Способ определения углеводного состава полифенольного комплекса чаги

 

Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности для определения качества препаратов, основанных на получении водной вытяжки чаги, используемых для лечения желудочно-кишечных заболеваний и в терапии онкологических больных. Способ определения углеводного состава полифенольного комплекса чаги включает гидролиз полифенольного комплекса чаги химическим агентом при повышенной температуре. В качестве химического агента используют 10%-ный водный раствор NaOH, гидролиз проводят при температуре 90±5°С в течение 15 часов, через четыре часа с начала гидролиза каждый час отбирают пробы гидролизата, определяют в них содержание выделившихся углеводов фенолсернокислотным методом, строят графическую зависимость концентрации углеводов от времени гидролиза и вычисляют количество углеводов, входящих в состав полифенольного комплекса, суммируя значения максимумов, найденных по графической зависимости. Достигается упрощение и повышение точности анализа. 1 табл., 2 ил.

Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности для определения качества препаратов, основанных на получении водной вытяжки чаги, таких как Бефунгин, Бин-Чага, Водный экстракт чаги, Сухой экстракт чаги, используемых для лечения желудочно-кишечных заболеваний и в качестве симптоматических средств в терапии онкологических больных.

Получение количественных показателей, характеризующих биологическую активность водной вытяжки чаги, представляющей основу перечисленных препаратов, является актуальной задачей, качество перечисленных препаратов в настоящее время оценивается только по содержанию в них полифенольного комплекса.

Для определения связанных углеводов в исследовательской практике применяли кислый гидролиз полифенолов чаги (природных и из культуры чаги), который проводили 2-нормальной соляной кислотой при нагревании с обратным холодильником на водяной бане в течение 5 часов. Редуцирующие сахара определяли с помощью метода Бертрана, их содержание в полифенолах природного происхождения составило 2,00% (в полифенолах из культуры чаги - 5,00%) от первоначального веса комплекса. Общее количество сахаров, содержащихся в гидролизатах полифенолов природного происхождения, не превышало 10,00% (в полифенолах из культуры чаги - 15,16%). При проведении гидролиза в тех же условиях еще в течение 5 часов с помощью хроматографии было показано отсутствие углеводов в полученном гидролизате (2. Шиврина А.Н. и Платонова Е.Г. О полисахаридных комплексах гуминоподобных соединений, образуемых древоразрушающими грибами.//Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. - М.-Л.: Наука, 1966, с.38-41).

Известно проведение гидролиза полифенольного комплекса соляной кислотой в более жестких условиях (1). Гидролиз полифенольного комплекса, полученного из сухого экстракта чаги, проводили 10% соляной кислотой в автоклаве при 1,5 атм и температуре 126°С. Из гидролизата выделялись нейтральные вещества. Затем из нейтральной среды хлороформом извлекали фенолы и кислоты. Далее из нейтральной среды этилацетатом извлекали флавоноиды. В водном слое оставались углеводы. Их количественное определение проводили фенол сернокислотным методом (3. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. - Киев.: Наукова думка, 1982, c.l92; 4. Michel Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, and Fred Smith. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Division of Biochemistry, University of Minnesota, St. Paul, Minn. Analytical chemistry, vol. 28, N0.3, March 1956). Суммарное содержание углеводов в среднем составило 14%.

Недостатком этого способа является сложность проведения гидролиза и подготовки гидролизата для проведения анализа углеводов, а также неоднозначность определения количества связанных углеводов чаги, поскольку вероятна потеря их части при проведении выделения из гидролизата других соединений, входящих в его состав.

Задача изобретения - создание препаративно простого способа определения, наиболее полно отражающего содержание связанных углеводов в полифенольном комплексе, являющемся основным действующим компонентом чаги.

Поставленная задача решается разработкой и использованием способа определения углеводного состава полифенольного комплекса чаги, включающего гидролиз полифенольного комплекса чаги химическим агентом при повышенной температуре. Причем в качестве химического агента используют 10%-ный водный раствор NaOH, гидролиз проводят при температуре 90±5°С в течение 15 часов, через четыре часа с начала гидролиза каждый час отбирают пробы гидролизата, определяют в них содержание выделившихся углеводов фенолсернокислотным методом, строят графическую зависимость концентрации углеводов от времени гидролиза и вычисляют количество углеводов, входящих в состав полифенольного комплекса, суммируя значения максимумов, найденных по графической зависимости.

На фиг.1 приведена графическая зависимость определения содержания углеводов в гидролизатах полифенольного комплекса чаги от времени гидролиза (гидролиз 10%-ным NaOH). На фиг.2 представлена зависимость содержания углеводов в гидролизатах ПФК чаги от времени гидролиза с использованием различных концентраций гидролизующего агента.

Способ осуществляют следующим образом. Из полученной методом реперколяции водной вытяжки гриба чаги выделяют полифенольный комплекс, подкисляя ее 25% соляной кислотой до рН 2-2,5. Полифенольный комплекс фильтруют и сушат на воздухе при комнатной температуре. Затем растирают в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. Навеску полифенольного комплекса массой 0,28 г растворяют в 100 мл 10% NaOH. 25 мл полученного раствора помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, снабженную обратным холодильником. Затем в течение 15 часов проводят щелочной гидролиз, поддерживая температуру водяной бани 90±5°С. Пробы гидролизата отбирают каждый час, начиная с 4 часов с начала гидролиза.

Первый интервал отбора проб - 4, 5, 6 часов - дает первый максимум значений; второй интервал - 12, 13, 14, 15 часов - второй максимум на кривой выделения углеводного компонента, что соответствует выделению полисахаридов, освобождающихся при гидролизе из структуры полифенольного комплекса. Их анализ возможен только фенолсернокислотным методом, который позволяет определять количественное содержание углеводов, в том числе и полисахаридов (3, 4).

Полученные значения максимального выделения углеводов на протяжении указанных интервалов суммируют и получают количество связанных углеводов, входящих в состав полифенольного комплекса.

Как видно на фиг.1, выделение углеводов из полифенольного комплекса по ходу гидролиза имеет два максимума. Причем нами показано, что применение гидролизующего агента - щелочи - именно в концентрации 10% позволяет эффективно проводить гидролиз полифенольного комплекса с выделением из его состава в гидролизат двух полисахаридов, что проиллюстрировано на фиг.2 (содержание углеводов в гидролизатах ПФК чаги). При применении NaOH в более низкой концентрации гидролиз полифенольного комплекса идет медленнее и полисахариды, высвобождаясь из полифенольного комплекса, подвергаются гидролизу, поэтому не имеют четко выраженных максимумов по сравнению с кривой, приведенной на фиг.1. Использование более высокой концентрации NaOH (45%) приводит к еще большему разрушению как полифенольного комплекса, так и выделяющихся полисахаридов, поэтому максимумов на этой зависимости не наблюдается.

При проведении гидролиза полифенольного комплекса 10% раствором NaOH первый максимум соответствует выделению из гидролизуемого комплекса полисахарида, "захваченного" полифенольным комплексом из водной вытяжки при его выделении (изменение рН среды водной вытяжки до рН 2), то есть того, который оказался на его периферии. Согласно (5. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. О химическом составе чаги.// Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии./ Под ред. П.К. Булатова, В.И. Долина, П.С. Савельева и др. -Л.: Медгиз, 1959, 334 с. (с.55-61)) в водную вытяжку переходит полисахарид в количестве в среднем около 4% на сухой вес гриба. В то время как редуцирующие сахара в ней определены как следы. В нашем случае анализ водной вытяжки фенолсернокислотным методом показал наличие в ней углеводов 6,7%. Фильтрат после выделения полифенольного комплекса содержит углеводов - 0,7%. Следовательно, при выделении полифенольного комплекса из водной вытяжки им было "захвачено" около 6% углеводов, представленных полисахаридом. При проведении гидролиза комплекса содержание углеводов в пятичасовой пробе, соответствующей первому максимуму, составляет 6,4%.

Второй максимум обусловлен высвобождением полисахарида, входящего в состав полимера нерегулярной структуры, формируемого грибом чагой в процессе его жизнедеятельности на основе лигнина древесины. Этот полисахарид находится в полифенольном комплексе более глубоко, и для его высвобождения требуется более длительный гидролиз, занимающий около 13 часов. Его содержание составляет 10%.

Таким образом, содержание углеводов в полифенольном комплексе складывается из двух составляющих, что отражено на фиг.1, и соответствует 16%, что превышает полученное по прототипу (14%) содержание углеводов в полифенольном комплексе.

По разработанной методике нами было проанализировано семь образцов сырья.

Формула изобретения

Способ определения углеводного состава полифенольного комплекса чаги, включающий гидролиз полифенольного комплекса чаги химическим агентом при повышенной температуре, отличающийся тем, что в качестве химического агента используют 10%-ный водный раствор NaOH, гидролиз проводят при температуре (90±5)°С в течение 15 ч, через четыре часа с начала гидролиза каждый час отбирают пробы гидролизата, определяют в них содержание выделившихся углеводов фенолсернокислотным методом, строят графическую зависимость концентрации углеводов от времени гидролиза и вычисляют количество углеводов, входящих в состав полифенольного комплекса, суммируя значения максимумов, найденных по графической зависимости.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2