Способ обнаружения и идентификации токсичных агентов и устройство для его осуществления

 

Изобретение относится к методам анализа токсичных соединений и может быть использовано при экологическом мониторинге. Способ предусматривает подготовку проб, разделение на фильтрат и осадок, тонкослойную хроматографию, двумерный гель-электрофорез и регистрацию результатов анализа с помощью светящихся клеточных структур. По параметрам пятен ингибирования биолюминесценции определяют характеристические параметры Rf, а идентификацию токсичных агентов в исследуемой пробе проводят путем сопоставления измеренных параметров Rf с одноименными параметрами Rf базы данных токсичных агентов, сформированной для основных групп токсичных агентов и индивидуальных поллютантов по меньшей мере для двух систем растворителей. Устройство для осуществления способа включает измерительную камеру для размещения анализируемой хроматографической или электрофоретической пластины, телевизионную камеру, связанную с блоками обработки изображения, анализа и управления. При этом измерительная камера содержит средство для нанесения светящихся клеточных структур на поверхность анализируемой пластины. Блок обработки изображений включает блок выделения в каждом кадре изображения поверхности анализируемой пластины пятен ингибирования биолюминесценции клеточных структур и измерения параметров Rf упомянутых пятен. Блок анализа включает связанные между собой блок идентификации токсичных агентов, базу данных параметров Rf токсичных агентов. Способ и устройство обладают универсальностью и обеспечивают уменьшение продолжительности анализа. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к методам анализа токсичных соединений и может быть использовано для целей производственного контроля как инструмент экологического мониторинга.

Контроль экологической безопасности среды обитания основан на использовании современных методов анализа, средств и приборов, позволяющих проводить мониторинг в режиме текущего времени и объективизировать регистрацию (см. Экологическая химия. Основы и концепции //Под ред. Ф. Корте. М.: Мир, 1997) [1]. К числу наиболее чувствительных методов относятся люминесцентные методы. Так, известен метод определения в газовой среде присутствия клеточного материала и его количества, например, для военных целей (RU 2142016 С1, Сквиррелл, C 12 Q 1/04, 27.11.1999) [2]. Метод основан на выделении внутриклеточного содержимого, способного высвобождать АТФ или аденил-киназу из эукариотических клеток и грибковых спор или всего клеточного материала. Устройство для реализации метода имеет средства для отбора частиц из воздуха, введения их в жидкость и добавления люминесцентного реагента (люциферазы), детектирования количества света в светоизмерительных камерах с детекторами, которые выдают электрические сигналы на процессор, дисплей или принтер. Уровень люминесценции тем выше, чем большее количество токсичных компонентов находится в пробе.

В другом методе проводится анализ воздействия токсикантов на специально введенные в водную среду индикаторы - светящиеся бактерии (см., например, Стом Д.И., Гиль Т.А., Балаян А.Э. Бактериальная люминесценция и биотестирование // Иркутск: Изд-во Иркутского университета, 1993) [3]. Гашение биолюминесценции бактерий, регистрируемое люминометром, позволяет определить интенсивность свечения, а также динамику его изменения во времени, по которым рассчитывают показатель токсичности среды, например индекс выживаемости бактерий LC₅₀. Люминометр включает темновую камеру для размещения исследуемой среды, оптически сопряженную с фотоприемником и системой регистрации.

Описаны различные конструкции устройств, использующих люминесцентные методы (см., например, заявки фирм Microbics (ЕР 0757096 А2, С 12 М 1/00, 05.02.1997) [4], AZUR Environmental (GB 2334575 A, Darroch, G 08 B 29/26, 25.08.1999) [5]), предусматривающие приспособления для отбора проб и смешения с реагентами. В изобретении JP 62093634 Yasuhiro, G 01 N 21/76, 30.04.1987 [6] имеется система протяжки мембранного фильтра, выполняющая функции реактора для люциферазы. Описано автоматическое устройство проточного типа для контроля токсичности вод с использованием тест-образцов лиофилизированных пресноводных светящихся бактерий с соответствующей системой пробоотбора, измерения и управления (см. US 2001/0026936 А1, Park et al., C 12 M 1/34, 04.10.2001) [7].

Вместе с тем, за небольшим исключением, указанные методы [1-7] обладают малой селективностью - регистрируется интегральное значение светового потока, не привязанное к химическому и/или биологическому составу анализируемых токсикантов. Более того, если в одной и той же пробе конфликтуют оба процесса - как гашения, так и нарастания светимости, то результирующий спектр не отражает истинный характер процесса.

Известно, что селективностью и большей чувствительностью обладают методы анализа, основанные на физических методах разделении анализируемых смесей на входящие в них компоненты. К этим методам относятся гель-электрофорез (см., например, RU 2173464, Сучков и др., G 01 N 33/483, 10.09.2001 [8]; WO 97/20075 (RU 98112015 А, C 12 Q 1/68, 10.06.2000) [9], US 5897760, Biorad lab., 27.04.1999 [10]) и тонкослойная хроматография (см., например, RU 2177150 С2, Малахова и др., G 01 N 30/94, 20.12.2001 [11]), технология которых достаточно разработана. Однако анализ указанными методами для малых концентраций веществ является достаточно длительным процессом.

Совместное использование одного из упомянутых методов разделения - тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующим анализом методом гашения люминесценции описано в изобретении (US 6017722, Becvar, C 12 Q 1/66, 25.01.2000) [12], что дает основание по представленному в описании патента экспериментальному материалу прогнозировать возможность снижения времени и обеспечение селективности анализа. Способ идентификации токсикантов (пестицидов, гербицидов, тяжелых металлов и др.) предусматривает приготовление люминесцентных Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum и др.), разделение пробы, содержащей анализируемые токсичные вещества, на компоненты по меньшей мере на одной ТСХ пластине, обработку ТСХ пластины упомянутыми люминесцентными реагентами и наблюдение на ней люминесценции и выявление зон ингибирования люминесценции, идентификацию в исследуемом образце токсичных компонентов по характеристическим параметрам Rf областей ингибирования люминесценции по сопоставлению с одноименными параметрами Rf тестового образца. В тестовых образцах токсичные вещества идентифицируют отбором материала из зон ингибирования люминесценции ТСХ пластин и анализом их известными методами (масс-спектроскопии, инфракрасной спектроскопии, ЯМР, ТСХ, жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC)). Изобретение [12] является ближайшим аналогом патентуемого объекта “способ” группы изобретений.

Однако аналитические возможности метода и достоверность идентификации токсинов могут быть расширены за счет комплексирования с другим методом разделения - двумерным гель-электрофорезом, имеющим преимущества в части высокой точности и разрешающей способности, что и лежит в основе патентуемого метода. Кроме того, достоверность и качество анализа могут быть повышены за счет предварительной подготовки проб для анализа.

Экспрессность метода может быть достигнута с использованием устройства, в котором проводится обработка хромато- и электрофореграмм светящимися клеточными структурами, необходимая выдержка во времени и регистрация зон ингибирования биолюминесценции с последующей идентификацией токсичных агентов. Однако каких-либо сведений о возможности аппаратурной реализации такого метода в патентной литературе не выявлено.

Известно специализированное устройство для автоматизированного гель-электрофоретического анализа с использованием модуля (источника света и детектора) оптического распознавания (US 5275710, G 01 N 27/26, 04.01.1994) [13]. Однако в описанном случае сканирование изображений осуществляется при перемещении светового модуля по салазкам, что не вполне удобно, кроме того, не предусмотрены средства для реализации метода выделения зон ингибирования биолюминесценции.

Известно также компьютерное устройство с телевизионной камерой для фиксации изображения гель-электрофоретического образца в процессе проведения электрофореза (US 5717602, С 25 В 15/02, 10.02.1998) [14]. Компьютер выделяет положение и интенсивность рядов полос, образующихся вследствие миграции компонентов анализируемой пробы. Устройство содержит камеру для размещения электрофоретического образца, телевизионную камеру, связанную с компьютером, выполняющим функции накопителя цифровых данных, блоков управления процессом электрофореза и анализа процесса электрофореза. Изобретение [14] является ближайшим аналогом патентуемого объекта “устройство” группы изобретений.

Задачей настоящей группы изобретений является способ обнаружения и идентификации токсичных агентов и устройство для его осуществления, использующие наряду с принципами тонкослойной хроматографии метод двумерного гель-электрофореза и оптическую индикацию ингибирования биолюминесценции культур клеток.

Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала средств анализа токсичных агентов (токсинов, мутагенов, ингибиторов ферментов и т.д.) в пробах почвы, воды или ткани животного или растения и выявлении определенных веществ или класса веществ, к которым принадлежат данные соединения, при значительно уменьшенных временах анализа.

Технический результат достигается тем, что первый объект группы изобретений - способ обнаружения и идентификации токсичных агентов включает подготовку проб, разделение проб на составляющие с получением хроматографических пластин, нанесение на хроматографические пластины среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, регистрацию распределения светимости по площади хроматограмм с измерением характеристических параметров Rf пятен ингибирования биолюминесценции относительно фона и идентификацию компонентов по параметрам Rf базы данных.

Разделение проб на составляющие предусмотрено для фильтрата и осадка. При этом фильтрат подвергают ультрафильтрации с разделением на высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции, полученную высокомолекулярную фракцию дополнительно подвергают двумерному гель-электрофорезу с получением электрофоретических пластин, а низкомолекулярную - двумерному гель-электрофорезу с последующей двумерной тонкослойной хроматографией.

Осадок подвергают экстрагированию полярным и неполярным растворителем и последующей двумерной тонкослойной хроматографии с получением хроматографических пластин. На полученные электрофоретические и хроматографические пластины наносят среду, содержащую светящиеся клеточные структуры, а идентификацию токсичных компонентов в исследуемой пробе проводят путем сопоставления измеренных параметров Rf с одноименными параметрами Rf базы данных, сформированной для основных групп токсичных веществ и индивидуальных поллютантов по меньшей мере для двух систем растворителей.

Способ может характеризоваться тем, что в качестве светящихся клеточных структур используют генно-инженерный штамм Escherichia coli К-12 MG1655(pXen7) ВКПМ В8201.

Устройство для осуществления способа включает измерительную камеру для размещения анализируемой хроматографической или электрофоретической пластины, телевизионную камеру, связанную с блоками обработки изображений, анализа и управления. Измерительная камера содержит средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, на поверхность упомянутой пластины, блок обработки изображений включает средства выделения в каждом кадре изображения поверхности упомянутой пластины пятен ингибирования биолюминесценции клеточных структур и определения параметров Rf упомянутых пятен. Блок анализа включает связанные между собой блок идентификации токсичных агентов, базу данных параметров Rf токсичных агентов, сформированную для основных групп токсичных агентов и индивидуальных поллютантов по меньшей мере для двух систем растворителей и блок результатов анализа. При этом блок управления связан с элементами управления средства для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, блоков обработки изображений и результатов анализа.

Устройство может характеризоваться тем, что измерительная камера содержит средства для позиционирования упомянутой пластины, транспортирующее приспособление с приводом для взаимного перемещения упомянутой пластины относительно средства для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры.

Устройство может характеризоваться, кроме того, тем, что средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, представляет собой распылитель, связанный с дозатором раствора светящихся клеточных структур.

Устройство может характеризоваться и тем, что средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, представляет собой цилиндрический ролик, связанный с дозатором раствора светящихся клеточных структур.

Устройство может также характеризоваться тем, что измерительная камера содержит средства для поддержания заданных параметров температурного режима.

Существо патентуемой группы изобретений поясняется на чертежах, где:

на фиг.1 представлена схема процесса подготовки проб и измерений;

на фиг.2 - блок-схема устройства;

на фиг.3 - система регистрации и распознавания изображений.

Способ реализуют следующим образом (см. фиг.1).

Проба разделяется стандартным способом, то есть проводится экстрагирование с последующим центрифугированием с выделением фильтрата и осадка. При анализе плотных образцов в них добавляется вода или водный буфер и потом их содержимое экстрагируется.

Фильтрат подвергают ультрафильтрации для разделения на низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции, а затем проводят анализ.

А) Анализ низкомолекулярной фракции проводится с использованием метода двумерной тонкослойной хроматографии или двумерного гель-электрофореза с последующей тонкослойной хроматографией. Используется система оптимально подобранных растворителей (см. Кирхнер. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981, том 1) [15]. Далее, электрофоретические пластины (на схеме обозначены как ЭФП) или хроматографические пластины (на схеме - ХП) подвергаются обработке светящимися клеточными структурами. В качестве этих структур предпочтительно используется генно-инженерный штамм Escherichia coli K-12 MG1655 (рХеn7) ВКПМ В8201 (дата закладки 20.11.2001). Этот штамм производит люциферазу - Photorhabdus luminescens ZM1. Фенотипические характеристики штамма: прототроф. pXen7 - на основе вектора pUC18 и EcoR1 - фрагмента (7 т.п.н.) с генами lux-оперона из хромосомы Photorhabdus luminescens ZM1.

Обработка ЭФП и ХП жидким светящимся агентом может проводиться известными методами образования равномерного по толщине слоя покрытия. К ним относятся нанесение среды на поверхность пластин контактным способом с помощью пористых средств, пропитанных средой, подлежащей нанесению (например, с использованием движущейся ленты или валика, связанного с резервуаром, содержащим клеточные структуры (см., например, RU 2073863 C1, G 01 N 30/94, 20.02.1997) [16] или путем распыления среды). В качестве среды использован L-бульон с добавлением агара (0,5-0,7%) или агарозы (0,5-5%) с числом люминесцирующих бактерий (10⁶-10⁸ клеток).

Толщина покрытия составляет в зависимости метода нанесения покрытия от 10 до 50 мкм и подбирается экспериментально. Необходимо, чтобы в результате протекания реакции ингибирования биолюминесценции контраст “фон-пятно” был достаточен для распознавания параметра Rf. Затем после адаптации культуры в течение 30-40 минут образцы ЭФП и ХП помещают в оптический сканер, регистрирующий распределение светимости по площади пластин во времени. Информация о распределении светимости в цифровом виде обрабатывается в персональном компьютере, где проводится сравнение полученных данных с базой данных характеристического параметра Rf. Эта база данных для параметра Rf построена для основных групп токсичных веществ и наиболее часто встречающихся индивидуальных поллютантов для двух оптимально подобранных систем растворителей. Методика построения баз данных Rf описана [15]. При совпадении экспериментальных Rf со значениями Rf, хранящимися в базе данных, делается вывод о наименовании класса токсичных веществ или виде индивидуального токсина.

Б) При анализе высокомолекулярных токсинов, являющихся бактериальными белками, используется двумерный гель-электрофорез. Методика разделения реализуется нижеописанньм образом.

1. Трубочки первого направления электрофоретического разделения заполняют гелем состава: 4,5% акриламида и бисакриламида (28,4:1,6), 10% глицерина и 2% амфолинов (применяются амфолины широкого спектра р1 3-10) на 9/10 ее длины. Трубочки выдерживают 15-20 мин до окончания полимеризации приготовленного раствора.

2. Подготовленные трубочки вставляют в прибор для изоэлектрофокусирования. Пустые ячейки камеры герметизируют при помощи стеклянных палочек.

3. Заполняют верхнюю камеру растворами 0,2 М NaOH, а нижнюю камеру - раствором 1 М Н₃РO₄. Далее проводят префокусировку трубочек с наслаиваемым раствором состава: 10 мкл 5% глицерина и 2% амфолинов при напряжении 200V в течение 20 мин, 400V - 200 мин и 600V - 200 мин.

4. Из камеры для изоэлектрофокусирования сливают раствор и удаляют раствор для префокусирования.

5. Верхнюю камеру заполняют раствором 0,2 М NaOH и в трубочки наносят пробы следующим образом. Пробу или образец в воде + 10% глицерина + 2% амфолинов вводят в трубочку первого направления в объеме 10 мкл и наслаивают 10 мкл 5% глицерина и 2% амфолинов.

6. После нанесения образцы фокусируются в режиме 1W на трубочку 12-16 часов.

7. Гель выдавливается из трубочек при помощи резиновой груши и разрезается на две части.

8. Кислая часть гелевого стержня (часть, бывшая в контакте с Н₃РO₄) отмачивается в буфере Трис-НСl рН 6,8 [Laemmli, Nature, 1970, v.227, pp.680-685] без SDS.

9. Щелочная часть гелевого стержня (бывшая в контакте с NaOH) отмачивается в К-ацетатном буфере той же молярности.

10. Между стеклянными пластинами заливают электрофоретический однородный или градиентный гель с разделяющим уксуснокислым буфером рН 4,3 и концентрирующим гелем рН 5,8 для щелочных белков и с разделяющим Трис-НСl-буфером рН 8,8 и концентрирующим буфером с рН 6,8 для кислых белков. Пластины помещают в электрофоретические камеры второго направления.

11. Трубочки уравновешивают раствором, аналогичным буферу концентрирующего геля с красителем: для кислых белков - бромфеноловый синий, для щелочных - метиловый зеленый.

12. Гелевые стержни накладывают на торцевые части пластин (2-го направления), между которыми находится полимеризованный гель, и закрепляют с помощью 1%-ного водного раствора агарозы.

13. Камеры заполняют буфером Трис-глициновым (рН 8,8) для кислых белков и уксусно-аланиновым (рН 4,2) для щелочных белков.

14. Электрофорез проводят при напряжении 100V до входа разделяемых белков в разделяющий гель. Индикация проводится по синей или зеленой полосе красителя. Электрофорез считается законченным после того, когда краситель окажется в нижней части пластин, примерно в 1-3 мм от нижнего края геля. Пластины после окончания гель-электрофореза вымачивают в полиэтиленгликоле с большим молекулярным весом (100 кДа и более).

15. После этого пластины уравновешивают средой для выращивания бактерий или культур эукариотических клеток, промывая этой средой пластину 4 раза по 1 часу.

Далее, электрофоретические, как и хроматографические пластины подвергают обработке светящимися клеточными структурами, аналогично вышеописанной в п.А.

Если покрытие средой проводят посредством пульверизатора [16], то для получения однородного покрытия используют известный прием - взаимное перемещение, например зигзагообразное, пульверизатора относительно поверхности пластины.

При двумерном гель-электрофорезе место биологически активного белка определяется по его изоточке и молекулярной массе. Разделенные посредством двумерного гель-электрофореза бактериальные токсины переносят на фильтр с высокой способностью сорбировать белки путем электроблотинга (Maldov et al. Arch. Virol., v.127, p.321-325, 1992) [17]. Далее фильтр троекратно отмывается в среде для выращивания бактерий, после чего проводится та же процедура посева бактерий и идентификации токсинов, что и после проведения тонкослойной хроматографии.

Осадок, полученный после первого центрифугирования, подвергают экстрагированию полярным растворителем (спиртом, фенолом), затем проводят второе центрифугирование. Фильтрат направляют на тонкослойную хроматографию, далее хроматографические пластины подвергают обработке средой со светящимися клеточными структурами, проводят оптическое сканирование и распознавание изображений, идентификацию токсичных агентов описанным выше путем. Осадок подвергают экстрагированию неполярным растворителем (гексан, бензол, толуол), разделяют центрифугированием. Далее проводят тонкослойную хроматографию. Полученные хроматограммы так же, как и в предыдущих случаях, обрабатывают средой со светящимися клеточными структурами и регистрируют параметры пятен ингибирования биолюминесценции.

Патентуемый способ может быть осуществлен с использованием устройства, блок-схема которого описана на фиг.2.

Устройство содержит измерительную камеру 10, имеющую по меньшей мере три отсека: отсек 12 для введения в устройство анализируемой хроматографической или электрофоретической пластины 14, средства 16 для позиционирования пластины 14, шлюз 18 со средством 20 контроля наличия пластины 14 на транспортирующем приспособлении 22, снабженным управляемым приводом 24.

Отсек 12 сообщен с отсеком 26, имеющим раздаточный элемент 28 с дозатором 30 для подачи раствора светящихся клеточных структур (бактерий). Для распределения по поверхности пластины 14 упомянутого раствора предусмотрено средство 32 с приводом 34.

Отсек 26 сообщен с отсеком 36, предназначенным для регистрации свечения поверхности пластины 14 и выявления пятен ингибирования биолюминесценции. Отсек 36 содержит твердотельную телевизионную камеру 38, подключенную к блоку 40 регистрации и распознавания изображений, который соединен с блоком 42 управления. С блоком 42 связаны средства 16 позиционирования, средства 20 контроля, привод 24, дозатор 30, привод 34.

На фиг.3 представлена структурная схема оптической части информационной системы, реализуемая в отсеке 26. Телевизионная камера 38 размещена над пластиной 14 таким образом, что в поле зрения находится поверхность 50 пластины 14 с пятнами 52, координаты которых Rf подлежат определению. Камера 38 содержит фотоприемную ПЗС-матрицу 382, связанную с аналого-цифровым преобразователем (АЦП) 384.

Цифровой выход АЦП 384 подключен к интерфейсу 402 системы 40. Интерфейс может быть организован по известным стандартам (СОМ, USB, параллельный порт). Интерфейс 402 связан с блоком 404 записи фильма в файл, блок 404 связан с блоком 406 нормирования формата кадра и далее подключен к блоку 408 выделения координат пятен ингибирования биолюминесценции, являющихся параметрами для дальнейшей идентификации токсинов. Блок 408 связан с блоком 410 анализа и идентификации, который связан с базой 412 данных эталонов Rf, созданной для наиболее часто встречающихся токсинов. Блок 410 связан с блоком 414 результатов анализа, предусматривающих средства визуализации и документирования полученной информации.

Устройство работает следующим образом.

Обработанная патентуемым способом хроматографическая или электрофоретическая пластина 14 вводится в отсек 12 через шлюз 18, помещается на ложемент транспортирующего приспособления 22 и позиционируется посредством средства 16 для позиционирования. Позиционирование проводится таким образом, чтобы при дальнейшем перемещении пластины 14 она последовательно переводилась в отсек 26, а затем в отсек 36. Для автоматизации процесса анализа и сигнализации местоположения пластины в отсеках имеются датчики и соответствующие элементы системы управления, хорошо известные в технике и используемые по прямому назначению (не показаны, так как не характеризуют существа изобретения).

Факт введения анализируемой пластины 14 в отсек определяется по сигналу с датчика 20, по этому же сигналу средство 16, например механический зажим, фиксирует пластину 14 на ложементе транспортирующего приспособлении 22 и включает таймер начала работы.

Для покрытия поверхности 50 пластины 14 светящимися клеточными структурами она транспортируется в отсек 26. При наличии пластины 14 в отсеке 26 на нее посредством раздаточного элемента 28 с дозатором 30 наносят раствор светящихся бактерий. Для равномерного распределения упомянутого раствора по поверхности пластины 14, а это является важным условием реализации способа идентификации, предусмотрено средство 32 с приводом 34. В качестве этих средств 32, 34 может быть использован пульверизатор или цилиндрический ролик с подачей раствора светящихся клеточных структур, обкатывающий поверхность пластины, по типу описанных в [16]. При использовании пульверизатора толщина наносимого слоя задается таймером по времени обработки. Кроме того, таймер позволяет выдержать пластину 14 с нанесенными светящимися клеточными структурами для проявления заданное время (например, 30-40 мин), которое подбирается экспериментально.

Далее, посредством транспортирующего приспособления 22 пластина передается в отсек 36, в котором проводится регистрация изображения ее поверхности для выделения характерных признаков Rf-координат пятен.

Камера 38 (твердотельная приемная матрица 382 на ПЗС-структуре) регистрирует светимость пластины 14 обычным телевизионным методом, формируя совокупность последовательности кадров, то есть фильм. Приемная матрица 382 подключена через аналого-цифровой преобразователь 384 к интерфейсу 402 блока 40 регистрации и распознавания изображений.

Система 40 реализована средствами персонального компьютера или с использованием специализированной ЭВМ, в силу чего интерфейс может быть организован по известным стандартам (СОМ, USB, параллельный порт). Интерфейс 402 связан с блоком 404 записи фильма в файл, который связан с блоком 406 нормирования формата кадра. Функции этого блока состоят в нормировании формата кадра с тем, чтобы можно было идентифицировать координаты пятен каждого из кадров каждой из вновь анализируемых пластин и связать цифровые данные между собой и эталонными данными. Далее, блок 408 выделения координат пятен проводит нахождение пятен ингибирования биолюминесценции, являющихся параметрами для дальнейшей идентификации токсинов. Критерии поиска пятен строятся исходя из общей теории распознавания изображений и не являются оригинальными. Каждый кадр характеризуется совокупностью значений Rf, описывающих состояние пятен ингибирования анализируемой пластины в регистрируемый момент времени. Контрастность пятен на общем фоне свечения поверхности во времени изменяется, поэтому оптимальный временной интервал регистрации устанавливается экспериментально.

Информация о выявленных координатах пятен Rf поступает в блок 410 анализа и идентификации, который связан с базой 412 данных эталонов Rf, определенных для наиболее часто встречающихся токсинов. Идентификация токсинов проводится покадрово сопоставлением цифровых образов эталонов Rf из базы 412 данных и координат пятен, выявленных в текущем кадре изображения образца. Полученные результаты в блоке 410 передаются в блок 414 результатов анализа. Этот блок, представляющий собой по существу блок стандартных компьютерных средств визуализации и документирования (память, монитор, принтер), проводит хранение полученных результатов по обнаружению и идентификации токсичных агентов в исследуемой пробе, выдачу распечаток, обработку данных.

Пример. Исследована проба воды из заросшей водорослями старицы в дельте Волги (Астраханская область, вблизи поселка Трудфронт). В указанной старице наблюдался замор рыбы, и целью исследования являлось установление его причины.

Проба анализировалась в соответствии с описанной методикой (см. фиг.1): разделялась в системе двумерный гель-электрофорез и тонкослойная хроматография. В первой из описанных систем было обнаружено два пятна. По значениям Rf было установлено, что одно из пятен принадлежит пептиду, другое - тяжелым металлам. Тяжелые металлы при последующей хроматографии в специфической системе растворителей разделились на 4 пятна, которые были идентифицированы как ртуть, свинец, кадмий и хром.

Пептид оказался единственным и по базе данных Rf является микроцистином. Последующий опыт по окраске нингидрином (окраска на аминокислоты и белки) и ингибированию протеинфосфатаз (микроцистин является сильным ингибитором протеинфосфатазы I) подтвердил, что выделенное вещество - микроцистин. Наличие идентифицируемых количеств такого легко распадающегося вещества после окончания цветения указывает на значительные его количества в прошлом. Следовательно, причиной замора рыбы явилось то обстоятельство, что старица пережила цветение Micrococcus aeroginosa, а наличие ртути, свинца, кадмия и хрома в концентрации 10^-8-10^-10 г/л не могло оказаться причиной замора рыбы ввиду предельно низких концентраций токсикантов.

Изобретение может быть использовано для решения задач экологии, токсикологии и фармакологии и позволяет выявить множествественность биологически активных агентов (токсинов, мутагенов, ингибиторов ферментов и т.д.) в образцах почвы, воды, ткани животного или растения и идентифицировать вещества или классы веществ, к которым принадлежат данные соединения. Способ не предназначен для обнаружения и идентификации только высокомолекулярных незаряженных и летучих низкомолекулярных соединений. Устройство позволяет реализовать патентуемый способ в автоматизированном режиме.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения и идентификации токсичных агентов, включающий подготовку проб, разделение проб на составляющие с получением хроматографических пластин, нанесение на хроматографические пластины среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, регистрацию распределения светимости по площади хроматограмм с измерением характеристических параметров Rf пятен ингибирования биолюминесценции относительно фона, и идентификацию компонентов по параметрам Rf базы данных, отличающийся тем, что разделение проб на составляющие предусмотрено для фильтрата и осадка, при этом фильтрат подвергают ультрафильтрации с разделением на высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции, полученную высокомолекулярную фракцию дополнительно подвергают двумерному гель-электрофорезу с получением электрофоретических пластин, а низкомолекулярную - двумерному гель-электрофорезу с последующей двумерной тонкослойной хроматографией, осадок подвергают экстрагированию полярным и неполярным растворителем и последующей двумерной тонкослойной хроматографии с получением хроматографических пластин, на полученные электрофоретические и хроматографические пластины наносят среду, содержащую светящиеся клеточные структуры, а идентификацию компонентов в исследуемой пробе проводят путем сопоставления измеренных параметров Rf с одноименными параметрами Rf базы данных, сформированной для основных групп токсичных агентов и индивидуальных поллютантов по меньшей мере для двух систем растворителей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве светящихся клеточных структур используют генно-инженерный штамм Escherichia coli К-12 MG1655(pXen7) ВКПМ В8201.

3. Устройство для осуществления способа по п.1, включающее измерительную камеру для размещения анализируемой хроматографической или электрофоретической пластины, телевизионную камеру, связанную с блоками обработки изображений, анализа и управления, в котором измерительная камера содержит средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, на поверхность упомянутой пластины, блок обработки изображений включает средства выделения в каждом кадре изображения поверхности упомянутой пластины пятен ингибирования биолюминесценции клеточных структур и определения параметров Rf упомянутых пятен, блок анализа включает связанные между собой блок идентификации токсичных агентов, базу данных параметров Rf токсичных агентов, сформированную для основных групп токсичных агентов и индивидуальных поллютантов по меньшей мере для двух систем растворителей и блок результатов анализа, при этом блок управления связан с элементами управления средства для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, блоков обработки изображений и результатов анализа.

4. Устройство по п.3, отличающееся тем, что измерительная камера содержит средства для позиционирования упомянутой пластины и транспортирующее приспособление с приводом для взаимного перемещения упомянутой пластины относительно средства для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, представляет собой распылитель, связанный с дозатором раствора светящихся клеточных структур.

6. Устройство по п.4, отличающееся тем, что средство для нанесения среды, содержащей светящиеся клеточные структуры, представляет собой цилиндрический ролик, связанный с дозатором раствора светящихся клеточных структур.

7. Устройство по любому из пп.4-6, отличающееся тем, что измерительная камера содержит средства для поддержания заданных параметров температурного режима.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3