Способ получения лимонной кислоты

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа очистки растворов лимонной кислоты и сопутствующих ее биосинтезу кислотостабильных амилолитических ферментов, обладающих декстриногенной и сахарогенной активностями. Способ заключается в том, что при температуре ≤32°С от ферментированного раствора отделяют мицелий гриба-кислотообразователя Aspergillus niger, очищают полученную культуральную жидкость посредством последовательных процессов фильтрации или сорбции примесей, а затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на растворы целевых продуктов. Способ позволяет одновременно получить два целевых продукта: очищенный раствор лимонной кислоты и комплекс кислотостабильных амилолитических ферментов. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения лимонной кислоты ферментацией среды на основе гидролизата крахмала грибом Aspergillus niger и выделением ее из ферментированного раствора.

Известный традиционный способ получения кристаллической лимонной кислоты включает много стадий: отделение мицелия фильтрованием культуральной жидкости, термообработка при температуре 80-100°С ферментированного раствора, осаждение целевого продукта в виде цитрата кальция, разложение соли серной кислотой, фильтрацию гипсовой суспензии через активный уголь, кристаллизацию [1].

Использование экологически вредных реагентов значительно усложняет процесс и требует дополнительную очистку растворов лимонной кислоты, регенерацию сорбента, применение дополнительных реагентов, увеличение энерго- и материальных затрат. Кроме того, в способе не предусмотрена возможность выделения кислотостабильных ферментов.

Известен способ получения лимонной кислоты в жидком виде с использованием бентонита и цеолита для очистки раствора кислоты от остатков мицелия и с последующим концентрированием его [2]. Концентрат кислоты характеризуется определенной цветностью и присутствием до 0,5% белковых веществ. Последующее отделение примесей в способе отсутствует.

Известен способ выделения препарата гомогенной α-амилазы из культуральной жидкости после ферментации питательной среды термофильным штаммом В. stearothermophilus. Фильтрат культуральной жидкости, содержащий 5,0 ед. АС/мг белка, концентрируют методом ультрафильтрации до выделения раствора с активностью 10,6 ед. АС/мг белка, затем проводят осаждение комплекса ферментов этиловым спиртом, высушивание осадка, последующую глубокую очистку препарата от сопутствующих ферментов - примесей. Выход чистого препарата α-амилазы составляет 22,1% [3].

В способе выделения фермента метод ультрафильтрации позволяет провести концентрирование фильтрата культуральной жидкости без фазового превращения при комнатной температуре и при одновременном освобождении от балластных веществ (пигментов, азотистых и других низкомолекулярных соединений).

Однако известный способ не предусматривает получение и выделение из культуральной жидкости двух целевых продуктов: низкомолекулярного соединения и комплекса ферментов.

Известен способ получения лимонной кислоты, включающий ферментацию углеводсодержащего сырья, отделение мицелия гриба Aspergillus niger, очистку ферментированного раствора суспензий активированного бентонита с последующим отделением раствора и обработкой активированным углеволокнистым материалом марки АУТ-М, Бусофит-Т, Бусофит-ТМ либо Карбопон-актив, имеющим объем сорбционных пор в пределе 0,30-0,80 см³/г, взятом в количестве 2,0-12,0 г на 1 дм³ раствора.

В результате получают очищенный раствор лимонной кислоты, не содержащий белковые вещества, в том числе и ферменты, с титруемой кислотностью 14,6-14,7%, что на 3,3-4,0% ниже по сравнению с ферментированным раствором (15,2%) [4].

Возможность получения и выделения комплекса ферментов как целевого продукта в способе отсутствует, так как отделение мицелия проводят при температуре выше 70°С, происходит инактивация ферментов и коагуляция белковых веществ, которые становятся нежелательной примесью.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения кислой фосфатазы из культуральной жидкости, содержащей лимонную кислоту и имеющей активность фосфатазы, путем ультрафильтрации через мембрану, удерживающую молекулярную массу фосфатазы от 5000 до 50000, при температуре 5-50°С, давлении 0,1-0,6 МПа, скорости потока через мембрану 4-60 кг/м²·ч. После разделения ультрафильтрацией получают раствор, имеющий активность фосфатазы 5-50 μKat·1^-1 и концентрат, имеющий активность фосфатазы 1500-50000 μKаt·1^-1 [5].

Таким образом, известным способом [5] получают из культуральной жидкости раствор лимонной кислоты, недостаточно очищенный от активных ферментов, и концентрат кислой фосфатазы. Раствор лимонной кислоты, имеющий активность 5-50 μKat·1^-1 фосфатазы, требует дальнейшего выделения примесей для получения чистого раствора кислоты.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выделение из ферментируемого раствора после ферментации среды на основе гидролизата крахмала грибом Aspergillus niger достаточно чистого раствора лимонной кислоты и раствора кислотостабильных амилолитических ферментов.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается способом получения лимонной кислоты из культуральной жидкости, включающим отделение мицелия гриба-кислотообразователя от ферментированного раствора, разделение ферментированного раствора ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу фермента, на раствор лимонной кислоты и раствор фермента, в котором согласно изобретению используют имеющую активность α-амилазы и глюкоамилазы культуральную жидкость, отделяют мицелий гриба-кислотообразователя Aspergillus niger при температуре ≤32°С, до разделения очищают ферментируемый раствор с температурой ≤32°С с помощью фильтрирующего или сорбирующего средства, причем используют мембрану с диаметром пор 0,65 мкм или суспензию бентонита или углеволокнистый материал типа Карбопон-актив, затем разделяют очищенный ферментированный раствор через мембрану, удерживающую молекулярную массу 1000-50000, на раствор целевого продукта и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В примерах используют ферментированный раствор, который получают ферментацией среды на основе гидролизата крахмала грибом Aspergillus niger и фильтрованием культуральной жидкости [6].

Ферментированный раствор представляет собой жидкость, концентрация лимонной кислоты в котором составляет 100-150 г/дм³, значение декстриногенной активности (ДАк) - (0,5-2,5) ед./см³, сахарогенной активности (САк) - (20,0-90,0) ед./см³, рН 1,3-2,8, оптическая плотность D при λ_mах 400 нм 1,9-2,5, при λ_maх 750 нм 2,0 - 3,0, характеризующая соответственно цветность и мутность раствора, содержание белка 1,5 - 5,0 г/дм³.

В примерах используют ферментированный раствор, имеющий концентрацию лимонной кислоты 125 г/дм³, ДАк 1,8 ед./см³, САк 58 ед./см³, D при λ_mах 400 нм 2,4, D при λ_mах 750 нм 2,34, содержащий 3,5 г/дм³ белка.

В качестве фильтрующего средства используют мембрану с диаметром пор 0,65 мкм, в качестве сорбирующего средства - активированную суспензию бентонита с содержанием бентонита 10 маc.%, или углеволокнистый материал Карбопон-актив.

Фильтрующие и сорбирующие средства выпускаются отечественной и зарубежной промышленностью. В примерах используют фильтрующую установку “Sartokan” фирмы Sartorius AG, Германия, оснащенную стандартными и минипатронами Sartopure РР 2559, в частности 559 15 05 Р7 с нормой удерживания 0,65 мкм. Для ультрафильтрации применен аппарат ВПУ НПК “Биотест”, г. Кириши, Россия, и набор мембран с различным удерживанием молекулярной массы (УММ): УМП-50 от 50·10³, Мифил-20 ПА от 20·10³, полые волокна - 15 ПС от 15·10³, Мифил - 10 ПА от 10·10³, полые волокна - 5 ПС от 5·10³, полые волокна - 1 ПС от 1·10³. Характеристика аппарата: рабочее давление составляет 0,1-0,2 МПа, скорость потока - 20-37 дм³/м²·ч.

В примерах используют известные способы анализа: определение содержания кислоты в растворах титриметрическим методом, определение оптической плотности растворов, декстриногенной и сахарогенной активностей с помощью колориметрического метода, белка - методом Лоури.

Пример 1.

В колбы объемом 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее подращенным мицелием. Колбы ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 6 сут при температуре 32°С. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в ферментированном растворе определяют оптическую плотность раствора, активность кислотостабильных амилолитических ферментов и концентрацию лимонной кислоты.

Ферментированный раствор объемом 2,5 дм³, имеющий температуру 20°С, пропускают через фильтрующую мембрану для удаления остатков мицелия, а затем раствор, содержащий кислоту и кислотостабильные амилолитические ферменты, разделяют ультрафильтрацией через мембрану марки УПМ-50 с пределом УММ 50,0·10³ на раствор кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов.

Результат опыта представлен в таблице.

Пример 2.

Ферментацию и очистку ферментированного раствора от остатков мицелия проводят согласно примеру 1.

Разделение раствора с температурой 15°С проводят ультрафильтрацией через мембрану Мифил - 20 ПА с пределом УММ 20,0·10³ мкм.

Результат опыта представлен в таблице.

Пример 3.

Ферментацию и отделение мицелия проводят аналогично примеру 1.

Ферментированный раствор объемом 0,5 дм³ с температурой 20°С пропускают через фильтрующую мембрану для удаления остатков мицелия, а затем раствор, содержащий лимонную кислоту и кислотостабильные амилолитические ферменты, разделяют ультрафильтрацией через мембрану полые волокна - 15 ПС с пределом УММ 15·10³.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 4.

Ферментацию, отделение мицелия и очистку ферментированного раствора через фильтрующую мембрану проводят аналогично примеру 3.

Ферментированный раствор с температурой 32°С, содержащий лимонную кислоту и кислотостабильные амилолитические ферменты, разделяют ультрафильтрацией через мембрану полые волокна - 5 ПС с пределом УММ 5·10³.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 5.

В условиях примера 1 к ферментированному раствору объемом 2,5 дм³ добавляют 2 г/дм³ предварительно подготовленной активированной суспензии с содержанием бентонита 10 маc.% и выдерживают смесь в течение 40 мин, после чего осадок отделяют, а раствор, содержащий два целевых продукта, подвергают ультрафильтрации, разделяя через мембрану Мифил - 10 ПА с пределом УММ 10,0·10³ на раствор кислоты и раствор комплекса ферментов.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 6.

Ферментацию, отделение мицелия проводят аналогично примеру 1.

Очистку ферментированного раствора объемом 0,5 дм³ с температурой 25°С проводят пропусканием его через углеволокнистый сорбент, в качестве которого используют нетканое полотно материала марки Карбопон-актив, имеющего объем сорбционных пор 0,80 см³/г и взятого в количестве 2,0 г на 1 дм³ раствора. Очищенный раствор, объемом 0,5 дм³, содержащий кислоту и комплекс ферментов, разделяют ультрафильтрацией через мембрану полые волокна - 1 ПС с пределом УММ 1,0·10³ на раствор кислоты и раствор комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 7 (по прототипу).

Получение ферментированного раствора проводят аналогично примеру 1. Ферментированный раствор объемом 1000 см³, содержащий 125 г лимонной кислоты и имеющий активность α-амилазы 1,8 ед./см³ и глюкоамилазы 58 ед./см³, подвергают ультрафильтрации при температуре 20°С через мембрану Мифил - 20 ПА с удерживанием молекулярной массы 20000, при рабочем давлении установки 0,2 МПа, скорости потока 25 дм³·м^-2·ч^-1 и получают 940 см³ слабоокрашенного фильтрата, содержащего лимонную кислоту и примеси белка 1,9 г/дм³, и 60 см³ концентрированного раствора кислотостабильных ферментов с активностью, ед./см³, α-амилазы 28,3, глюкоамилазы 570.

Данные опыта представлены в таблице.

Показатели качества ферментированного раствора, после очистки содержащего кислоту и ферменты, и растворов после разделения представлены в таблице в примерах 1-7.

Сравнение результатов, полученных в примерах 1-6 по предлагаемому способу и в примере 7 - по прототипу, показывает, что использование в примерах 1-6 ферментированного раствора с температурой ≤32°С позволяет после очистки от остатков мицелия с помощью фильтрующего или сорбирующего средства получить раствор, содержащий лимонную кислоту и комплекс ферментов с декстриногенной и сахарогенной активностью, который затем с помощью ультрафильтрации через мембрану с удерживанием молекулярной массы в пределе значений (1,0-50,0)·10³ разделяется на раствор кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов в качестве целевых продуктов.

В примере 7 (по прототипу) ферментированный раствор разделяют ультрафильтрацией и получают раствор, содержащий лимонную кислоту и примеси белковых веществ, а также раствор амилолитических ферментов. Примеси белковых веществ - 1,9 г/дм³, повышают цветность (Dλ₄₀₀ 0,58) и мутность (Dλ₇₅₀ 0,120) раствора лимонной кислоты, снижают качество ее, вызывают необходимость дальнейшей очистки раствора кислоты.

Таким образом, предлагаемым способом из ферментированного раствора после ферментации среды на основе гидролизата крахмала плесневым грибом Aspergillus niger получают два целевых продукта - чистый раствор лимонной кислоты и раствор комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Технологическая инструкция по производству пищевой лимонной кислоты. -Л.: ЛНИИПП, 1981, 130 с.

2. Патент РФ №2129612, МПК 6 С 12 Р 7/48, 1999.

3. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Агропромиздат, 1987, с.177.

4. Патент РФ №2159286, МПК 6 С 12 Р 7/48, 2000.

5. Патент №275986, МПК 5 С 12 Р 7/48, 1992.

6. Патент РФ №2132384, МПК 6 С 12 Р 7/48, С 12 N 1/14, 1999.

Формула изобретения

Способ получения лимонной кислоты из культуральной жидкости, включающий отделение мицелия гриба-кислотообразователя Aspergillus niger от ферментированного раствора, разделение ферментированного раствора ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу фермента, на раствор лимонной кислоты и раствор фермента, отличающийся тем, что используют имеющую активность α-амилазы и глюкоамилазы культуральную жидкость, отделяют мицелий гриба при температуре <32°C, до разделения очищают ферментированный раствор с температурой <32°C с помощью фильтрующего или сорбирующего средства, причем используют мембрану с диаметром пор 0,65 мкм или суспензию бентонита, или углеволокнистый материал Карбопон-актив, а затем разделяют очищенный ферментированный раствор через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на раствор целевого продукта и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов.