманизированного IgG2m3 или гуманизированного IgG4) и 25 мкл биотинилированного антитела, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа при слабом встряхивании.

7. Планшет промывают три раза раствором для промывания (TBS +0,05% Tween-20) и окрашивают с помощью набора для фосфатазного окрашивания ImmunoPure ABC (Pierce, Rockford, IL) в соответствии с инструкцией производителя. Конкретно раствор получают путем добавления 2 капель реагента А (авидин) и 2 капель реагента В (биотинилированная щелочная фосфатаза) к 50 мл TBS+0,1% БСА. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляют 50 мкл полученного раствора и инкубируют 1 час при комнатной температуре.

8. Планшет промывают три раза раствором для промывания и для развития окраски добавляют субстрат щелочной фосфатазы (Sigma, St. Louis, МО).

9. Поглощение измеряют при 405 нм и строят график зависимости его от концентрации конкурирующих антител.

Результат, приведенный на фиг. 3, демонстрирует, что гуманизированные AJvW-2, IgG4 и IgG2m3 конкурируют одинаково хорошо с биотинилированным мышиным антителом при сравнении с немеченым мышиным антителом, позволяя предположить, что два гуманизированных антитела имеют сходные степени связывающего сродства и что не существует существенного различия в сродстве гуманиэированных антител и мышиного антитела к антигену.

Фиг. 1 демонстрирует кДНК и транслируемые аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи (А) и легкой цепи (В) мышиного антитела AJvW-2. Гипервариабельные участки (CDR) подчеркнуты, а первые аминокислоты зрелых цепей подчеркнуты дважды.

Фиг. 2 демонстрирует ДНК и транслируемые аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи (А) и легкой цепи (В) мышиного антитела AJvW-2. Гипервариабельные участки (CDR) подчеркнуты, а первые аминокислоты зрелых цепей подчеркнуты дважды.

Фиг. 3 представляет график характеристик конкурентного связывания мышиных и гуманизированных антител AJvW-2 (IgG4 и IgG2m3) с фактором фон Биллебранда. Холодное конкурирующее антитело в увеличивающихся концентрациях инкубируют с фактором фон Виллебранда в присутствии следовых количеств биотинилированного мышиного AJvW-2. Измеряют абсорбцию и строят график зависимости абсорбции от концентрации немеченых конкурирующих антител.

Очевидно, что возможны многочисленные вариации данного изобретения в свете вышеприведенных наставлений. Следовательно, в пределах сферы прилагающейся формулы изобретения, данное изобретение может быть осуществлено иным образом, отличным от описанного здесь.

Формула изобретения

1. Гуманизированный иммуноглобулин, который связывает человеческий фактор фон Виллебранда и содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:3, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:4.

2. Иммуноглобулин по п.1, который конкурирует с мышиным антителом AJvW-2 за специфическое связывание с фактором фон Виллебранда.

3. Гуманизированный иммуноглобулин, который связывается с человеческим фактором фон Виллебранда и содержит (а) гипервариабельные участки, обладающие аминокислотными последовательностями RFWMS (31-35), EVNPDNNTMNYTPSLKD (50-66) и PPYYGSYGGFAY (99-110) в тяжелой цепи и RASENIYNNLA (24-34), AATNLAD (50-56) и OHLWTSPYT (89-97) в легкой цепи, и (b) каркасные участки человеческого антитела.

4. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1 или 3, содержащий гипервариабельные участки мышиного антитела AJvW-2 и каркасные участки вариабельной области тяжелой и легкой цепей из каркасных участков тяжелой и легкой цепей человеческого антитела 13 R, при условии, что, по меньшей мере, одно положение, выбранное из группы, состоящей из ЛЦ-48, ЛЦ-70, ЛЦ-71, ТЦ-28, ТЦ-48, ТЦ-49 и ТЦ-67, занято аминокислотой, присутствующей в эквивалентном положении каркасного участка вариабельной области тяжелой или легкой цепи мышиного антитела AJvW-2, причем указанное гуманизированное антитело специфично связывает фактор фон Виллебранда с константой сродства, находящейся между 10⁷ М^-1 и десятикратным сродством мышиного антитела AJvW-2.

5. Гуманизированный иммуноглобулин по п.4, который представляет собой антитело, в котором каждое положение, выбранное из группы, состоящей из ЛЦ-48, ЛЦ-70, ЛЦ-71, ТЦ-28, ТЦ-48, ТЦ-49 и ТЦ-67, занято аминокислотой, присутствующей в эквивалентном положении каркасного участка вариабельной области тяжелой или легкой цепи мышиного антитела AJvW-2.

6. Гуманизированный иммуноглобулин по п.5, в котором, по меньшей мере, одно положение, выбранное из ЛЦ-62, ЛЦ-73, ЛЦ-83, ТЦ-1, ТЦ-78 и ТЦ-118, занято аминокислотой, присутствующей в эквивалентном положении консенсусной последовательности тяжелой или легкой цепи человеческого антитела.

7. Гуманизированный иммуноглобулин по п.4, включающий вариабельную область тяжелой цепи, представленную на фиг.2а (SEQ ID NO:3), и вариабельную область легкой цепи, представленную на фиг.2b (SEQ ID NO:4), где аминокислоты в одном или нескольких положениях могут быть замещены на альтернативные, показанные в табл. 1 и 2.

8. Гуманизированный иммуноглобулин, который связывается с человеческим фактором фон Виллебранда и содержит гуманизированную тяжелую цепь, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью по отношению к гуманизированной тяжелой цепи, представленной на фиг. 2а (SEQ ID NO:3), и гуманизирвоанную легкую цепь, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности по отношению к гуманизированной легкой цепи, представленной на фиг.2b (SEQ ID NO:4), при условии, что, по меньшей мере, одно положение, выбранное из группы, состоящей из ЛЦ-48, ЛЦ-70, ЛЦ-71, ТЦ-28, ТЦ-48, ТЦ-49 и ТЦ-67, занято аминокислотой, присутствующей в эквивалентном положении каркасного участка вариабельной области тяжелой или легкой цепи мышиного антитела AJvW-2.

9. Иммуноглобулин по пп.1, 3 или 8, содержащий две пары димеров легкая/тяжелая цепь, где каждая цепь включает вариабельную область и константную область.

10. Иммуноглобулин по пп.1, 3 или 8, который представляет собой фрагмент Fab или F(ab`)₂ или Fv.

11. Гуманизированный иммуноглобулин по пп.1, 3 или 8, содержащий гипервариабельные участки (CDR) из AJvW-2 и каркасные участки вариабельной области тяжелой и легкой цепей, где последовательность каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи представляет собой консенсусную последовательность каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина.

12. Гуманизированный иммуноглобулин по пп.1, 3 или 8, который относится к подтипу иммуноглобулинов IgG₂ или IgG₄.

13. Гуманизированный иммуноглобулин по пп.1, 3 или 8, где константная область представляет собой область Сγ2 или Сγ4.

14. Способ получения гуманизированного иммуноглобулина, охарактеризованного в пп.1, 3 или 8, предусматривающий культивирование клеточной линии, которая кодирует тяжелую и легкую цепи указанного гуманизированного иммуноглобулина, посредством чего экспрессирует указанное гуманизированное антитело; и выделение указанного гуманизированного антитела.

15. Способ по п.14, дополнительно предусматривающий получение фармацевтической композиции путем смешивания гуманизированного антитела с фармацевтически приемлемым носителем.

16. Фармацевтическая композиция, включающая гуманизированный иммуноглобулин, охарактеризованный в пп.1, 3 или 8, и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Способ лечения пациента, страдающего от тромботического заболевания или атеросклероза или имеющего риск такого заболевания, предусматривающий введение указанному пациенту эффективной дозы гуманизированного иммуноглобулина, охарактеризованного в пп.1, 3 или 8.

18. Способ по п.17, где лечение направлено на инсульт, преходящие приступы ишемии, нестабильную стенокардию, острый инфаркт миокарда, стенокардию, заболевание периферических сосудов, тромбоз глубоких вен, гемолитико-уремический синдром, гемолитическую анемию, острую почечную недостаточность, тромбоцитопеническую тромбогенолитическую пурпуру, ишемические осложнения, вызванные острым и подострым тромбозом или повторным стенозом после эндоваскулярного вмешательства, или на профилактику ишемических осложнений, вызванных повторной закупоркой после тромболитического лечения при остром инфаркте миокарда, в качестве дополнительной терапии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7