Способ получения препарата коллагеназы

 

Использование: в биотехнологии, медицине, биохимии, пищевой промышленности и для исследовательских целей. Способ получения препарата коллагеназы включает гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата. Очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М. Элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией. При этом гомогенизацию проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2. Осаждение ведут путем добавления сульфата аммония 60-70%-ного насыщения, сорбцию - в присутствии ацетат-аммонийного буфера, элюцию - при рН 8,0-8,5, а ультрафильтрацию - на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 кДа. Изобретение обеспечивает выход целевого продукта до 75-100%, повышение удельной активности в 2-3 раза, сокращение времени процесса. 5 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных, высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

В настоящее время известны очищенные препараты коллагеназ, выпускаемые зарубежными фирмами, например Sigma, ICN. Эти ферментные препараты приготовлены из культуральной жидкости Clostridium hystoliticum, патогенного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены. В связи с этим препараты дороги, их применение в пищевой и медицинской промышленности невозможно из-за опасности микробного заражения. В то же время гепатопанкреас крабов, особенно, камчатского краба, богат протеолитическими ферментами, в том числе и коллагеназами. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Известен способ получения коллагеназы, предусматривающий гомогенизацию гепатопакреас промысловых крабов в забуференных водных растворах путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2-8 час при температуре 0-30^oС, к полученному раствору добавляют раствор хитозана с рН 2,0-6,5 до достижения концентрации 0,01-0,4 мас.%. Полученные раствор после отделения нерастворимого материала подвергают последовательно ультрафильтрации на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол.м. 30 кДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800-11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

В известном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Способ, при его небольших затратах материалов, технологического времени и сырья, практически лишен недостатков, за исключением хитозана, который может инъактивировать фермент (Патент РФ, 2039819, C 12 N 9/48, 20.07.95).

Известен также способ получения коллагеназы, предусматривающий использование в качестве исходного сырья замороженный гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes camtshatica, из которого выделяют экстракцией комплекс ферментов, помещением его в раствор 0,1-1,0 М хлорида щелочного металла. Смесь выдерживают в течение 14-16 час, поддерживая температуру 19-21^oС, при соотношении сырья и хлорида щелочного металла 1:2,2-2,3, периодически перемешивая. Осадок отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм, и 0,1 мм. Отделение липидной фракции осуществляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,45 мкм, ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да.

Полученный концентрат лиофильно высушивают.

Коллагенолитическая активность полученного препарата составляет не менее 2000 ед. Мандл/мг, содержание белка в препарате - 97%.

Недостатком известного способа является длительность процесса как на стадии гомогенизации сырья, так и на стадии выделения коллагеназы, включающую последовательную фильтрацию, микрофильтрацию, ультрафильтрацию, что снижает выход продукта (Патент РФ 2096456, C 12 N 9/48, 20.11.97).

Кроме того, известен способ получения коллагеназы, включающий гомогенизацию гематопанкреаса крабов в солевом буферном растворе (2,0 М раствор хлористого натрия), фракционированием материала сульфатом аммония, отделение центрифугированием нерастворимых веществ и очистку с использованием гидрофобной хроматографии, причем сорбцию фермента на сорбент осуществляют при уравновешивании последнего буферным раствором соли в концентрации не менее 1,0 М, а элюцию фермента проводят при ступенчатом уменьшении концентрации буферного раствора соли до 0,025 М. Полученный элюат обессоливают диализом.

В качестве буферного раствора при сорбции продукта используют сульфат аммония, а при десорбции - бикарбонат аммония. Для удаления балластных белков и пигментов фракционирование материала сульфатом аммония осуществляют путем многократного его переосаждения указанным реагентом до 50% насыщения. В качестве сорбента используют поливинил пирралидоновые носители типа Fractogel или Toyperl.

Известный способ позволяет эффективно удалять примеси пигментов и белков, однако выход продукта составляет 22-24% и вследствие этого непригоден для условий масштабного производства (Патент РФ 2121503, С 12 N 9/48, 10.11.98).

Наиболее близким к заявляемому является способ получения препарата коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба, включающий гомогенизацию его в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделение супернатанта центрифугированием и осаждение препарата сульфатом аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са²⁺. Затем проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 М NaCl, в присутствии 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60%. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализируют и лиофильно высушивают.

В качестве аминированных силикатных материалов используют аминосилохром, аминоаэросил, аминосиликагель.

Выход коллагеназы составляет 50%, очистка в 40 раз.

К недостаткам способа следует отнести невысокий выход и недостаточную очистку целевого продукта. Последнее особенно важно при медицинском применении препарата. Кроме того, применение анионообменной хроматографии приводит к потере ценных компонентов, изоэлектрическая точка которых выше 5. Обессоливание препарата коллагеназ диализом приводит к потере ферментов, т.к. коллагеназа за время диализа (2 суток) частично гидролизует диализные мешки. Длительное пребывание ферментов в дистиллированной воде с рН 5,6 приводит к частичной инактивации ряда протеолитических ферментов (Патент РФ 2008353, C 12 N 9/64, 28.02.94 г.).

Задачей изобретения является повышение выхода, удельной активности, чистоты препарата и сокращения времени проведения процесса.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения препарата коллагеназы, включающем гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта (супернатанта) центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата, очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М, элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией.

Гомогенизацию обычно проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2, осаждение - путем добавления сульфата аммония 60-70% насыщения, сорбцию ведут в присутствии ацетат-аммонийного буфера, а элюцию - трисовым буфером с добавлением ацетата кальция при рН 8,0-8,5.

Предпочтительно ультрафильтрацию вести на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 кДа.

Наиболее перспективным для избирательной очистки коллагеназы при ее получении является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяющей разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а поэтому достигать более высоких результатов при выделении ферментов.

Известно, что антибиотики-полипептиды, например бацитрацин и грамицидин С, успешно используемые в качестве лигандов аффинной хроматографии, не специфичны по отношению к протеиназам гепатопанкреаса камчатского краба. Для этих ферментов групповой специфичностью обладают аффинные сорбенты с антибиотиком полимиксином М в качестве лиганда. Полимиксин М представляет собой природный циклопептид. Характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры и оригинальный набор природных и неприродных аминокислот способствуют узнаванию лиганда коллагеназами. При этом происходит избирательное связывание коллагеназы с нерастворимым носителем. Элюция коллагеназы 0,05 мМ трисовым буфером рН 8,0-8,5 является, в отличии от элюции солевым и спиртовыми растворами, очень мягкой и способствует полному сохранению активности ферментов.

Сущность способа заключается в следующем.

В качестве источника коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 мМ ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,0-6,5 с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция.

В качестве хроматографического метода очистки используют аффинную хроматографию с использованием в качестве аффинного сорбента макропористого кремнезема, содержащего ковалентно присоединенный антибиотик - полимиксин М.

Сорбцию ферментов проводят в динамической или статическом режиме. При этом происходит избирательное связывание коллагеназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей в том числе и окрашенных.

Носитель со связанным белком промывают тем же ацетатаммонийным буфером рН 6,0-6,5, а десорбцию проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0-8,5 с 1 мМ ацетата кальция. Для концентрации и обессоливания элюат подвергают ультрафильтрации на установке с мембраной, задерживающей белки с молекулярной массой выше 10 кДа. Элюат концентрируют и промывают 10-кратным объемом дистиллированной воды и затем лиофильно высушивают.

Очищенный фермент можно использовать в случае необходимости в виде раствора, но в основном высушивают лиофильно после обессоливания ультрафильтрацией.

В результате получают очищенный ферментный препарат коллагеназы, обладающий коллагенолитической активностью, определяемую известными методами. Выход по активности 75-100%. Удельная активность коллагеназы повышается в 2-3 раза и составляет 0,6-0,9 ед/А₂₈₀.

Пример 1.

20 г гепатопанкреаса крабов предварительно гомогенизируют и экстрагируют фермент буфером рН 6,4 (0,1 М ацетата аммония), затем осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,1-6,4 и наносят на колонку (1•5 см) с полимиксин-силохромом, уравновешенным тем же буфером. Элюцию активных ферментов проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0.

Элюат подвергают ультрафильтрации на мембране YM 10 Millipor, концентрируют до небольшого объема (не более 2 мл), промывают 10-кратным количеством дистиллированной воды, высушивают лиофильно.

Выход по активности 100%, очистка в 120 раз, удельная активность 0,6 ед/А₂₈₀.

Пример 2.

Процесс экстракции и осаждения белков сульфатом аммония производится аналогично примеру 1.

Раствор сульфат-пасты, полученной из 20 г гепатопанкреаса краба добавляют к 3 г. полимиксин-силохрома, уравновешенного 0,1 М ацетатом аммония рН 6,1, осторожно перемешивают 20 мин, раствор декантируют, сорбент промывают тем же буфером. Элюцию проводят добавлением 3-кратного количества 0,05 М трисового буфера рН 8,5. Элюат подвергают ультрафильтрации. Концентрируют, промывают, высушивают лиофильно.

Выход по активности 75%, удельная активность 0,6 ед/A₂₈₀, очистка в 60 раз.

Предлагаемый способ является более экономичным за счет применения аффинного сорбента. Метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяет выделять ферменты на основе их биологической специфичности, исключать потери в процессе выделения ценных ферментов, а поэтому достигать более высокой степени очистки по сравнению с ионообменной и другими видами хроматографической техники. Применение трисового буфера без добавления высоких концентраций соли и спирта полностью сохраняет активность коллагенолитических ферментов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить до 75-100% выход целевого продукта, повысить удельную активность в 2-3 раза, сократить время процесса и потери фермента за счет замены диализа в диализных мешках диализом с помощью ультрафильтрации. Обессоливание элюата методом ультрафильтрации вместо диализа значительно сокращает время процесса обессоливания, сохраняет активность фермента, а также приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых также сокращается.

Формула изобретения

1. Способ получения препарата коллагеназы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата, с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата, отличающийся тем, что очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М, элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией.

2. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2.

3. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что осаждение ведут путем добавления сульфата аммония 60-70% насыщения.

4. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что сорбцию ведут в присутствии ацетат-аммонийного буфера.

5. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что элюцию ведут при рН 8,0-8,5.

6. Способ получения препарата коллагеназы по п.1, отличающийся тем, что ультрафильтрацию ведут на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 КДа.