Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии, столбняка и вирусного гепатита в и д

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается новой ассоциированной вакцины. Новая комбинированная вакцина содержит в своем составе следующие компоненты: поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/ayw), полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D и/или поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/adw), полученный культивированием штамма дрожжей Н.Polymorpha VKPM Y-2412 в количестве 5-10 мкг, коклюшные микробы 6,0-10 млрд, дифтерийный анатоксин 7,5-15 Lf, столбнячный анатоксин 5-10 ЕС, гель алюминия гидроксида (Al³⁺) 0,3-0,5 мг, мертиолят 35-50 мкг и 0,9% NaCl до 0,5 мл. Антигены вируса гепатита В (HBsAg/ayw) и (HBsAg/adw) содержатся в вакцине в соотношении 1:1. Новая комбинированная вакцина является высокоиммуногенным, нетоксичным препаратом с широким спектром действия, что позволяет расширить арсенал средств, предназначенных для иммунопрофилактики против возбудителей ряда заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к разработке новых ассоциированных вакцин, содержащих в одном препарате несколько антигенов, что обеспечивает возможность проведения одновременно иммунизации против возбудителей нескольких заболеваний.

Развитие вакцинологии и прививочного дела привело к существенному возрастанию количества прививок, получаемых каждым, нуждающемся в том, пациентом.

При одновременном введении различных вакцин не решаются проблемы сокращения количества инъекций и уменьшения кумулятивного токсического воздействия на организм различных ингредиентов вакцины (сорбента, консерванта и др.), остаются актуальными вопросы транспортировки и хранения большого количества термолабильных препаратов, а также наличия всех показанных для единовременного применения вакцин. Поэтому приоритетным направлением развития современной иммунобиологической промышленности остается программа создания ассоциированных препаратов.

Известна комбинированная вакцина против дифтерии - столбняка - коклюша - гепатита В.

Одна 0,5 мл доза содержит в качестве активных ингредиентов:

Д-токсоид - 7,5 Lf; С - токсоид - 3,25 Lf; Кц - антиген - 15; HBsAg - 10 мкг протеина.

Поверхностный антиген вируса гепатита В представляет собой любые известные антигены поверхностного антигена вируса гепатита В или их фрагменты, проявляющие антигенность поверхностного антигена гепатита В (в патенте даны ссылки на известные антигены).

Все антигены, кроме поверхностного антигена гепатита В, адсорбируются на гидроокиси алюминия. Поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на фосфате алюминия.

При необходимости в вакцине используют антисептик, например, мертиолят 1:20000 до 1:10000 или 2-феноксиэтанол от 3 до 6 мг/кл.

В состав вакцин входит изотонический соляной раствор (RU, патент №2160120, А 61 К 39/295, 39/29, публ. 2000 г.).

Известна также комбинированная вакцина для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В и Д.

Вакцина имеет следующий состав:

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), полученный культивированием рекомбинантного штамма S. cerevisiae ВКПМ Y2203 5-10 мкг HBsAg

Анатоксин дифтерийный очищенный концентрированный 10-20 Lf

Анатоксин столбнячный очищенный концентрированный 5-10 ЕС

Убитые формалином коклюшные микробы 10-15 ОЕ

Мертиолят 0,01±0,002%

Гель алюминия гидроксида 0,5-1,2 мг в пересчете на алюминий

Фосфатно-солевой буфер (50 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6,8-0,13М NaCl) До 1 мл

RU, Патент №2130778, 1998, А 61 К 39/29.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, предназначенных для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, столбняка, дифтерии и коклюша.

Поставленная задача решена путем конструирования новой высокоиммуногенной комбинированной вакцины, в которой в качестве антигена вируса гепатита В (HBsAg) содержится новый антиген вируса гепатита В (HBsAg) серотипа adw, полученный культивированием штамма дрожжей Hansenula Polymorpha, VKPM - Y-2412, антиген вируса гепатита В серотипа ayw, полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) VKM - Y-2924D или смесь указанных антигенов в равных количествах (соотношение 1:1).

В связи с введением с 2003 г. новой классификации Hansenula Polymorpha в настоящее время обозначается как Pichia angusta.

Количество антигена или смеси антигенов вируса гепатита В составе комбинированной вакцины составляет 5-10 мкг HBsAg в 0,5 мл раствора, являющегося прививочной дозой препарата.

Кроме того вакцина содержит:

Убитые формальдегидом коклюшные микробы 6,0-10 млрд

Дифтерийный анатоксин 7,5-15 Lf

Столбнячный анатоксин 5-10 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Al³⁺) 0,3-0,5 мг

Мертиолят (консервант) 35-50 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

В отличие от известной вакцины согласно изобретению в сконструированную вакцину введен новый антиген вируса гепатита В серотипов ayw и/или adw и изменено соотношение активных ингредиентов из-за проявляющегося потенциирующего эффекта, обусловленного влиянием нового антигена на иммунологическую активность других активных компонентов полученной вакцины. Кроме того, значительно уменьшено количество растворителя.

При разработке новой вакцины требовалось соединить несколько антигенов (один из них новый) в одном инъекционном препарате таким образом, чтобы новая комбинация компонентов, взятых в определенных количествах, не снижала безопасности и иммуногенности вновь созданного иммунобиологического препарата, а также его эпидемиологической эффективности.

Проведенные исследования показали, что созданный препарат обладает широкими возможностями использования (расширен спектр воздействия) при высокой иммуногенной активности и нетоксичности, низкой реактогенности.

Полученная согласно изобретению вакцина, содержащая антиген вируса гепатита В двух различных серотипов, является вакциной направленного действия против тех возбудителей, которые наиболее широко распространены на территории России и в странах ближнего зарубежья.

При этом следует отметить, что новый комбинированный препарат является эффективным и при иммунопрофилактике вирусного гепатита Д, поскольку вирус гепатита Д не может участвовать в развитии гепатитной инфекции без одновременной репликации вируса гепатита В, и возможно предохранить от дельта - инфекции вакцинацией против вирусного гепатита В в результате образования антител к HBsAg (анти HBs).

Для выделения новых антигенов вируса гепатита, содержащихся в вакцине, используют новые дрожжевые продуценты. Дрожжи Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) являются предпочтительными по сравнению с S. cerevisiae, поскольку позволяют добиваться более высоких уровней синтеза антигена при более простых способах получения культур высокой плотности.

Штаммы дрожжей Pichia angusta (Hansenula Polymorpha), являющиеся продуцентами поверхностного антигена вируса гепатита В серотипов ау и ad, являются новыми.

Выделенные антигены впервые используют в составе комбинированной вакцины.

Способ получения новых штаммов - продуцентов и выделение антигенов вируса гепатита В серотипов ayw и adw:

! все рутинные генно-инженерные операции осуществляют согласно стандартным методикам и инструкциям компаний - производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Для ПЦ во всех случаях использовали полимеразу Vent (NEB). Синтез олигонуклеотидов производился ЗАО “Синтол” г. Москва. В работе для получения антигена серотипа ayw использовали следующие олигонуклеотиды:

Пример 1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего HBsAg/ayw (фрагмент А). Реакционную смесь, содержащую олигонуклеотиды lu и 8L по 1 мкМ, олигонуклеотиды со 2u по 8u; с 1L по 7L по 10 пМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8.8, 10 mМ (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton Х-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 90 с. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 730 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 2. Получение фрагмента геномной ДНК Pichia angusta, содержащего промотор гена МОХ (фрагмент Б).

Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) BKM 4-2559, получен из почвы СС4 38-22-2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин, 1 мкл полученного супернатанта добавляют к 25 мкл смеси, содержащей олигонуклеотиды moxU5 и moxL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl рН 8,8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 90 с. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 850 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 3. Получение фрагмента геномной ДНК Pichia angusta, содержащего часть гена TRP 3 (фрагмент В).

Суспендируют 2-3 мкг клеток штамма Н. polymorpha BKM 4-2559 (Pichia angusta) в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин, 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды trpU5 и trpL3 по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl pH 8,8, 10 mМ (NH₄)₂SO₄, 2 mМ MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 120 с, при 50°С 30 с, при 72°С 120 с. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 1360 пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 4. Получение фрагмента ДНК Pichia angusta, содержащего последовательность, кодирующую HBsAg/ayw, слитую с промотором МОХ и геном TRP 3 (фрагмент Г).

Реакционную смесь (0,05 мл), содержащую олигонуклеотиды moxU5 и trpL3 по 1 мкМ, фрагменты А, Б и В по 1 пг, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mM tris-HCl pH 8,8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 3 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 2,9 тысяч пар оснований. Соответствие выделенного фрагмента нужному размеру определяют также путем электрофореза в 1% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса.

Пример 5. Интеграция последовательности, кодирующей HBsAg/ayw, в геном Pichia angusta.

Штамм Pichia angusta (Hansenula Polymorpha) DLT (Agaphonov et al., 2002; коллекция штаммов лаборатории молекулярной генетики РКН ПК МЗ РФ) выращивают в течение 15-20 ч в среде YNB-D, содержащей триптофан 20 мг/л, при 37°С в условиях интенсивной аэрации. 0,5 мл культуры добавляют к 30 мл такой же среды и инкубируют в тех же условиях в течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием при 3000g 5 мин и суспендируют в 15 мл буфера Т (10 mМ tris-HCl pH 7,4; 100 mМ CH₃COOLi; 0,5 mМ EDTA). После инкубации в течение 30 мин при 30°С клетки вновь осаждают и суспендируют в 200 мкл буфера Т. К 0,05 мл суспензии добавляют 1 мкг фрагмента Г, перемешивают, добавляют 120 мкл 70% раствора ПЭГ 4000, вновь перемешивают и инкубируют 1 ч при 30°С.

Трансформационную смесь инкубируют при 45°С 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и высевают на чашки Петри со средой, содержащей 50 мг/мл лейцина. Выросшие колонии трансформантов проверяют на способность расти на среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода. Отбирают клоны, не способные расти на такой среде, и проверяют их на способность синтезировать HBsAg/ayw. Полученный штамм дрожжей Pichia angusta является продуцентом поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/ayw). Штамм имеет регистрационный номер VKM Y-2924D, 25.02.2003 и депонирован в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К.Скрябина. Справка о депонировании штамма прилагается.

Пример 6. Анализ способности штамма синтезировать HBsAg/ayw.

Тестируемый штамм засевают в среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы) и инкубируют при 37°С в течение 15-20 ч в условиях высокой аэрации. Полученную культуру разводят в пять раз средой YPM (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% метанола) и инкубируют в тех же условиях в течение 30-50 ч. Клетки из 0,5 мл культуры собирают центрифугированием, суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл 0,2 М NaOH и инкубируют на кипящей водяной бане 8 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10000 g, после чего супернатант анализируют методом электрофореза и иммуноблоттинга с использованием антител к HBsAg/ayw. В качестве стандарта используют очищенный белок HBsAg/ayw. В дорожках, соответствующих штаммам, которые синтезируют HBsAg/ayw, выявляется полоса на уровне 24-27 кДа, такая же, как и в случае очищенного белка.

Пример 7. Определение последовательности гена HBsAg/ayw в геноме дрожжей.

Суспендируют 2-3 мкг клеток анализируемого штамма в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин, 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды МОХ и TRP по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl рН 8,8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 2 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 800 пар оснований. Фрагмент секвенируют с использованием праймеров МОХ и TRP. Совпадение результатов секвенирования с исходной последовательностью показывает отсутствие мутаций в интегрированном в геном дрожжей гене HBsAg/ayw.

Пример 8. Выделение HBsAg(ayw) из клеток Pichia angusta

После ферментации исходного штамма дрожжей Pichia angusta HBsAg выделяют согласно общепринятой методике по следующей схеме. Клетки из культуральной жидкости осаждают центрифугированием при 4000 g на центрифуге Beckman. Осажденную биомассу ресуспендируют до концентрации 250 г влажных клеток на 1 л в буфере экстракции PBS рН 6,8 с добавлением EDTA, PMSF и Tween-20. Далее клетки разрушают в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметром 0,5-0,7 мм. Основную массу нецелевых белков из полученного гомогенизата осаждают добавлением полиэтиленгликоля (PEG) до концентрации 4,5%. Осажденные белки отделяют центрифугированием. Полученный супернатант фильтруют на ультрафильтрах (500 кДа) Pellicon. При этом отделяются белки с мол. массой меньше 500 кДа, а также удаляется PEG и раствор HBs антигена переводится в буфер PBS рН 6.7. Одновременно происходит концентрированно раствора, что существенно для следующей стадии абсорбции на стекло. Посадку HBsAg на макропористое стекло (МПС) осуществляют в колонках системы StreamLine, разработанной фирмой Pharmacia (Sweden). Для удаления неспецифически связанных белков колонку промывают тем же буфером PBS. Антиген элюируют карбонатным буфером (КБ) рН 9,5. Элюат концентрируют ультрафильтрацией и разделяют при помощи ультрацентрифугирования на зональном роторе (Beckman) в градиенте глицерин/сахароза. Полученные фракции анализируют на содержание HBsAg, используя РОПГА набор, и фракции, содержащие антиген, объединяют и очищают гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом HBs антигена определяют методом SDS-PAGE. Если чистота продукта недостаточна (<95%), производят дополнительную очистку при помощи ионообменной хроматографии на сорбенте TSK-DEAE (ToyoSoda Corp., Japan). Выход антигена 25-30 мг с 1 л культуральной жидкости.

Полученный раствор HBsAg (ayw) анализируют рядом методов:

1. Антигенную активность измеряют наборами РОПГА (реакция обратной пассивной гемагглютинации эритроцитов) по методике производителя (НПО “Диагностические Системы”, Нижний Новгород) с использованием в качестве стандарта отраслевого стандартного образца активности HBsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемого ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

2. Чистота рекомбинантного HBsAg определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) с окрашиванием серебром и Coomassie Brilliant Blue R-250. Чистота выделенного антигена не <95%.

Получение штамма дрожжей Н. polymorpha VKPM Y - 2412 (депонирован в ГНИИ Генетики. Справка о депонировании штамма прилагается) - продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg/adw), проводят аналогично примерам 1-5 с той лишь разницей, что в работе используют следующие олигонуклеотиды:

Выделение HBsAg/adw осуществляют аналогично примеру 8. Анализ выделенного HBsAg/adw проводят методами, описанными для антигена HBsAg/ayw.

Пример 9. Анализ способности штамма синтезировать HBsAg/adw.

Тестируемый штамм засевают в среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы) и инкубируют при 37°С в течение 15-20 ч в условиях высокой аэрации. Полученную культуру разводят в пять раз средой YPM (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% метанола) и инкубируют в тех же условиях в течение 30-50 ч. Клетки из 0,5 мл культуры собирают центрифугированием, суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл 0,2 М NaOH и инкубируют 3-4 мин. Затем клетки осаждают, ресуспендируют в сэмплбуфере и инкубируют на кипящей водяной бане 8 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10000 g, после чего супернатант анализируют методом иммуноблоттинга с использованием антител к HBsAg/adw. В качестве стандарта используют очищенный белок HBsAg/adw.

Пример 10. Определение последовательности гена HBsAg/adw в геноме дрожжей.

Суспендируют 2-3 мкг клеток анализируемого штамма в 0,1 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 g 5 мин, 1 мкл полученного супернатанта добавляют к смеси, содержащей олигонуклеотиды МОХ и TRP по 1 мкМ, ThermoPol буфер (10 mM KCl, 20 mМ tris-HCl рН 8,8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 250 uM dNTP) и 5 единиц активности Vent полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 циклов изменения температуры. Каждый цикл включает инкубацию при 95°С в течение 30 с, при 50°С 30 с, при 72°С 2 мин. После этого продукты реакции разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и изолируют фрагмент размером 800 пар оснований. Фрагмент секвенируют с использованием праймеров МОХ и TRP и определяют отсутствие мутаций путем сравнения результатов с исходной последовательностью.

Полученные штаммы имеют видовые названия: Hansenula polymorpha и Pichia angusta. Наименование штаммов VKPM Y - 2412 (HBsAg/adw) и VKM Y-2924D (HBsAg/ayw).

Культурально-морфологические особенности штаммов:

клетки округлой формы, небольшие по размеру;

на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.

Активность штаммов - не менее 30 мг/л культуральной жидкости.

Хранение при - 70°С в виде суспензии клеток в стерильном (30-50)%-ном растворе глицерина.

Генетические особенности:

ауксотроф по лейцину, фаги у дрожжей не обнаружены.

Штаммы не являются зоопатогенными или фитопатогенными.

Способ определения активности: в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноферментного анализа.

Способ, условия и состав сред для размножения штаммов: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 29±1°С и рН 5,0-5,5 в среде, содержащей до 10-15% глицерина и соли.!

Выделенные антигены вируса гепатита В серотипов ayw и adw используют для создания комбинированных вакцин в качестве активных компонентов.

Полученные согласно изобретению вакцины могут быть представлены в нескольких вариантах:

1. В составе комбинированной вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится антиген серотипа ayw, полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D.

2. В составе комбинированной вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится антиген серотипа adw, полученный культивированием штамма дрожжей Н. Polymorpha VKPM Y-2412.

3. В составе комбинированной вакцины в качестве антигена вируса гепатита В содержится смесь антигенов серотипов ayw и adw, взятых в равных количествах (соотношение 1:1).

Все остальные активные компоненты вакцины являются известными отечественными антигенами.

Новая комбинированная вакцина представляет собой комбинацию ассоциированных на геле алюминия гидроксида поверхностного антигена вируса гепатита В и смеси убитых формальдегидом коклюшных микробов 1 фазы и очищенных от балластных белков дифтерийных и столбнячных анатоксинов.

Способ получения комбинированной вакцины заключается в обычном смешении компонентов состава, при этом одинаково хорошие результаты могут быть получены при осуществлении способа в различных вариантах:

1. Сорбируют компоненты коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС) на геле алюминия, взятом примерно в половинном его количестве, отдельно проводят сорбцию антигена вируса гепатита В (HBsAg) одного серотипа или смеси антигенов 2-х серотипов на другой части геля алюминия, после чего сорбированные антигены смешивают и добавляют консервант и фармацевтически приемлемый растворитель.

2. АКДС сорбируют на геле алюминия, беря все его количество, указанное в формуле, после чего к сорбированному АКДС добавляют антиген гепатита В или смесь антигенов 2-х серотипов и далее как в 1 варианте.

3. Смешивают АКДС с HBsAg одного серотипа или со смесью антигенов ayw и adw и затем сорбируют их на геле алюминия, далее как в 1 варианте.

4. HBsAg или смесь антигенов ayw и adw сорбируют на геле гидроксида алюминия, затем добавляют АКДС и остальные компоненты как в первом варианте.

Проверку полноты сорбции дифтерийного анатоксина осуществляют по реакции флокуляции, столбнячного компонента - по реакции антитоксин связывания, ИФА - для гепатитного компонента.

Далее в исследованиях по определению иммуногенной активности использовали следующие конкретные составы:

Конкретные примеры комбинированных вакцин, полученных согласно изобретению:

1. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, коклюша, дифтерии и столбняка содержит:

Поверхностный антиген вируса

гепатита В (HBsAg/ayw),

полученный культивированием

штамма дрожжей Pichia angusta

VKM Y-2924D 5 мкг

Убитые формальдегидом коклюшные микробы 6,0 млрд

Дифтерийный анатоксин 7,5 Lf

Столбнячный анатоксин 5 ЕС

Гель алюминия гидроксида (А1³⁺) 0,5 мг

Мертиолят (консервант) 50 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

0,5 мл препарата является одной прививочной дозой

2. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, коклюша, дифтерии и столбняка содержит:

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/adw), полученный культивированием штамма дрожжей Н. Polymorpha VKPM Y-2412 5 мкг

Убитые формальдегидом коклюшные микробы 10 млрд

Дифтерийный анатоксин 15 Lf

Столбнячный анатоксин 10 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Al³⁺) 0,5 мг

Мертиолят (консервант) 40 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

3. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики вирусного гепатита В и Д, коклюша, дифтерии и столбняка содержит:

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/ayw), полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D 2,5 мкг

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg/adw), полученный культивированием штамма дрожжей Н. Polymorpha VKPM Y-2412 2,5 мкг

Убитые формальдегидом коклюшные микробы 8 млрд

Дифтерийный анатоксин 10 Lf

Столбнячный анатоксин 8 ЕС

Гель алюминия гидроксида (А1³⁺) 0,3 мг

Мертиолят (консервант) 35 мкг

0,9% NaCl До 0,5 мл

Изучение иммуногенной активности новой комбинированной вакцины осуществлялось на детском контингенте, при этом проводилась сравнительная оценка иммуногенной активности нового препарата, АКДС-вакцины и вакцины гепатита В при их одновременном введении в разные участки тела у детей первого года жизни.

В исследование было включено 93 ребенка в возрасте до 1 года.

1 группа была иммунизирована новой вакциной трехкратно в 3, 4 и 5 месяцев;

2 группа получила одновременную вакцинацию в разные участки тела АКДС - вакциной и вакциной гепатита В, трехкратно в 3, 4 и 5 месяцев;

3 группа была иммунизирована АКДС - вакциной, трехкратно в 3, 4 и 5 месяцев.

Иммунизации подлежали здоровые дети, не имеющие противопоказаний к прививке АКДС и гепатитной В вакцинами, при отсутствии переболевших гепатитами в семье и отсутствии в анамнезе прививок против гепатита В.

В качестве референс - препаратов были использованы АКДС-вакцина производства ГУП “Иммунопрепарат” (г. Уфа) серии №254-4 и 251-1 и вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая жидкая по ФС 42-3438-97 серии 110 и 113 (10 мкг, детская доза).

Иммунизацию проводили в соответствии с положениями Инструкции по применению препаратов: вакцины в дозе 0,5 мл вводили внутримышечно в верхний наружный квадрант ягодицы или в передне-наружную область бедра.

Для определения иммуногенности используемых вакцин через 30-45 дней после завершенного курса вакцинации у детей была взята кровь из вены в количестве 2,0-5,0 см³.

Полученные сыворотки были заморожены и хранились до исследования при температуре минус 30°С.

Уровень антител к вирусу ГВ (HBsAg), к дифтерийному и столбнячному анатоксинам определяли с помощью ИФА с использованием ИФТС для выявления дифтерийных и столбнячных антител производства НПО “Биомед” (г. Пермь); анти-HBs антител - ИФТС “Monolisa” производства фирмы Biorat (Франция). Уровни антител к коклюшному компоненту определяли в реакции агглютинации со стандартным коклюшным диагностикумом производства ЗАО “Биомед” (г. Москва).

Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием методов описательной статистики. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрических критериев. Помимо этого применяли методы дисперсионного анализа. В работе использовали электронные таблицы Excel для Windows (Microsoft), а также пакет статистических программ “DIASTA” (МГУ, Россия), являющийся версией пакета “STADIA”.

Данные оценки иммунного ответа показали, что новая вакцина индуцировала иммунитет ко всем четырем компонентам вакцины. Через один месяц после завершения курса вакцинации 100% детей во всех исследованных группах имели титры антител против дифтерии и столбняка, в значительной степени превышающие защитные (0,03 МЕ/мл для дифтерии и 0,01 МЕ/мл для столбняка).

Как показали результаты статистической обработки данных иммуноферментного анализа при доверительном интервале измерения (95%), различия величины средней геометрической титра (СГТ) дифтерийных и столбнячных антител между I новой вакциной и III (АКДС), II (АКДС+ВГВ) и III группами не существенны (р>0,05). В то время как между I и II группами различия величины СГТ оказались существенны (р<0,05). В I группе СГТ дифтерийных и столбнячных антител в 1,65 и 1,6 раза соответственно больше, чем во II группе (табл. 1).

Результаты оценки иммунного ответа на коклюшный компонент комбинированных вакцин по данным реакции агглютинации приведены в табл. 2. В I группе наблюдения только 4 ребенка из 36 (11,11%) имели титры антител ниже (<1:80). В то время как во II группе титры антител ниже 1:80 имели 9 человек из 32 (28,13%), а в III группе - 5 из 25 (20%). Различия величины СГТ между I и II, I и III, II и III группами не существенны (р>0,05) (табл. 2).

Структура иммунного ответа на гепатитный компонент приведена в табл. 3. Как видно, через месяц после завершения цикла вакцинации 100% детей в первой группе имели уровень анти-HBs значительно выше защитного (>10 МЕ/л). При этом 50% детей имели титры анти - HBs в диапазоне 100-1000 МЕ/л. Во второй группе 5 детей (15,62%) не дали иммунного ответа и процент сероконверсии по группе составил 84,38%. Между тем, различия величины СГТ анти-HBs между I и II группами не существенны (р>0,05). Следует отметить, что суммарная доза HBsAg, веденного в составе новой вакцины, составила 15 мкг, а при одновременном введении АКДС-вакцины и вакцины гепатита В - 30 мкг.

Таким образом можно констатировать следующее:

1. Новая комбинированная вакцина стимулирует иммунный ответ на все четыре входящих в ее состав компонента. После завершения первичного курса вакцинации 100% детей имели защитные титры антител против дифтерии, столбняка и гепатита В.

2. Титры антител против коклюша, равные или превышающие защитные (1:160), имели свыше 70% вакцинированных детей. При этом аналогичный показатель в группах сравнения составлял не более 60%.

Формула изобретения

1. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии, столбняка и вирусного гепатита В и Д, содержащая коклюшные микробы, антигены дифтерии, столбняка, вирусного гепатита В (HBsAg), гель алюминия гидроксида, мертиолят и растворитель, отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса гепатита В вакцина содержит HBsAg/ayw, полученный культивированием штамма дрожжей Pichia angusta VKM Y-2924D и/или HBsAg/adw, полученный культивированием штамма дрожжей Hansenula Polymorpha VKPM Y-2412, а в качестве растворителя 0,9%-ный раствор натрия хлорида при следующих количествах компонентов:

Поверхностный антиген вируса

гепатита В (HBsAg/ayw), полученный

культивированием штамма дрожжей

Pichia angusta VKM Y-2924D, и/или

поверхностный антиген вируса

гепатита В (HBsAg/adw), полученный

культивированием штамма дрожжей

Н. Polymorpha VKPM Y-2412 5-10 мкг HBsAg

Убитые формальдегидом

коклюшные микробы 6,0-10 млрд

Дифтерийный анатоксин 7,5-15 Lf

Столбнячный анатоксин 5-10 ЕС

Гель алюминия гидроксида (Аl³⁺) 0,3-0,5 мг

Мертиолят (консервант) 35-50 мкг

0,9%-ный Раствор хлорида натрия До 0,5 мл

2. Комбинированная вакцина для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии, столбняка и вирусного гепатита В по п.1, отличающаяся тем, что поверхностные антигены вируса гепатита В (HbsAg/ayw) и (HBsAg/adw) содержатся в соотношении 1:1.