Способ трансформации хлопчатника, способ получения эмбриогенного каллюса (варианты) и вектор

 

Изобретение относится к генетической инженерии растений. Экспланты или каллюсные клетки растений хлопчатника сокультивируют с Agrobacterium при определенных условиях до получения эмбриогенных каллюсных клеток. Трансформация клеток вектором на основе Agrobacterium, содержащим набор необходимых генов, позволяет придать этим клеткам устойчивость к антибиотикам, гербицидам и грибковым патогенам. 4 с. и 11 з.п.ф-лы, 35 ил., 2 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Способ трансформации хлопчатника, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает следующие стадии: (a) взаимодействие эксплантата хлопчатника с вектором на основе Agrobacterium, содержащим экспрессируемый ген, чужеродный по отношению к хлопчатнику, в течение времени, достаточного для переноса указанного гена в клетки эксплантата; (b) инкубирование эксплантата в среде роста каллюса в течение периода времени около 15-200 ч, при температуре около 25-53°С, при цикле: 16 ч - на свету и 8 ч - в темноте; (c) взаимодействие инкубированных эксплантатов со средой роста каллюса, содержащей токсичный для Agrobacterium антибиотик, в течение периода времени, достаточного для лизиса Agrobacterium; (d) культивирование эксплантата, не содержащего Agrobacterium в среде роста каллюса; (e) отбор трансформированного каллюса от нетрансформированного каллюса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополненной средой роста каллюса является среда Мурасиге и Скуга, дополненная около 1-10 мг/л нафталинуксусной кислоты.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что антибиотиком, токсичным для Agrobacterium, является цефотаксим.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает следующие стадии: (a) взаимодействие в течение периода времени около 1 мин - 24 ч сегментов эксплантатов проростка хлопчатника, отобранных из гипокотиля, семядоли и их смесей, с вектором на основе Agrobacterium, содержащим ген, который определяет устойчивость к антибиотику; (b) перенос эксплантатов в среду роста каллюса, которая является средой, дополненной около 1-10 мг/л нафталинуксусной кислоты, на период времени около 15-200 ч, при температуре около 25-35°С, при световом режиме: 16 ч - на свету и 8 ч - в темноте, с целью развития каллюса из эксплантатов; (c) перенос каллюса в свежую среду роста каллюса, содержащую цефотаксим в концентрации, достаточной для лизиса Agrobacterium; (d) культивирование указанного каллюса на свежей среде роста для первичного каллюса; (e) взаимодействие каллюса со свежей средой роста каллюса, дополнительно содержащей цефотаксим для лизиса оставшихся Agrobacterium и антибиотик, к которому трансформированный каллюс является невосприимчивым для отбора каллюса, устойчивого к этому антибиотику.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный трансформированный каллюс до взаимодействия со средой роста каллюса, содержащей цефотаксим, промывают в среде роста каллюса, не содержащей цефотаксим.

6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что указанным антибиотиком для отбора трансформированного каллюса является канамицин.

7. Способ получения трансформированного эмбриогенного каллюса хлопчатника из клеток хлопчатника в суспензионной культуре в среде роста каллюса, отличающийся тем, что после культивирования суспензионной субкультуры проводят стадии: (a) выделение клеток и любого образовавшегося эмбриогенного каллюса из среды роста каллюса; (b) ресуспендирование выделенных клеток и каллюса в среде роста каллюса, содержащей вектор на основе Agrobacterium, содержащий последовательность экспрессируемого гена, чужеродную по отношению к хлопчатнику, при поддержании условий культивирования суспензии в течение периода времени, достаточного для трансформации клеток хлопчатника; (c) выделение суспендированных клеток и каллюса из среды роста каллюса, содержащей Agrobacterium; (d) обработка трансформированных клеток и каллюса антибиотиком, токсичным для Agrobacterium, в целях лизиса Agrobacterium; (e) отбор трансформированных клеток хлопчатника и каллюса от нетрансформированных клеток хлопчатника и эмбриогенных каллюсных клеток; (f) фильтрование суспензии клеток в целях выделения эмбриогенных каллюсов, размер которых превышает 600 мкм.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные клетки и эмбриогенный каллюс по отдельности обрабатывают антибиотиком после фильтрования суспензии.

9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что после фильтрования суспензии проводят отбор трансформированных клеток и каллюса.

10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что токсичным для Agrobacterium антибиотиком является цефотаксим.

11. Способ получения эмбриогенного каллюса хлопчатника из клеток хлопчатника в суспензионной культуре в среде роста каллюса, отличающийся тем, что после стадии культивирования суспензионной субкультуры в течение около 7-14 дней проводят следующие стадии: (a) выделение клеток из среды роста каллюса; (b) ресуспендирование клеток в среде роста каллюса, содержащей вектор на основе Agrobacterium, содержащий последовательность экспрессируемого гена, чужеродную по отношению к хлопчатнику, при поддержании условий культивирования суспензии в течение периода времени, достаточного для трансформации суспендированных клеток; (c) выделение клеток из среды роста каллюса, содержащей Agrobacterium; (d) дополнительное субкультивирование клеток в свежей среде роста каллюса, не содержащей Agrobacterium; (e) фильтрование суспензии для удаления эмбриогенного каллюса размером более 600 мкм; (f) ресуспендирование оставшихся клеток в среде роста каллюса, содержащей антибиотик, который токсичен по отношению к Agrobacterium; (g) обработку эмбриогенного каллюса антибиотиком, который токсичен по отношению к Agrobacterium; (h) отбор трансформированных клеток и эмбриогенного каллюса от нетрансформированных клеток и эмбриогенного каллюса.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный способ предусматривает (a) выделение клетки из среды роста каллюса, содержащей Agrobacterium; (b) промывание клеток в свежей среде роста, не содержащей Agrobacterium, до субкультивирования; (c) дополнительное субкультивирование клеток в свежей среде роста каллюса, не содержащей Agrobacterium, и в которой антибиотиком, токсичным для Agrobacterium, является цефотаксим; (d) взаимодействие оставшихся клеток с антибиотиком, к которому трансформированные клетки нечувствительны, для отбора трансформированных клеток.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что антибиотиком, токсичным для Agrobacterium, является цефотаксим.

14. Вектор для придания растению хлопчатника резистентности к антибиотику, содержащий две правограничные последовательности Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens, способные интегрироваться в геном растений, фланкирующие химерный ген, способный экспрессироваться в хлопчатнике и сообщающий резистентность к канамицину и G418.

15. Вектор по п.14, отличающийся тем, что химерный ген содержит промотор нопалинсинтазы, кодирующую область неомицинфосфотрансферазы II из Тn5 и терминатор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96