Композиция для хранения водных растворов конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой хрена

 

Изобретение относится к области биохимии и используется для стабилизации растворов конъюгатов антител или антигенов. Композиция содержит катон CG, гидролизат казеина, глицерин, аммониевую соль 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты в среде фосфатного буфера с рН 7,4. Композиция обладает стабилизирующими свойствами, позволяет хранить конъюгаты в готовом для использования виде. 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии и используется для стабилизации растворов конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой, применяемых in vitro диагностике, например в иммуноферментном анализе.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа широко применяются в медицинской диагностике, в том числе в клинических лабораториях для терапевтического мониторинга гормонов, диагностике вирусов (например, ВИЧ, гепатит), а также в биохимических и микробиологических исследованиях.

Для проведения анализа обычно используют коммерческие тест-системы, включающие полный набор реагентов, достаточный для одновременного проведения нескольких десятков анализов. Основными компонентами наборов являются полистирольные планшеты с иммобилизованными антителами или антигенами, конъюгаты антител или антигена с ферментом, стандарты определяемого вещества, компоненты буферных растворов, субстраты ферментной метки. В большинстве коммерческих наборов в качестве ферментной метки используют пероксидазу.

По ряду причин конъюгаты пероксидазы с антителами или антигенами в растворе достаточно неустойчивы и не сохраняют ферментативную активность и способность связываться с иммобилизованными на планшете компонентами в течение длительного промежутка времени. Поэтому в стандартных наборах реагентов конъюгат в основном поставляется в стабильном лиофилизованном виде, позволяющем хранить его в холодильнике до одного года. Однако после приготовления раствора конъюгата в лаборатории путем растворения его в буфере ферментативная активность конъюгата и его способность образовывать иммунокомплексы быстро уменьшается. Все это вызывает необходимость быстрого его использования. На практике, однако, часто возникает необходимость постановки лишь небольшого числа анализов.

Белковые реагенты, в том числе конъюгаты антител с пероксидазой хрена, являются основными компонентами диагностических иммуноферментных наборов. Предпочтительно, когда входящие в состав наборов пероксидазные конъюгаты находятся в жидком, готовом к использованию виде. Это позволяет приготовить необходимое для работы количество растворов и использовать один и тот же набор в течение длительного времени. Однако, как правило, процессы хранения жидких растворов белков (в том числе конъюгатов антител с пероксидазой), сопровождаются их денатурацией, приводящей к потере каталитической активности фермента и уменьшению способности антител связываться с соответствующими антигенами. Возможными причинами являются необратимое изменение конформации белковых молекул, модификация (например, окисление) функциональных групп белков, ответственных за проявление каталитической активности или способности образовывать специфические иммунокомплексы, микробное заражение и последующая деградация белков и т.д. [1]. Поэтому важным обстоятельством является присутствие в растворах конъюгатов таких компонентов, которые позволяют поддерживать высокую стабильность белковых молекул.

Известны различные композиции для стабилизации конъюгатов пероксидазы в растворе, различающиеся веществами, которые используются в качестве стабилизирующих ингредиентов. Например, для сохранения стабильности конъюгатов пероксидазы в растворе использовались: фенол и его производные [2], смесь полиэтиленгликоля и солей кальция [3], смесь сыворотки с 4-аминоантипирином [4]. Обнаружено усиление стабилизирующего эффекта, оказываемого на активность раствора конъюгата антитела с пероксидазой хрена, посредством 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты в среде 10% телячьей сыворотки [5].

Кроме того, для эффективности стабилизирующего действия использовались соли 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты, в особенности аммониевая соль этой кислоты, в среде 0,5-3% гидролизата птичьего альбумина или 50-75% телячьей сыворотки в сочетании с поливинилпирролидоном и/или пропионатом кальция или их смесью [6].

Все эти стабилизирующие смеси обеспечивают хранение конъюгатов антител с пероксидазой хрена в растворе, позволяя избегать стадии замораживания-размораживания конъюгата, что значительно упрощает методику проведения анализа. Особенно актуальным использование жидких стабильных реагентов является для научно-исследовательских групп, а также для диагностических лабораторий, выполняющих ежедневно небольшое количество анализов. Высокая стабильность конъюгатов позволяет осуществить значительную экономию используемых реагентов, в том числе стандартных растворов.

В качестве прототипа выбрана композиция для хранения водных растворов конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой хрена, в которой в качестве основных ингредиентов выступают белковые компоненты, такие как гидролизат птичьего альбумина или телячья сыворотка, в сочетании с 1% поливинилпирролидоном и/или 0,2% пропионатом кальция или их смесь и дополнительное введение солей 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты вызывает усиление стабилизирующего эффекта [6].

Задачей изобретения является создание композиции для хранения водных растворов конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой хрена, обладающей стабилизирующими свойствами и позволяющей хранить конъюгаты в готовом для использования виде.

Данная задача решается предлагаемой композицией. К ее основным компонентам относятся гидролизат казеина и глицерин в сочетании с аммониевой солью 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты в среде 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,4, содержащего 0,25% Твин-20. Дополнительное введение аскорбиновой кислоты или борогидрида тетрабутиламмония вызывает усиление стабилизирующего эффекта.

Существование в смеси свободных радикалов растворенного кислорода, количество которых при воздействии света увеличивается, определяет наличие потенциальных окислителей простетического гемина пероксидазы. Добавление таких восстановителей, как аскорбиновая кислота или борогидрид тетрабутиламмония, приводит к уменьшению числа радикалов, а следовательно и к сохранению ферментативной активности пероксидазы.

Для предотвращения негативного влияния микрофлоры среды на ферментативную активность конъюгата в качестве антибактериального средства в стабилизирующую смесь добавляют катон CG. Содержание катона CG в смеси не превышает 0,05 г/л, поскольку большее его количество оказывает ингибирующее воздействие на пероксидазу.

Использование предлагаемой композиции позволяет хранить жидкие конъюгаты антител или антигенов с пероксидазой не в концентрированном виде, а в рабочем разведении, которое необходимо для проведения анализа.

Изобретение поясняется примером.

Пример

Готовят растворы фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,25% Твин-20, с разным соотношением концентраций веществ, входящих в состав стабилизирующей смеси (таблица). В каждый из приготовленных растворов добавляют 1∗10^-8 М конъюгата антивидовых антител с пероксидазой (концентрация конъюгата определялась по его ферментативной активности). Полученные образцы термостатируют при Т=37°С в течении 30 дней и измеряют в них ферментативную активность конъюгата антитела с пероксидазой. Активность конъюгата в данный момент времени определяется оптической плотностью (λ=492нм) и измеряется следующим образом. В лунку 96-луночного полистиролового планшета, сенсибилизированного кроличьими антителами, вносят по 100 мкл раствора конъюгата, инкубируют в течении 1 часа при Т=37°С и далее подвергают трехкратной промывке фосфатным буфером рН 7,4. Ферментативную активность в лунке регистрируют фотометрически с о-фенилендиамином. Перед проведением измерения раствор конъюгата антитело-пероксидаза в стабилизирующей смеси разводят в фосфатном буфере до рабочей концентрации конъюгата. Для уменьшения фонового сигнала, создаваемого средой стабилизатора, рекомендуется производить его разведение как минимум в 10 раз.

Отношение активности конъюгата в данный момент времени инактивации к его первоначальной активности характеризуют относительную активность (таблица).

Список литературы

1. Guire P //Stability issues for protein-based in vitro diagnostic products// IVD Technology. 1999. V5. N2. P68-71.

2. Патент США № 4764468, 1988.

3. Патент США № 4782023, 1988.

4. Европейский патент № 0070992 В1, 1985.

5. Патент США № 4252896, 1980.

6. Европейский патент № 0303062 А1.

Формула изобретения

1. Композиция для хранения водных растворов конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой хрена, содержащая белковый компонент и аммониевую соль 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты, отличающаяся тем, что в состав композиции входит катон CG, а в качестве белкового компонента используют гидролизат казеина при следующем содержании компонентов: гидролизат казеина 4-12 г/л; аммониевая соль 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты 0,1-0,4 г/л; глицерин 63-252 г/л; катон СG 0,05 г/л; в среде фосфатного буфера c рН 7,4.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 0,00044-0,00176 г/л аскорбиновой кислоты.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 0,00065-0,00266 г/л борогидрида тетрабутиламмония.