Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного гибридного белка - фактор некроза опухолей-тимозин-1

 

Изобретение относится к области биотехнологии и фармакологии. Сконструирована плазмида pThy316, которая содержит промоторы, обеспечивающие высокую конститутивную экспрессию в клетках Е. coli гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, и два гена устойчивости к антибиотикам ампицилину и аминогликозидам. Предложен способ синтеза гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, который предусматривает культивирование штамма Е. coli, трансформированного плазмидой pThy316, отмывку осадка после лизиса клеток 1-3 М раствором мочевины с последующим растворением в 6-8 М растворе мочевины для получения раствора, который затем последовательно очищают на анионообменном сорбенте, гидроксилаппатите и гель-фильтрацией с элюцией буфером без мочевины, чем достигается ренатурация белка. Также создан препарат гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, который содержит в определенном соотношении полученный по способу данного изобретения белок, маннит и соль. Использование предложенного изобретения позволяет получать хорошо очищенный гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ и его фармацевтический препарат. 3 с. и 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и фармации и может быть использовано для создания лекарственных препаратов рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, обладающего противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью.

Наиболее близкими аналогами изобретения являются рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315, кодирующая гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ (RU 2077586, С 12 N 15/12, 20.04.1997) и способ получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ (RU 2055896, С 12 Р 21/00, 03.10.1996). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315 имеет молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирует гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ с молекулярной массой 20,46 кДа и состоит из: фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ и терминатор транскрипции фага λ, а также имеет генетический маркер селекции, ген β-лактамазы, придающий устойчивость к антибиотику ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy315.

Недостатком плазмиды pThy315 является то, что использование в штаммах-продуцентах плазмид, имеющих только маркер ампициллинрезистентности, приводит к недостаточно эффективной селекции. Это связано с тем, что фермент β-лактамаза, расщепляющий ампициллин, является секретируемым белком, то есть через некоторое время культивирования штамма с плазмидой β-лактамаза накапливается в культуральной среде. Это приводит к инактивации как имевшегося в среде, так и добавляемого вновь ампициллина. В результате в ферментере накапливаются клетки штамма, утратившие плазмиду и неспособные синтезировать рекомбинантный белок.

Способ получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, указанный в патенте RU 2055896, включает культивирование штамма Escherichia coli SG20050, трансформированного введением плазмиды pThy315, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка. Культивирование проводят при 36÷38^oС в среде, содержащей 1-1,4% пептона или триптона, 1-1,6% дрожжевого экстракта, 1÷1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина. При этом используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при минус 20÷40^oС в бульоне с 40% глицерина. После лизиса клеток осадок отмывают 1÷3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6÷5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5÷5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0÷8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl, с последующим диализом при рН 7,2÷7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.

Недостатком такого способа получения является использование при хроматографической очистке белка сорбента с иммобилизованным красителем (голубой). Этого типа сорбенты подвергаются в процессе использования частичной деградации, при этом краситель (голубой) отделяется от сорбента и самопроизвольно элюируется с колонки в виде связанного с белком комплекса. Такие примеси недопустимы для приготовления лекарственных препаратов.

Препарат гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ не известен.

Сущность изобретения заключается: 1. В создании рекомбинантной плазмиды, содержащей ген для синтеза в клетках Е. coli рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁. Эта рекомбинантная плазмида отличается от известной pThy315 наличием двух генов устойчивости к антибиотикам ампициллину и аминогликозидам: канамицину, неомицину или G-418. Устойчивость к аминогликозидам обусловливается цитоплазматическим ферментом аминогликозидфосфотрансферазой, который в отличие от β-лактамазы не секретируется в питательную среду при культивировании. Это обеспечивает лучший отбор клеток, сохранивших рекомбинантную плазмиду, и, как следствие, более высокий уровень синтеза гибридного белка и стабильность штамма-продуцента; 2. Плазмида может быть трансформирована в любые штаммы Е. coli, соответствующие требованиям, предъявляемым к штаммам-продуцентам, например SG20050 или BL21.

3. Изобретение включает улучшенный способ получения рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, позволяющий получать чистый белок без посторонних примесей. Способ предусматривает хроматографию на гидроксилаппатите, как безопасном сорбенте, вместо хроматографии на сорбенте с иммобилизованным красителем (голубой).

4. Изобретение также включает сухой препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, состоящий из этого гибридного белка, наполнителя и соли. В качестве наполнителя используется шестиатомный спирт, относящийся к сахарам, маннит (маннитол). Это низкомолекулярное вещество не вызывает аллергических и токсических реакций и используется в медицине в виде гипертонических (15%) растворов в качестве диуретика.

Для создания рекомбинантной плазмиды с двумя генами антибиотикорезистентности к ампициллину и аминогликозидам использовали плазмиды pVE10 и pUC4K. Плазмида pVE10 является делеционной производной от pBR322, имеет размер 1,8 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), уникальные сайты EcoRI, ClaI, PstI и содержит участок начала репликации и ген β-лактамазы [Шмелев В.А. и др., Молек. Генет. Микроб. Вирусол. - 1991, 10, с.3÷8]. Плазмида pUC4K (GenBank Accession Number X06404) имеет размер около 4 т.п.н. и содержит фрагмент Тп:: 903, фланкированный инвертированными повторами сайтов EcoRI, BamHI, SailI и PstI. В этом фрагменте находится ген аминогликозидфосфотрансферазы, придающий клеткам устойчивость к антибиотикам канамицину, неомицину и G-418. Ген аминогликозидфосфотрансферазы с собственным промотором был амплифицирован 30 циклами (92^oС, 30 сек; 60^oС, 45 сек; 72^oС, 45 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: TTCGAACAAAGCCACGTTGTGTCTC и GAATTCCGTCAAGTCAGCGTAATGC. Амплифицированный фрагмент размером 1 т. п.н. был обработан рестриктазами Bspll9I и EcoRI и лигирован с плазмидой pVE10, предварительно обработанной рестриктазами ClaI и EcoRI. После трансформации в штамм Е. coli НВ2151 отобраны рекомбинантные плазмиды, придающие клеткам устойчивость к ампициллину и канамицину. Полученная плазмида рАК1 имеет размер 2,8 т.п.н., ген β-лактамазы с уникальным сайтом PstI, ген аминогликозидфосфотрансферазы с уникальными сайтами XhoI, ClaI, SmaI, HindIII и уникальный сайт вне генов EcoRI.

Для переклонирования в эту плазмиду системы экспрессии с геном гибридного белка из плазмиды pThy315 фрагмент ДНК был амплифицирован 30 циклами (92^oС, 30 сек; 62^oС, 45 сек; 72^oС, 45 сек) с помощью Tag-полимеразы и праймеров: CAATTGTAGACAGCCTGATAAGTCG и CAATTGACCGAAACGCGCGAGGCAG. Амплифицированный фрагмент размером 0,93 т.п.н. был обработан рестриктазой MunI и лигирован с плазмидой рАК1, предварительно обработанной рестриктазой EcoRI и дефосфорилированной. После трансформации в штамм Е. coli HB2151 отобраны клоны рекомбинантной ДНК, придающей клеткам устойчивость к ампициллину и канамицину и содержащей не вырезающуюся вставку в EcoRI-сайт.

Полученная плазмида pThy316 характеризуется следующими признаками: - размер 3,77 т.п.н.; - придает клеткам устойчивость к антибиотикам ампициллину и аминогликозидам (канамицину, неомицину или G-418); - содержит промоторы А2 и A3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁; - содержит между сайтами рестриктаз ClaI и XbaI ген, кодирующий гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁; - имеет характерные сайты рестрикции:
1 PstI-сайт, который находится в гене β-лактамазы;
3 ClaI-сайта, из которых 1 находится в гене аминогликозидфосфотрансферазы, 1 между рибосомсвязывающим сайтом и геном α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ и 1 в гене α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁;
уникальные сайты - XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы;
EcoRI, находящийся между промоторами А2 и A3;
KpnI, находящийся между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом;
2 XbaI-сайта, ограничивающие терминаторы транскрипции.

Полученная плазмида pThy316 после трансформации в компетентные клетки штаммов Е. coli обеспечивает высокий уровень биосинтеза гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, определяемый электрофорезом в 15%-ном ПААГ-ДСН. Трансформируемым штаммом может быть любой штамм Е. coli, соответствующий требованиям к штаммам-продуцентам, например штамм SG20050, имеющий lon-мутацию, или BL21, имеющий lon- и оmрТ-мутации по генам протеаз, и позволяющие получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.

Способ получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ включает:
- трансформацию подходящего штамма Е. coli плазмидой pThy316,
- культивирование клеток трансформированного штамма в жидкой среде,
- лизис клеток и отмывка агрегированного белка,
- растворение гибридного белка в 7 М растворе мочевины,
- хроматографию на анионообменнике и гидроксилаппатите.

Трансформация штамма Е. coli плазмидой pThy316.

Выращивают штамм Е. coli SG20050 или BL21 при 37^oС в течение ночи в 5 мл L-бульона, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Разводят культуру свежим L-бульона в 50-100 раз и растят на качалке при 37^oС до оптической плотности при 590 нм, равной 0,2-0,3. Если оптическая плотность более 0,3, культуру разводят свежим L-бульона до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4^oС 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 мин на льду. Осаждают клетки 10 мин при 5000 об./мин, 4^oС. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl₂, охлажденного на льду. К компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки для трансформации до трех месяцев при температуре минус 70^oС. Переносят 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавляют 5-10 мкг плазмидной ДНК pThy316. Инкубируют на льду 1 ч. Переносят пробирку на 42^oС и выдерживают 5 мин. Переносят клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37^oС L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37^oС в течение 1-1,5 ч. Затем клетки или используют непосредственно для засева в ферментер (лучше для штамма SG20050, трансформированного плазмидой pThy316) или высевают на L-агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина.

Культивирование клеток трансформированного штамма.

Подготавливают 7 л L-бульона с 50 мкг/мл канамицина и заполняют ферментер вместимостью 10 л. Прогревают ферментер до температуры 37^oС и вносят посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформантов. Культивируют клетки при температуре 37^oС, рН 7,3 и p0₂ 60% до оптической плотности 4 ОЕ при длине волны 590 нм, затем культуру переносят в ферментер объемом 100 л, содержащий 60 л L-бульона с 50 мкг/мл канамицина. Продолжают культивирование при температуре 37^oС, поддерживают величину рН7,0-7,2 до оптической плотности культуры 4 ОЕ при длине волны 590 нм и затем понижают рН до 5,8-6,0 до конца процесса культивирования. р0₂ поддерживают 60-70% от насыщения до оптической плотности культуры 4 ОЕ и 40% до конца процесса. Накопление α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ в виде "телец включений" контролируют с помощью фазово-контрастного микроскопа. Процесс культивирования завершают через 1 час после достижения стационарной фазы роста. Берут пробу для определения уровня синтеза гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α_1/ методом электрофореза в 15% ПААГ-ДСН. Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией и замораживают при температуре минус 70^oС.

Лизис клеток и отмывка агрегированного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁.
Клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Клетки разрушают каким-либо способом (например, замораживанием-оттаиванием, или импульсами ультразвука три раза по 1 мин, или продавливанием в замороженном состоянии через фильеру в French-прессе или Х-прессе). Лизат центрифугируют 10 мин при 4^oС, 5000 g. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют раствор 1 М мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок суспендируют в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторяют центрифугирование. Супернатант сливают, осадок растворяют в буфере, содержащем 10 мМ трис-НСl рН 7,5 и 7 М мочевины, того же объема. Повторяют центрифугирование. Надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ около 60-70%-ной электрофоретической чистоты.

Хроматографическая очистка гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁.
Полученный мочевинный раствор гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ наносят на хроматографическую колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенной буфером, содержащим 7 М мочевины и 10 мМ трис-НСl рН 7,5. Сразу после нанесения белка колонку промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии оптической плотности. Гибридный белок элюируют буфером, содержащим 7 М мочевины, 10 мМ трис-НСl рН 7,5 и градиент концентрации от 0 до 1 М натрия хлористого. Фракции, содержащие гибридный белок, контролируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с окрашиванием геля красителем кумасси G-250 и затем наносят на колонку с гидроксилаппатитом.

Гидроксилаппатит уравновешивают 20 мМ натрий фосфатным буфером рН 6,8 с 7 М мочевиной. Колонку после нанесения белка промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии оптической плотности. Гибридный белок элюируют градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,8 с 7 М мочевиной. Фракции, содержащие гибридный белок, контролируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с окрашиванием геля красителем кумасси G-250 и наносят на колонку с Сефадекс G-50.

Хроматографию на Сефадекс G-50, уравновешенном 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, выполняют для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка.

После очистки определяют удельную биологическую активность в тесте цитотоксичности на клетках фибросаркомы мыши L929 с актиномицином D. Получают гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ не менее 95%-ной электрофоретической чистоты, с отношением величины оптической плотности раствора 280/254 нм более 2,1 и удельной биологической активностью 2•10⁶ ME на мг белка.

Препарат гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁.
Очищенный α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ стерилизуют микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и используют для приготовления сухого стабильного при хранении препарата. Препарат получают путем смешивания раствора очищенного гибридного белка с 15%-ным стерильным раствором маннита и физиологическим раствором (150 мМ натрия хлористого). Состав препарата включает в расчете на одну дозу: α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ 15, 25 или 50 мкг (30000, 50000 и 100000 ME, соответственно), маннита 1,2-1,5%, физиологического раствора до 1 мл.

Полученный раствор разливают в ампулы или флаконы по 1 мл и замораживают при температуре -40^oС. Режим лиофилизации включает высушивание в течение 2 часов при температуре -40^oС, далее при постепенном повышении температуры со скоростью 2,5^oС в час и досушивание при 30^oС в течение 6-8 ч до остаточной влажности 2-5%. Полученный сухой препарат представляет собой таблетку белого цвета, растворяется в воде для инъекций в течение нескольких секунд с образованием прозрачного бесцветного или слегка желтоватого раствора.

При проверке цитотоксической активности препарата на клетках фибросаркомы мыши L929 с актиномицином D, ее уменьшение составило 10±5% от исходной при хранении в течение 1 года при температуре 4-8^oС.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рThy316 для экспрессии в клетках Escherichia coli гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, имеющая размер 3,77 т.п.н. и содержащая промоторы А2 и А3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁; расположенный после промотора А3 рибосомосвязывающий сайт; ген, кодирующий гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, заключенный между сайтами рестрикции XbaI и ClaI и включающий второй сайт рестрикции ClaI; следующую за геном гибридного белка и ограниченную двумя сайтами рестрикции XbaI терминаторную область; ген устойчивости к ампицилину; ген устойчивости к аминогликозидам (канамицину, неомицину и G-418), содержащий третий сайт рестрикции ClaI; а также уникальные сайты рестрикции: PstI в гене β-лактамазы; XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы; KpnI между промотором А3 и рибосомсвязывающим сайтом; EcoRI между промоторами А3 и А2.

2. Способ получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, включающий культивирование штамма Esсherichia cоli, трансформированного введением плазмиды, содержащей ген, кодирующий синтез этого гибридного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка, отличающийся тем, что используют плазмиду рThy316, охарактеризованную в п.1, культивирование штамма Escherichia coli проводят с добавлением аминогликозида, а очистку белка осуществляют следующим образом: раствор белка в мочевине наносят на анионообменный сорбент при рН 7,0-8,0 и элюируют при том же рН буфером, содержащим 6-8 М мочевины и градиент концентрации от 0 до 1 М натрия хлористого, затем фракции с гибридным белком наносят на гидроксилапатит, уравновешенный буфером с 6-8 М мочевины при рН 6-7,5, и элюируют белок градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера с рН 6-7,5 в присутствии 6-8 М мочевины, после чего проводят хроматографию на Сефадексе G-50, уравновешенном 100-200 мМ раствором натрия хлористого с 10 мМ натрий фосфатным буфера с рН 7-7,5.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что получают гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ не менее 95%-ной электрофоретической чистоты с отношением величины оптической плотности раствора при 280/254 нм более 2,1 и удельной биологической активностью 2·10⁶ МЕ на мг белка.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что плазмидой рThy316 трансформируют штамм Е.coli, имеющий lon- и/или ompТ-мутации по генам протеаз.

5. Препарат гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, включающий этот гибридный белок и стабилизирующие добавки, отличающийся тем, что содержит гибридный белок, полученный по любому из пп.2-4, а в качестве стабилизирующих добавок маннит и физиологический раствор при следующем содержании компонентов в расчете на одну дозу: гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ от 10000 до 100000 МЕ, 1,2-1,5%-ный маннит и физиологический раствор до 1 мл.