Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

 

Изобретение относится к конъюгату гликопротеина эритропоэтина, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп, где Х обозначает -(СН₂)_k- или -СН₂(О-СН₂-СН₂)_k- , k обозначает 1-10, Y обозначает

Средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям, композиции, способу профилактического и/или терапевтического лечения и способу получения коньюгата. Изобретение позволяет получить коньюгаты, отличающиеся более продолжительным временем полужизни в кровотоке и временем сохранения в плазме, пониженным клиренсом и более высокой активностью in vivo. 6 с. и 33 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Предпосылки создания изобретения

Эритропоэз представляет собой процесс образования эритроцитов, который служит для восполнения клеточной деструкции. Эритропоэз представляет собой контролируемый физиологический механизм, в результате которого образуется количество эритроцитов, необходимое для соответствующего насыщения кислородом ткани. Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин (hЕРО) представляет собой состоящий из 165 аминокислот гликопротеин, который продуцируется почкой и является гуморальным плазменным фактором, стимулирующим образование эритроцитов (Carnot P. и Deflandre С., C.R.Acad. Sci. 143: 432 (1906); Erslev A.J., Blood 8: 349 (1953); Reissmann K.R., Blood 5: 372 (1950); Jacobson L.O., Goldwasser E., Freid W. и Pizak L.F., Nature 179: 6331-6334 (1957)). Человеческий ЕРО стимулирует деление и дифференцировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. Человеческий ЕРО проявляет свою биологическую активность посредством связывания с рецепторами на эритоидных предшественниках (Ktantz B.S. (1991) Blood 77: 419). Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин представляет собой присутствующий в плазме в низких концентрациях кислый гликопротеин, стимулирующий восполнение эритроцитов, которые погибают в процессе старения.

Эритропоэтин был получен путем биологического синтеза с использованием методики рекомбинантной ДНК (Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)) и является продуктом клонированного человеческого гена ЕРО, встроенного и экспрессируемого в клетках ткани яичника китайского хомячка (СНО-клетки). Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин сначала транслируют в состоящую из 166 аминокислот кислот (ак) полипептидную цепь, содержащую аргинин в положении 166. В результате посттрансляционной модификаци аргинин в положении 166 расщепляют с помощью карбоксипептидаз. Первичная структура человеческого ЕРО (165 ак) приведена на фиг.1. Первичная структура человеческого ЕРО (166 ак) приведена на фиг.2. Присутствуют два дисульфидных мостика между Cys⁷Cys¹⁶¹ и Cys²⁹-Cys³³ Молекулярная масса полипептидной цепи человеческого ЕРО без фрагментов сахара составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЕРО примерно 40% молекулярной массы приходится на долю углеводных групп (Sasaki П., Bothner В. Dell А. и Fukuda М., J. Biol. Chem. 262: 12059 (1987)).

Поскольку человеческий эритропоэтин играет ключевую роль в образовании эритроцитов, этот гормон может применяться при лечении заболеваний крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов. В клинических условиях ЕРО применяют, например, для лечения анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (Eschbach J.W., Egri J.C., Downing M.R. и др., NEJM 316: 73-78 (1987); Eschbach J.W., Abdulhadi M.H., Browne J.K. и др., Ann. Intern. Med. 111: 992 (1988); Egrie J.C., Eschbach J.W,. McGuire Т., Adamson J.W., Kidney Intl. 33: 262 (1988); Lim V.S., Degowin R.L., Zavala D. и др., Ann. Intern. Med. 110: 108-114 (1989)) и страдающих СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии (Danna R.P., Rudnick S.A., Abels R.I. в: М.В.Garnick (ред.) Erythropoietin in Clinical Application An International Perspective, New York, NY: Marcel Dekker; 1990: стр.301-324). Однако биологическая доступность поступающих в продажу терапевтических средств на основе протеинов, таких как ЕРО, ограничена их коротким временем полужизни в плазме и чувствительностью к разложению протеазами. Эти недостатки препятствуют проявлению их максимальной потенциальной активности в клинических условиях.

Краткое изложение сущности изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к новому классу ПЭГилированых производных эритропоэтина. Физиологически активные конъюгаты ПЭГ-ЕРО по изобретению включают гликопротеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбранный из группы. включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют первичную последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(О)-X-S-Y, при этом С(О)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп, Х обозначает - (CH₂)_k или -CH₂(О-CH₂-CH₂)_k-, где k равно 1-10, Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа. Изобретение также относится к композициям, содержащим приведенные в настоящем описании конъюгаты, при этом процентное содержание конъюгатов в композиции, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%.

По сравнению с немодицированным ЕРО (т.е. ЕРО без присоединенного ПЭГ) и обычными конъюгатами ПЭГ-ЕРО конъюгаты по настоящему изобретению отличаются более продолжительным временем полужизни в кровотоке и временем сохранения в плазме, пониженным клиренсом и более высокой активностью, проявляемой in vivo в клинических условиях. Конъюгаты по изобретению могут применяться в таких же целях, что и ЕРО. В частности, конъюгаты по изобретению могут применяться для лечения пациентов, стимулируя деление и дифферецировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге, аналогично тому как используют для лечения пациентов ЕРО.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения анемии у человека. Изобретение также относится к способу получения продуктов, включающих гликопротеин эритропоэтин, который предусматривает ковалентное взаимодействие ε-аминогруппы лизина протеина эритропоэтина с бифункциональным реагентом с получением промежуточного продукта с амидной связью. Бифункциональный реагент содержит реакционноспособную группу и защищенную тиольную группу. Промежуточный продукт с амидной связью затем подвергают ковалентному взаимодействию с активированным полиэтиленгликольным производным с получением продуктов по настоящему изобретению, включающих гликопротеин эритропоэтин.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - первичная структура человеческого ЕРО (165 аминокислот).

Фиг.2 - первичная структура человеческого ЕРО (166 аминокислот).

Фиг.3 - активность in vivo ПЭГилированного ЕРО, определенная с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей (мышей с нормоцитами (зрелыми эритроцитами)).

Подробное описание изобретения

Определения

Понятие "протеин эритропоэтин", "эритропоэтин", "ЕРО" или "гликопротеин эритропоэтин" относится к гликопротеину, имеющему последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1) или фиг.2 (SEQ ID NО:2), или к протеину или полипептиду, практически гомологичным им, биологические свойства которого связаны со стимуляцией производства эритроцитов и стимуляцией деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. В контексте настоящего описания понятие протеин ЕРО включает такие протеины, которые модифицированы преднамеренно, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза, или в результате случайных мутаций. Эти понятия также включают аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце протеина, причем дополнительная(ые) аминокислота(ы) включает(ют) по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования, например, аналоги, которые описаны в ЕР-А 640619. Эти понятия включают как имеющий естественное происхождение, так и полученный рекомбинантным путем человеческий эритропоэтин.

Понятие "практически гомологичная" относится к конкретной рассматриваемой последовательности, например, мутантной последовательности, отличающейся от последовательности, с которой проводится сравнение, наличием одной или нескольких замен, делеций или добавлений, "чистое" воздействие которых не приводит к неблагоприятному функциональному различию между рассматриваемой последовательностью и последовательностью, с которой проводится сравнение. Для целей настоящего изобретения последовательности, гомологичные более чем на 95%, обладающие эквивалентными биологическими свойствами и эквивалентными характеристиками экспрессии, рассматриваются как практически гомологичные. С целью оценки гомологии укорочением мутантной последовательности следует пренебрегать. Последовательности, имеющие меньшие степени гомологии, сопоставимые по биологической активности и имеющие эквивалентные характеристики экспрессии, считаются практически эквивалентными,

Понятие "фрагмент" протеина ЕРО обозначает любой протеин или полипептид, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности части или фрагмента протеина ЕРО, и который обладает биологической активностью ЕРО. Фрагменты включают протеины или полипептиды, полученные в результате протеолитического расщепления протеина ЕРО или с помощью общепринятых методов химического синтеза. Протеин ЕРО или его фрагмент являются "биологически активными", если введение протеина или фрагмента человеку приводит к стимуляции производства эритроцитов и стимуляции деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. Определение биологической активности протеина ЕРО осуществляют с помощью общепринятых хорошо известных в данной области тестов, с использованием для этих целей одного или разных видов млекопитающих. Ниже приведен приемлемый тест, который может применяться для демонстрации биологической активности.

Понятие "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, которое необходимо для проявления биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства клетками костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов. Точное количество продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, предпочтительно определяется такими факторами, как конкретный тип заболевания, подлежащего лечению, состояние пациента, подвергаемого лечению, а также другими ингредиентами в композиции. Фармацевтические композиции, которые содержат продукт, включающий гликопротеин эритропоэтин, могут иметь форму, которая обладает высокой эффективностью при введении различными путями больному человеку, страдающему заболеваниями крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов. Средние терапевтически эффективные количества продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, могут варьироваться и, в частности, должны основываться на рекомендациях и предписаниях квалифицированного лечащего врача.

Настоящее изобретение относится к продуктам, включающим гликопротеин эритропоэтин, которые обладают биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства клетками костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов, которые представлены формулой 1:

где X и Y имеют указанные выше значения, m равно от примерно 450 до примерно 900; n равно 1-3; R обозначает (низш.)алкил и Р обозначает гликопротеин эритропоэтин без аминогруппы или аминогрупп, которая(ые) образует(ют) амидную связь с X. Как будет описано ниже, получение и очистка ЕРО хорошо известны в данной области. Под ЕРО подразумевают встречающийся в естественных условиях или рекомбинантный протеин, предпочтительно человеческий, полученный из любого обычного источника, такого как ткани, культуры встречающихся в естественных условиях или рекомбинантных клеток, а также в результате синтеза протеинов. Под это понятие подпадают любые протеины, обладающие активностью ЕРО, такие как мутеины или другим путем модифицированные протеины. Рекомбинантный ЕРО можно получать путем экспрессии в клетках линии СНО, ВНК или HeLa с использованием метода рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена, т.е. когда экспрессия гликопротеина эритропоэтина происходит в результате эндогенной активации гена. Предпочтительными видами ЕРО для получения продуктов, включающих гликопротеин эритропоэтин, являются виды человеческого ЕРО. Более предпочтительно виды ЕРО представляют собой человеческий ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1) или на фиг.2 (SEQ ID NО:2), наиболее предпочтительно аминокислотную последовательность человеческого ЕРО, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1).

Человеческий протеина эритропоэтин также можно модифицировать, вводя по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования, например, 1-6 дополнительных сайтов гликозилирования, в результате они имеют представленные ниже аминокислотные последовательности (но не ограничены ими). Приведенными ниже условными обозначениями показано, что представленная на фиг.1 последовательность модифицирована заменой нативной аминокислоты в обозначенном верхним индексом положении на аминокислоту, указанную слева от верхнего индекса.

Asn³⁰Thr³² фиг.1;

Asn⁵¹Thr⁵³ фиг.1;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹ фиг.1;

Asn⁶⁹ фиг.1;

Asn⁶⁹Thr⁷¹ фиг.1;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹ фиг.1;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷ Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Gly⁸⁹ Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²фиг.1;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asr⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ фиг.1;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸ фиг.1;

Аsn¹³⁸Тbr¹⁴⁰ фиг.1;

Thr¹²⁵ фиг.1 и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵ фиг.1.

Человеческий протеин эритропоэтин также может являться аналогом, имеющим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, т.е. гликопротеин имеет последовательность, включающую последовательность человеческого эритропоэтина и вторую последовательность на карбоксильном конце последовательности человеческого эритропоэтина, причем вторая последовательность содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования.

Дополнительная аминокислотная последовательность может включать пептидный фрагмент, полученный из карбоксильного конца человеческого относящегося к хориону гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей (а) человеческий эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIle LeuProGln (SEQ ID NО:3), простирающуюся от карбоксильного конца; (б) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; и (в) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Аsn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

Человеческий протеин эритропоэтин также может являться аналогом, имеющим аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Перегруппировка может представлять собой делецию любого их N-связанных углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление N-связанного углеводного сайта в положение 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO и Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Аналоги эритропоэтина с дополнительными сайтами гликозилирования описаны в ЕР-А 640619, на имя Elliot, опубликованной 1 марта 1995 г., содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В формуле 1 R может обозначать любой (низш.)алкил, который имеет линейную или разветвленную алкильную группу, включающую от 1 до 6 атомов углерода, такой как метил, этил, изопропил т.д. Предпочтительным алкилом является метил.

В формуле 1 Х обозначает -(CH₂)_kили -CH₂(О-CH₂-CH₂)_k-, где k обозначает от 1 до примерно 10. Предпочтительно k обозначает от 1 до примерно 4, более предпочтительно k обозначает 1 или 2. Наиболее предпочтительно Х обозначает (CH₂).

В формуле 1 Y обозначает

Предпочтительно Y обозначает

Наиболее предпочтительно Y обозначает

В формуле 1 значение m выбирают таким образом, чтобы образовавшийся конъюгат формулы 1 имел физиологическую активность, сопоставимую с активностью немодицированного ЕРО, указанная активность может быть такой же, более высокой или составлять только часть активности немодифицированного ЕРО. “m” обозначает количество этиленоксидных звеньев в ПЭГ-фрагменте. Одна субъединица ПЭГ, т.е. -(ОСН₂СН₂)-, имеет молекулярную массу примерно 44 Да. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (включая молекулярную массу ЕРО) зависит от величины m. Понятие "примерно" по отношению к молекулярной массе обозначает определенные значения, которые находятся в приемлемом диапазоне значений этой величины при определении с использованием общепринятых аналитических методов, "m" обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900 (что соответствует молекулярной массе от 20 до 40 кДа), предпочтительно от примерно 550 до примерно 800 (что соответствует молекулярной массе примерно от 24 до 35 кДа) и наиболее предпочтительно "m" имеет значение от примерно 650 до примерно 700 (что соответствует молекулярной массе примерно от 29 до 31 кДа).

В формуле 1 "n" обозначает количество ε-аминогрупп аминокислоты лизина в протеине эритропоэтине, ковалентно связанных с ПЭГ через амидную связь. Конъюгат по изобретению может иметь одну, две или три ПЭГ-группы на молекулу ЕРО. "n" обозначает целое число, находящееся в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно "n" обозначает 1 или 2 и более предпочтительно "n" обозначает 1.

Предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулами:

где Р, R, X, m и n имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты, представлены формулой:

где Р, R, X, m и n имеют указанные выше значения.

Другие предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулами:

где Р и n имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулой:

где Р и n имеют указанные выше значения.

Предпочтительными являются соединения, в которых Х обозначает -(CH₂)_k-, предпочтительно соединения, в которых k обозначает от 1 до 4, наиболее предпочтительно соединения, в которых Х обозначает -(CH₂)-.

Изобретение также относится к описанным выше конъюгатам, в которых m обозначает целое число от 550 до 800, предпочтительно m обозначает целое число от 650 до 700.

Предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения, в которых n равно 1 и/или R обозначает метил.

Кроме того, изобретение относится к соединениям, в которых средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 24 до примерно 35 кДа, более предпочтительно примерно до 30 кДа.

Кроме того, изобретение относится к соединениям, в которых гликопротеин ковалентно связан с одним или двумя блокированными (низш.)алкоксигруппами поли(этиленгликольными) фрагментами, предпочтительно с одним блокированным (низш.)алкоксигруппой поли(этиленгликольным) фрагментом.

В предпочтительном варианте поли(этиленгликольные) фрагменты блокированы метоксигруппой.

Согласно наиболее предпочтительнму варианту осуществления изобретение относится к указанным выше соединениям, в которых Х обозначает -(СН₂)-, m обозначает целое число от 650 до 700, n равно 1, R обозначает метил и средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 30 кДа.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения анемии у человека, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества включающего гликопротеин эритропоэтин продукта формулы 1.

Следующим объектом изобретения является способ получения включающего гликопротеин эритропоэтин продукта, который обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, который предусматривает следующие стадии:

(а) ковалентное взаимодействие ε-аминогруппы лизина протеина эритропоэтина, представленного формулой P-[NH₂]_n, с бифункциональным реагентом, представленным формулой Z-CO-X-S-Q, с получением промежуточного продукта с амидной связью, представленного формулой:

P-[NH-CO-X-S-Q]_n,

где Р обозначает протеин эритропоэтин, не содержщий аминогрупы, образующей амидную связь; n обозначает целое число от 1 до 3; Z обозначает реакционно-способную группу, например, NHS-эфиры карбоновой кислоты; Х обозначает - (СН₂)_k, или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k обозначает от 1 до примерно 10; и Q обозначает защитную группу типа алканоила, например ацетил;

(б) ковалентное взаимодействие промежуточного продукта с амидной связью, полученного на стадии (а), с активированным полиэтиленгликольным производным, представленным формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR, с получением включающего гликопротеин эритропоэтин продукта, представленного формулой

где W обозначает сульфгидрильную реакционноспособную форму Y; m обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900; R обозначает (низш.)алкил; и Y обозначает

Согласно этому варианту бифункциональный реагент предпочтительно представляет собой N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат, Z предпочтительно обозначает N-гидроксисукцинимид, а активированное полиэтиленгликольное производное W-[OCH₂CH₂]_m-OR предпочтительно выбирают из группы, включающей йодаце-тилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфон и метокси-ПЭГ-малеимид.

Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая конъюгаты, при этом каждый из конъюгатов, включает гликопротеин эритропоэтин, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбран из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или путем перегруппировки по меньшей мере одного сайта гликозилирования; и гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп,

Х обозначает -(CH₂)_k или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-,

k равно 1-10,

Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа, и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа; и процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%. Предпочтительной указанной выше содержащей конъюгаты композицией является композиция, в которой процентное содержание конъюгатов, для которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%, более предпочтительно в которой процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 92% и еще более предпочтительно в которой процентное содержание конъгогатов, для которых n равно 1, составляет по меньшей мере 96%, и наиболее предпочтительно в которой процентное содержание конъюгатов, для которых n равно I, составляет от 90 до 96%.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей конъюгат или композицию, как они описаны выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент, и к применению конъюгата или композиции, как они определены выше, для приготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения или профилактики болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии. Кроме того, изобретение относится к способу профилактического и/или терапевтического лечения нарушений, включающих анемию у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии, предусматривающей стадию введения пациенту композиции, как она описана выше.

Изобретение также относится к способу получения описанных выше конъюгатов или композиции, который предусматривает ковалентное связывание тиольных групп с гликопротеином эритропоэтином и сочетание образовавшегося активированного гликопротеина эритропоэтина с поли(этиленгликольным) (ПЭГ) производным. Кроме того, изобретение относится к конъюгатам и композициям, как они определены выше, полученным с помощью любого из описанных выше способов, и к конъюгатам и композициям, как они определены выше, предназначенным для лечения болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии.

Методы экспрессии ЕРО-протеинов

Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой человеческий гликопротеин, который стимулирует образование эритроцитов. Его получение и терапевтическое применение подробно описано, например, в патентах США 5547933 и 5621080, ЕР-В 0148605, у Huang S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712 (1984), ЕР-В 0205564, ЕР-В 0209539 и ЕР-В 0411678, а также у Lai Р.Н. и др., J.Вiol.Chem. 261 3116-3121 (1986), Sasaki Н. и др., J.Biol.Chem. 262 12059-12076 (1987). Эритропоэтин для терапевтических целей можно получать методами рекомбинации (ЕР-В 0148605, ЕР-В 0209539 и у Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)). Экспрессия протеинов, включая ЕРО, с помощью эндогенной активации гена хорошо известна в данной области и описана, например, в патентах США 5733761, 5641670 и 5733746 и опубликованных международных заявках на патент WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждого документа включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Методы экспрессии и получения эритропоэтина в бессывороточной среде описаны, например, в WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996 г. и в ЕР-А 513738, на имя Koch, опубликованной 12 июня 1992 г.

Методы очистки человеческого ЕРО-протеина

Кроме методов, описанных в указанных выше публикациях, также известно, что в бессывороточной среде можно осуществлять ферментацию рекомбинантных СНО-клеток, которые содержат ген ЕРО. Такие методы описаны, например, в ЕР-А 0513738, ЕР-А 0267678 и в общей форме у Kawamoto Т. и др., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, ЕР-А 0248656, у Kowar J. и Franek F. Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister В., Expcology 271 (1981) 45-51, ЕР-А 0481791, ЕР-А 0307247, ЕР-А 0343635, WO 88/00967.

В ЕР-А 0267678 описано применение ионообменной хроматографии на S-сефарозе, препаративной хроматографии ЖХВР с обращенной фазой на колонке С₈ и гель-фильтрации для очистки ЕРО, полученного в бессывороточной культуре после диализа. В этом контексте стадию гель-фильтрации можно заменять ионообменной хроматографией с высокой скоростью потока на S-сефарозе. Также предлагается перед ионообменной хроматографией осуществлять хроматографию с красителем на колонке типа Blue Trisacryl.

Метод очистки рекомбинантного ЕРО описан у Nobuo I. и др., J.Biochem. 107 352-359 (1990). Согласно этому методу перед стадиями очистки ЕРО обрабатывают раствором Tween®20, фенилметилсульфонилфторидом, этилмалеимидом, пепстатином А, сульфатом меди и оксаминовой кислотой.

В некоторых публикациях, включая WO 96/35718 на имя Burg, опубликованную 14 ноября 1996 г., описан метод получения эритропоэтина путем ферментации в бессывороточной среде (EPOsf). Ниже в качестве примера описан один из способов получения ЕРО, который является исходным продуктом для ПЭГилирования.

Биологический анализ для определения удельной активности ЕРО и включающих ЕРО конъюгатов

Удельную активность ЕРО или включающих ЕРО конъюгатов согласно настоящему изобретению можно определять различными известными в данной области методами. Биологическая активность очищенных ЕРО-протеинов по настоящему изобретению проявляется в том, что при введении ЕРО-протеина путем инъекции больным людям в клетках костного мозга увеличивается производство ретикулоцитов и эритроцитов по сравнению с неподвергавшимися инъекции или контрольными группами людей. Биологическая активность ЕРО-протеинов или их фрагментов, полученных и очищенных согласно настоящему изобретению, можно оценивать с помощью методов, описанных в Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997(2).

Другой биологический метод определения активности ЕРО-протеина, основанный на использовании нормоцитарных мышей, описан в примере 4.

Способы получения ПЭГилированного ЕРО

Способы получения включающих гликопротеин эритропоэтин продуктов, представленных формулой 1, заключается в ковалентном связывании тиольных групп ЕРО ("активация") и сочетании образовавшегося активированного ЕРО с поли(этиленгликольным) (ПЭГ) производным. Первая стадия получения ПЭГилированного ЕРО по настоящему изобретению заключается в ковалентном связывании тиольных групп через NН₂-группы ЕРО. Эту активацию ЕРО осуществляют с помощью бифункциональных реагентов, которые несут защищенную тиольную группу и дополнительную реакционноспособную группу, такую как активированные сложные эфиры (например, сукцинимидиловые эфиры), ангидриды, эфиры сульфоновых кислот, галогениды карбоновых кислот и сульфоновых кислот соответственно. Тиольную группу защищают известными в данной области группами, например ацетильными группами. Эти бифункциональные реагенты обладают способностью взаимодействовать с ε-аминогруппами содержащих лизин аминокислот путем образования амидной связи. Первая стадия реакции приведена ниже:

где ЕРО, n и Х имеют указанные выше значения и Z обозначает реакционноспособную группу, известную в данной области, например, N-гидроксисукцимидный (NHS) заместитель формулы

В предпочтительном варианте активацию ε-аминогрупп лизина осуществляют путем взаимодействия с бифункциональными реагентами, имеющими сукцинимидильный фрагмент. Бифункциональные реагенты могут нести различные вилы спейсеров, например, -(CH₂)_k или -СН₂-(O-СН₂-СН₂-)_k - фрагменты, где k имеет значения от 1 до примерно 10, предпочтительно от 1 до примерно 4 и более предпочтительно 1 или 2 и наиболее предпочтительно 1. Примерами этих реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (SATP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA)

Ацетилтиoaлкилкapбoнoвый-NHS-эфиp типа

NHS-эфир 2-(ацетилтио)(этокси)_k-уксусной кислоты, где k имеет указанные выше значения.

Получение бифункциональных реагентов известно в данной области. Предшественники NHS-эфиров 2-(ацетилтио)(этокси)_k-уксусной кислоты описаны в DE-3924705, а дериватизация ацетилтиосоединения описана у March J. в: Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA имеется в продаже (фирма Molecular Probes, Эуген, штат Орегон, США и фирма Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс).

Количество тиольных групп, которые необходимо добавлять к молекуле ЕРО, можно отобирать путем регулирования параметров реакции, т.е. концентрации протеина (ЕРО) и соотношения протеина/бифункционального реагента. Предпочтительно ЕРО активируют путем ковалентного связывания, используя от 1 до 5 тиольных групп на молекулу ЕРО, предпочтительно от 1,5 до 3 тиольных групп на молекулу ЕРО. Эти диапазоны соответствуют статистическому распределению тиольных групп в популяции ЕРО-протеина.

Реакцию осуществляют, например, в водном растворе буфера, рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный реагент можно добавлять в ДМСО. После завершения реакции, предпочтительно через 30 мин, реакцию прекращают, добавляя лизин. Избыток бифункционального реагента можно удалять с помощью хорошо известных в данной области методов, например, диализом или фильтрацией на колонках. Среднее количество добавленных к ЕРО тиольных групп можно определять фотометрическими методами, описанными, например, у Grasetti D.R. и Murray J.E., J. Appl. Biotechnol., 119, 41-49(1967).

После указанной выше реакции осуществляют ковалентное сочетание активированного полиэтиленгликольного (ПЭГ) производного. Приемлемыми производными ПЭГ являются активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от примерно 20 до примерно 40 кДа, более предпочтительно от примерно 24 до примерно 35 кДа, наиболее предпочтительно примерно 30 кДа.

Активированные производные ПЭГ известны в данной области и, например для ПЭГ-винилсульфона, описаны у Morpurgo М. и др., J.Biocohj. Chem., стр.363 и далее (1996). Для получения соединений формулы 1 можно применять виды ПЭГ с линейной цепью и разветвленной цепью. Примерами реакционноспособных ПЭГ-реагентов являются йодацетилметокси-ПЭГ и метокси-ПЭГ-винилсульфон:

Применение этих активированных йодом соединений известно в данной области и описано, например, у Hermanson G.T. в: Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), стр.147-148.

Наиболее предпочтительно различные виды ПЭГ активируют с помощью малеимида (алкокси-ПЭГ-малеимид), такого как метокси-ПЭГ-малеимид (ММ 30000; фирма Shearwater Polymers Inc.)

Строение алкокси-ПЭГ-малеимида приведено ниже:

где R и m имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительным производным является

где R и m имеют указанные выше значения.

Реакция сочетания с алкокси-ПЭГ-малеимидом протекает после расщепления in situ тиольной защитной группы в водном буферном растворе, например, 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2. Отщепление защитной группы можно осуществлять, например, с помощью гидроксиламина в ДМСО при 25°С, рН 6,2 в течение примерно 90 мин. Для ПЭГ-модификации молярное соотношение активированный ЕРО/алкокси-ПЭГ-малеимид должно составлять от примерно 1:3 до примерно 1:6, предпочтительно 1:4. Реакцию можно прекращать добавлением цистеина и взаимодействием оставшихся тиольных (-SH) групп с N-метилмалеимидом или другими пригодными соединениями, которые могут образовывать дисульфидные мостики. В результате взаимодействия оставшихся активных тиольных групп с защитной группой, такой как N-метилмалеимид, или другой приемлемой защитной группой, гликопротеины ЕРО в конъюгатах по изобретению могут включать такие защитные группы. В целом с помощью описанного процесса можно получать смесь молекул, имеющих различное количество тиольных групп, защищенных различным количеством защитных групп, в зависимости от количества активированных тиольных групп на гликопротеине, которые не конъюгированы с ПЭГ-малеимидом.

В то время как N-метилмалеимид образует аналогичный тип ковалентой связи, когда он используется для блокады оставшихся тиольных групп на ПЭГилированном протеине, присутствие дисульфидных соединений приводит в результате внутримолекулярной реакции обмена сульфид/дисульфид к образованию связанного с образованием дисульфидного мостика блокирующего реагента. Предпочтительными блокирующими реагентами для этого типа реакции блокирования являются окисленный глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. В то время как цистеин не приводит к введению чистого заряда в ПЭГилированный протеин, применение таких блокирующих реагентов, как GSSG или цистамин, приводит к введению дополнительного отрицательного или положительного заряда.

Дополнительную очистку соединений формулы 1, включая разделение моно-, ди и три-ПЭГилированных видов ЕРО, можно осуществлять хорошо известными в данной области методами, например хроматографией на колонках.

Фармацевтические композиции

На основе включающих гликопротеин эритропоэтин продуктов по изобретению с помощью известных в данной области методов могут быть приготовлены пригодные для инъекции фармацевтические композиции в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Например, приемлемые композиции описаны в WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 и WO 99/07401. Среди предпочтительных фармацевтически приемлемых носителей, пригодных для приготовления продуктов по изобретению, можно отметить человеческий сывороточный альбумин, человеческие плазменные протеины и т.д. Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в 10 мМ натрий/калий фосфатном буфере с рН 7, который содержит способствующий поддержанию тоничности агент, например 132 мМ хлорид натрия. Необязательно фармацевтическая композиция может содержать консервант. Фармацевтическая композиция может содержать различные количества эритропоэтина, например 10-1000 мкг/мл, например 50 или 400 мкг.

Лечение болезней крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов

Введение включающих гликопротеин эритропоэтин продуктов по настоящему изобретению приводит к образованию у людей эритроцитов. Таким образом, введение включающих гликопротеин эритропоэтин продуктов пополняет этот ЕРО-протеин, который важен для образования эритроцитов. Фармацевтические композиции, содержащие включающие гликопротеин эритропоэтин продукты, могут иметь форму, которая обладает высокой эффективностью при введении различными путями больному человеку, страдающему болезнями крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов, что является либо самостоятельным заболеванием, либо одним из симптомов состояния или заболевания. Фармацевтические композиции можно вводить путем инъекции, такой как подкожная или внутривенная инъекция. Средние количества продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, могут варьироваться и, в частности, должны основываться на рекомендациях и предписаниях квалифицированного лечащего врача. Точное количество конъюгата предпочтительно определяется такими факторами, как конкретный вид заболевания, подлежащего лечения, состояние пациента, подвергаемого лечению, а также другими ингредиентами композиции. Например, можно вводить от 0,01 до 10 мкг/кг веса тела, предпочтительно от 0,1 до 1 мкг/кг веса тела, например, один раз в неделю.

В данном описании приведены ссылки на различные публикации. Содержание этих публикаций включено в настоящее описание в качестве ссылок с целью более полной характеристики уровня техники.

Ниже изобретение более подробно пояснено на примерах, которые служат только для иллюстрации получения соединений и композиций по изобретению, но не ограничивают его объем.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Ферментация и очистка человеческого ЕРО

а) Получения инокулята и ферментация

Из банка клеток Working Cell Bank, созданного из ЕРО-продуцирующей линии клеток СНО (можно использовать штамм АТСС CRL8695, описанный в ЕР 41167 (фирма Genetic Institute)), берут один флакон из замороженного в газообразной фазе жидкого азота тэнка-хранилища. Клетки переносят в стеклянные вращающиеся колбы и культивируют в забуференной бикарбонатом среде в инкубаторе во влажной атмосфере СO₂. Типичная бессывороточная среда, применяемая для получения инокулята и ферментации, описана в ЕР-А 513738 на имя Koch, опубликованной 12 июня 1992 г. или в WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996 г., например, включает среду DMEM/F12 (например, производящуюся фирмами JRH Biosciences/Hazleton Biologies, Дэнвер, США, порядковый номер 57-736) и дополнительно бикарбонат натрия, L+глутамин, D+глюкозу, рекомбинантный инсулин, селенит натрия, диаминобутан, гидрокортизон, сульфат железа(П), аспарагин, аспарагиновую кислоту, серин и стабилизатор для клеток млекопитающих, такой как, например, поливиниловый спирт, метилцеллюлоза, полидекстран, полиэтиленгликоль, Pluronic F68, увеличивающий объем плазмы полигелин (HEMACCEL®) или поливинилпирролидон (WO 96/35718).

Культуры оценивают с помощью микроскопа в отношении отсутствия загрязняющих микроорганизмов и определяют плотность клеток. Эти тесты проводят на каждой стадии расщепления.

После начального периода роста культуру клеток разбавляют свежей средой до получения исходной плотности клеток и подвергают второму циклу роста. Эту процедуру повторяют до тех пор пока во вращающейся колбе не будет получен объем культуры равный примерно 2 л. После того как получают примерно 12 удвоенных объемов по 1-5 л этой культуры, их используют в качестве инокулята для 10-литрового ферментера, предназначенного для получения инокулята.

Через 3-5 дней культуру в 10-литровом ферментере можно использовать в качестве инокулята для 100-литрового ферментера, предназначенного для получения инокулята.

После культивирования в течение еще 3-5 дней культуру в 100-литровом ферментере можно использовать в качестве инокулята для 1000 л ферментера, предназначенного для получения продукта.

б) Сбор и разделение клеток

Применяют процесс с периодической подпиткой, т.е. после достижения требуемой плотности клеток, примерно 80% культуры собирают. Оставшуюся культуру пополняют свежей культуральной средой и культивируют до следующего сбора. Один цикл получения состоит максимум из 10 последовательных сборов клеток: 9 частичных сборов и 1 полного сбора в конце ферментации. Сборы производят каждые 3-4 дня.

Определенный объем сбора переносят в охлажденный сосуд. Клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией и отбрасывают. Содержащий ЕРО супернатант, полученный на стадии центрифугирования, отдельно фильтруют и собирают во второй охлажденный сосуд. В процессе очистки каждый сбор обрабатывают по отдельности.

Типичный способ очистки ЕРО-протеина описан в WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996 г. Этот способ очистки в качестве примера описан ниже.

а) Хроматография с использованием голубой сефарозы (Blue Sepharose)

Blue Sepharose (фирма Pharmacia) состоит из гранул сефарозы, с поверхностью которых ковалентно связан краситель Cibacron голубой. Поскольку ЕРО более сильно связывается с Blue Sepharose, чем большинство небелковых загрязнителей, некоторые белковые загрязнители и ПВА (поливинилацетат), содержание ЕРО на этой стадии может быть повышено. Элюированаие заполненной Blue Sepharose колонки осуществляют, повышая концентрацию соли, а также значение рН.

Колонку заполняют 80-100 л Blue Sepharose, регенерируют с помощью NaOH и уравновешивают уравновешивающим буфером (хлорид натрия/кальция и ацетат натрия). Загружают полученный из ферментера подкисленный и профильтрованный супернатант. После окончания загрузки колонку промывают сначала буфером, аналогичным уравновешивающему буферу, который содержит более высокую концентрацию хлорида натрия, а затем трис-буфером. Продукт элюируют трис-буфером и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

б) Хроматография с использованием Butyl Toyopearl

Butyl Toyopearl 650 С (фирма Toso Haas) представляет собой матрикс, основой которого является полистирол, с которым ковалентно связаны алифатические бутильные фрагменты. Поскольку ЕРО более сильно связывается с этим гелем, чем большинство загрязнителей и ПВА, он может элюироваться с помощью содержащего изопропанол буфера.

Колонку заполняют 30-40 л Butyl Toyopearl 650 С, регенерируют с помощью NaOH, промывают трис-буфером и уравновешивают с помощью содержащего изопропанол трис-буфера.

Концентрацию изопропанола в элюате, полученном с помощью Blue Sepharose-хроматографии, доводят до концентрации изопропанола в уравновешивающем буфере и загружают в колонку. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером с повышенной концентрацией изопропанола. Продукт элюируют буфером для элюирования (трис-буфер с высокой концентрацией изопропанола) и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

в) Хроматография с использованием гидроксиапатитного ультрагеля (Hydroxyapatite Ultragel)

Hydroxyapatite Ultragel (фирма Biosepra) состоит из гидроксиапатита, включенного в агарозный матрикс с целью улучшения механических свойств. ЕРО обладает низкой аффинностью по отношению к гидроксиапатиту и вследствие этого может элюироваться более низкими концентрациями фосфата, чем белковые загрязнители.

Колонку заполняют 30-40 л Hydroxyapatite Ultragel и регенерируют буфером, содержащим фосфат калия/хлорид кальция и NaOH, а затем трис-буфером. Затем ее уравновешивают трис-буфером с низким содержанием изопропанола и хлорида натрия.

В колонку загружают элюат, полученный с помощью Butyl Toyopearl-хроматографии. Последовательно колонку промывают уравновешивающим буфером и трис-буфером без изопропанола и хлорида натрия. Продукт элюируют трис-буфером с низким содержанием изопропанола и хлорида натрия и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

г) ЖХВР с обращенной фазой на материале Vydac C4

Материал для ЖХВР-ОФ Vydac C4 (фирма Vydac) состоит из частиц сили-кагеля, на поверхности которых находятся С4-алкильные цепи. Отделение ЕРО от белковых загрязнителей основано на различиях в силе гидрофобных взаимодействий. Элюирование осуществляют в градиенте ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте.

Препаративную ЖХВР проводят с использованием колонки из нержавеющей стали (заполненной 2,8-3,2 л силикагеля Vydac C4). Элюат, полученный с помощью Hydroxyapatite Ultragel-хроматографии, подкисляют, добавляя трифторуксусную кислоту, и загружают в колонку, заполненную Vydac C4. Для промывки и элюирования используют градиент ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте. Фракции собирают и немедленно нейтрализуют фосфатным буфером. Собирают содержащие ЕРО фракции, которые соответствуют требованиям IPC.

д) Хроматография с использованием DEAE-Sepharose

Материал DEAE-Sepharose (фирма Pharmacia) состоит из диэтиламино-этильных (DEAE) групп, ковалентно связанных с поверхностью гранул сефаро-зы. Связывание ЕРО с DEAE-группами опосредуется ионными взаимодействиями. Ацетонитрил и трифторуксусную кислоту пропускают через колонку без задержки. После того как эти вещества отмывают, следовые количества загрязнителей удаляют, промывая колонку ацетатным буфером с низким значением рН. Затем колонку промывают нейтральным фосфатным буфером и ЕРО элюируют буфером с повышенной ионной силой.

Колонку заполняют DEAE-Sepharose, предназначенной для хроматографии с высокой скоростью потока. Объем колонки регулируют таким образом, чтобы гарантировать загрузку ЕРО из расчета 3-10 мг ЕРО/мл геля. Колонку промывают водой и уравновешивают буфером (фосфат натрия/калия). Объединенные фракции, полученные после элюирования с использованием ЖХВР, загружают и колонку промывают уравновешивающим буфером. Затем колонку промывают буфером для промывки (натрий-ацетатный буфер), а затем промывают уравновешивающим буфером. После этого ЕРО элюируют из колонки с помощью элюирующего буфера (хлорид натрия, фосфат натрия/калия) и собирают в виде одной фракции в соответствии с основным профилем элюирования.

Элюат, полученный с колонки, заполненной DEAE-Sepharose, доводят до определенной проводимости. Полученную субстанцию для приготовления лекарственного средства фильтруют в стерильных условиях в сосуды из тефлона (Teflon) и хранят при -70°С.

ПРИМЕР 2. Ковалентное связывание тиольных групп с ЕРО

В этом примере описаны результаты определения реакционных условий для ковалентного связывания тиольных групп с ЕРО. Для определения условий различные количества реагента, содержащего заблокированную тиольную группу, в данном случае SATA или SATP (растворенных в ДМСО до 10 мг/мл), добавляют к раствору ЕРО, в данном случае к 1 мл раствора ЕРО с концентрацией 5 мг/мл в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, pH 7,3. Реакционную смесь перемешивают в течение примерно 30 мин (25°С) и реакцию прекращают, добавляя 1М раствор лизина в количестве 1 мМ. Избыточные количества SATA и SATP удаляют путем диализа в противотоке 10 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТК, pH 6,2. После удаления защитной ацетильной группы с помощью гидроксиламина количество тиольных групп, ковалентно связанных с ЕРО, определяют фотометрически с помощью дитиодипиридана согласно методу, описанному у Grasetti D.R. и Murray J.E. в: Appl. Biochem. Biotechnol. 119, стр.41-49 (1967).

В таблице представлены данные о количестве тиольных групп, ковалентно связанных с молекулой ЕРО

ПРИМЕР 3. Модификация активированного ЕРО с помощью метокси-ПЭГ-малеимида

А) Активация ЕРО

100 мг ЕРО, полученного согласно примеру 1 (190000 международных единиц (МЕ)/мг, определено с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей), активируют SATA (молярное соотношение ЕРО:SATA=1/5) согласно методу, описанному в примере 2. Полученный в результате ЕРО ("активированный ЕРО"), несущий ковалентно связанные заблокированные тиольные группы, отделяют от побочных продуктов типа N-гидроксисукцинимида, или непрореагировавшего SATA, путем диализа, согласно методу, описанному в примере 1. Получают раствор, содержащий 4,5 мг/мл активированного ЕРО в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2.

Б) ПЭГилирование активированного ЕРО

380 мг метокси-ПЭГ-малеимида, имеющего, как проиллюстрировано выше, "наиболее предпочтительное" строение (ММ 30000; фирма Shearwater Polymers Inc., Хунствилл (штат Алабама, США)), растворяют в вышеуказанном растворе, содержащем 95 мг активированного ЕРО (4,5 мг/мл в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, рН 6,2). В результате молярное соотношение активированного ЕРО и метокси-ПЭГ-малеимида в растворе составляет 1:4. Добавляя 1 М водный раствор гидроксиламина к 30 мМ, рН 6,2 описанного выше раствора, осуществляют разблокирование ковалентно связанных заблокированных тиольных групп активированного ЕРО. В результате в растворе активированного ЕРО в реакционной смеси находятся свободные тиольные (-SH) группы. После разблокирования тиольных групп немедленно осуществляют реакцию сочетания между активированным ЕРО, теперь уже содержащем свободные тиольные (-SH) группы, и метокси-ПЭГ-малеимидом в течение 90 мин (перемешивание, 25°С). Реакцию сочетания прекращают, добавляя 0,2 М водный раствор цистеина к 2 мМ реакционной смеси. Через 30 мин избыток свободных тиольных групп активированного ЕРО, которые не прореагировали с метокси-ПЭГ-малеимидом, блокируют, добавляя 0,5 М раствор N-метилмалеимида в ДМСО до достижения концентрации 5 мМ. Через 30 мин полученную в результате реакционную смесь, уже содержащую ПЭГилированные виды ЕРО, подвергают диализу в противотоке 10 мМ фосфата калия, рН 7,5 в течение ≥15 ч.

В) Очистка ПЭГилированных видов ЕРО

Для выделения ПЭГилированных видов ЕРО из реакционной смеси осуществляют следующий процесс очистки: 50 мл Q-Sepharose ff-колонку уравновешивают 10 мМ фосфатом калия, рН 7,5. Полученную на стадии Б) реакционную смесь загружают в колонку (скорость потока: 3 объема колонки (ОК)/ч). Для отделения непрореагировавшего метокси-ПЭГ-малеимида колонку промывают 5 OK 10 мМ фосфата калия, рН 7,5. ПЭГилированные виды ЕРО отделяют элюированием повышающимся градиентом соли в 5 OK буфера (10 мМ фосфат калия, рН 7,5) и 5 OK буфера Б (10 мМ фосфат калия, 500 мМ NaCl, рН 7,5) со скоростью потока 3 ОК/ч. Из-за наличия градиента NaCl сначала элюируются ПЭГилированные виды ЕРО (три-, ди- и моно-ПЭГилированные виды ЕРО), а затем неПЭГилированные виды ЕРО. Фракцию элюата, содержащую ПЭГилированные виды ЕРО (три-, ди- и моно-ПЭГилированные виды ЕРО), объединяют и фильтруют (фильтрация в стерильных условиях с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм).

Содержание и чистоту три-, ди- и моно-ПЭГилированных видов ЕРО оценивают с помощью ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси бриллиантовым голубым (Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1970)), а концентрацию протеина определяют при 280 нм согласно закону Бира-Ламберта. Кажущаяся молекулярная масса видов ЕРО, определенная с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза, составляет примерно 68 кДа (моно-ПЭГилированные виды ЕРО), примерно 98 кДа (ди-ПЭГилированные виды ЕРО) и примерно 128 кДа (три-ПЭГилированные виды ЕРО).

Дополнительное разделение три-, ди- и моно-ПЭГилированных видов ЕРО можно осуществлять с помощью хроматографии, например гель-фильтрации (Superdex, pg 200; фирма Pharmacia).

Определение биологической активности in vivo элюата, содержащего три-, ди- и моно-ПЭГилированные виды, осуществляют согласно методу, описанному в примере 4.

ПРИМЕР 4. Активность in vivo ПЭГилированного ЕРО, определенная с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей

Биологический анализ с использованием нормоцитарных мышей известен в данной области (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997(2)), этот метод описан в монографии по эритропоэтину Ph. Eur. BRP. Образцы разбавляют БСА-ЗФР. Нормальным здоровым мышам возрастом 7-15 недель вводят подкожно 0,2 мл ЕРО-фракции, содержащей неПЭГилированный ЕРО или три-, ди- или моно-ПЭГилированный ЕРО, полученный согласно методу, описанному в примере 2. В течение 4 дней, начиная через 72 ч после введения, берут кровь путем пункции хвостовой вены и разбавляют таким образом, чтобы в 1 мл раствора окрашенного 0,15 мкМ акридином оранжевым находился 1 мкл крови. Время окрашивания составляет 3-10 мин. Количество ретикулоцитов определяют микрофлуорометрически с использованием проточного цитометра, анализируя гистограмму флуоресценции красного цвета. Количество ретикулоцитов дано в виде абсолютных величин (на 30000 проанализированных эритроцитов). Представлены данные, полученные для группы, состоящей из 5 мышей каждый день, причем у мышей берут кровь только один раз.

Мышам вводят ЕРО, связанный с метокси-ПЭГ-малеимидом, описанный в примере 3, немодифицированный ЕРО и буферный раствор. Результаты приведены на фиг.3. Результаты свидетельствуют о более высокой активности и пролонгированном времени полужизни ПЭГилированных видов ЕРО, что характеризуется существенным увеличением количества ретикулоцитов и сдвигом максимального количества ретикулоцитов при использовании одной и той же дозы на мышь.

Формула изобретения

1. Конъюгат, который включает гликопротеин эритропоэтин, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования, этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп,

Х обозначает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-,

k обозначает 1-10,

Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составлят примерно 20-40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет примерно 51-175 кДа.

2. Конъюгат по п.1 формулы

где Х и Y имеют значения, указанные в п.1, m равно 450-900; n равно 1-3; R обозначает (низш.)алкил и Р обозначает гликопротеин эритропоэтин без аминогруппы или аминогрупп, которая(ые) образует(ют) амидную связь с X.

3. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов формулы

где Р, R, X, m и n имеют значения, указанные в п.2.

4. Конъюгат по п.1 или 2 формулы

где Р, R, X, m и n имеют значения, указанные в п.2.

5. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где Х обозначает -(СН₂)_k-.

6. Конъюгат по п.5, где k равно 1-4.

7. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где Х обозначает -СН₂-.

8. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где m обозначает целое число от 550 до 800.

9. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где m обозначает целое число от 650 до 700.

10. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где n равно 1.

11. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где R обозначает метил.

12. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 24-35 кДа.

13. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 30 кДа.

14. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где гликопротеин ковалентно связан с одним или двумя заблокированными (низш.)алкоксигруппами поли(этиленгликольными) фрагментами.

15. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где поли(этиленгликольные) фрагменты заблокированы метоксигруппой.

16. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где Х обозначает -CH₂-, m обозначает целое число от 650 до 700, n равно 1, R обозначает метил и средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 30 кДа.

17. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где гликопротеин эритропоэтин представляет собой человеческий эритропоэтин.

18. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где гликопротеин эритропоэтин экспрессируют с помощью эндогенной активации гена.

19. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где гликопротеин эритропоэтин имеет последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NO:1) или на фиг.2 (SEQ ID NO:2).

20. Конъюгат по п.19, где гликопротеин эритропоэтин имеет последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NO:1).

21. Конъюгат по любому из пп.1-16, где гликопротеин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем добавления от 1 до 6 сайтов гликозилирования.

22. Конъюгат по любому из пп.1-6, 8 и 10, где гликопротеин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем модификации, выбранной из группы, включающей

Asn³⁰Thr³²; Asn⁵¹Thr⁵³; Asn⁵⁷Thr⁵⁹; Asn⁶⁹; Asn⁶⁹Thr⁷¹; Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹; Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²; Asn⁶⁹Thг⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹; Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹; Asn¹³⁶Thr¹³⁸; Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰; Thr¹²⁵ и Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

23. Конъюгат по любому из предыдущих пунктов, где гликопротеин имеет последовательность, включающую последовательность человеческого эритропоэтина и вторую последовательность на карбоксильном конце последовательности человеческого эритропоэтина, причем вторая последовательность содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования.

24. Конъюгат по п.23, где вторая последовательность включает последовательность, происходящую из последовательности карбоксильного конца человеческого относящегося к хориону гонадотропина.

25. Конъюгат по п.24, где гликопротеин имеет последовательность, выбранную из группы, включающей

(а) человеческий эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln (SEQ ID NO:3), простирающуюся от карбоксильного конца;

(б) последовательность, указанную в (а), модифицированную с помощью Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; и

(в) последовательность, указанную в (а), модифицированную с помощью Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰.

26. Конъюгат по любому из пп.1-16, где гликопротеин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем перегруппировки по меньшей мере одного сайта гликозилирования.

27. Конъюгат по п.25, где перегруппировка включает делецию любого из N-связанных углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление N-связанного углеводного сайта в положение 88 последовательности человеческого эритропоэтина.

28. Конъюгат по п.14, где гликопротеин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем модификации, выбранной из группы, включающей Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; Gln38Ser⁸⁷Asn88Thr90EPO; и Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

29. Конъюгат по любому из пп.1-28, предназначенный для лечения болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии.

30. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии, включающая конъюгаты, где каждый из конъюгатов включает гликопротеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбранный из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования, этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп, Х обозначает -(СH₂)_k- или -СН₂(О-CH₂-СН₂)_k-, k обозначает 1-10, Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 20-40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет примерно 51-175 кДа, в которой по меньшей мере 90% конъюгатов представляют собой конъюгаты, у которых n равно 1, и фармацевтически приемлемые эксципиенты.

31. Композиция по п.30, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 92%.

32. Композиция по п.30, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет 90-96%.

33. Композиция, включающая конъюгат по любому из пп.1-27, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%.

34. Композиция по п.33, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 92%.

35. Композиция по п.33, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 96%.

36. Композиция по п.33, где процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет 90-96%.

37. Фармацевтическая композиция, обладающая биологической активностью in vivo, обуславливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, включающая композицию по любому из пп.30-36 или конъюгат по любому из пп.1-29 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

38. Способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений, включающих анемию у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии, предусматривающий стадию введения пациенту конъюгата по любому из пп.1-29 или композицию по любому из пп.30-37.

39. Способ получения конъюгата по любому из пп.1-29 или композиции по любому из пп.30-37, который предусматривает

(а) ковалентное взаимодействие е-аминогруппы лизина протеина эритропоэтина, представленного формулой P-[NH₂]_n, с бифункциональным реагентом, представленным формулой Z-O-X-S-Q, с получением промежуточного продукта с амидной связью, представленного формулой

где Р обозначает протеин эритропоэтин, не содержащий аминогруппы, образующей амидную связь; n обозначает целое число от 1 до 3; Z обозначает реакционноспособную группу; Х обозначает (CH₂)_k или -СН₂(O-СН₂-СН₂)_k-, где k обозначает от 1 до примерно 10; Q обозначает защитную группу;

(б) ковалентное взаимодействие промежуточного продукта с амидной связью, полученного на стадии (а), с активированным полиэтиленгликольным производньм, представленным формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR, с получением включающего гликопротеин эритропоэтин продукта, представленного формулой

где W означает сульфгидрильную реакционноспособную форму Y; m обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900; R обозначает (низш.)алкил и Y обозначает

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3