Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине. В изобретении описаны полипептиды и нуклеиновые кислоты (нуклеотидные последовательности - в описании), кодирующие такие полипептиды, вызывающие или усиливающие иммунный ответ к белку HER-2/neu, а также их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Описан также слитый полипептид. Для иммунизации полипептид и слитый полипептид используют в сочетании с адъювантом. Предлагаются композиции для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида, а также композиции для иммунизации теплокровного животного против злокачественного образования на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида. Использование изобретения позволит более успешно осуществлять профилактику и терапию рака, в частности рака молочной железы. 10 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем смысле относится к полипептидам и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие полипептиды, вызывающим или усиливающим иммунный ответ к белку HER-2/neu, включающее их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu.

Предпосылки изобретения

Несмотря на громадные финансовые затраты и человеческих ресурсов, рак остается одной из главных причин смертности женщин в возрасте между 35 и 74 годами. Рак молочной железы является наиболее обычной малигнизацией у женщин и частота возникновения рака молочной железы возрастает. Заболевание диагностируют у каждой одной из девяти женщин. Обычные методы для лечения рака молочной железы основаны на сочетании хирургии, радиации и химиотерапии. При лечении некоторых малигниэаций эти методы дают иногда положительный эффект. Однако эти методы не всегда успешны в отношении всех малигнизаций и рак молочной железы является наиболее часто инкурабельным при попытке лечения некоторых стадий. Необходимы альтернативные методы предупреждения и терапии.

Обычным признаком малигнизированности является неконтролируемый клеточный рост. Возникновение раковых клеток связано с процессом превращения клеток нормального фенотипа в клетки с малигнизированным фенотипом, способными автономно расти. Амплификация и сверхэкспрессия генов соматической клетки считается обычным первичным событием, которое приводит к превращению нормальных клеток в малигнизированные клетки. Характеристики малигнизированного фенотипа кодируются онкогенными генами и передаются во время клеточного деления прогенам трансформированных клеток.

Непрерывное исследование онкогенов позволило идентифицировать не менее сорока онкогенов, действующих в малигнизированных клетках и ответственных за трансформацию или связанных с трансформацией. Онкогены распределили в разные группы на основании их предполагаемой функции или местонахождения их генных продуктов (таких как экспрессируемый онкогеном белок).

Полагают, что онкогены важны для некоторых аспектов нормальной клеточной физиологии. В этом отношении онкоген HER-2/neu является членом семейства онкогенов тирозиновых протеинкиназ и в высокой степени обладает гомологией с рецептором эпидермального ростового фактора. Онкоген HER/2-neu, предположительно, играет роль в клеточном росте и/или клеточной дифференциации. По-видимому, HER-2/neu индуцирует малигнизацию через количественные механизмы, которые являются результатом увеличенной или неограниченной экспрессии фактически нормального генного продукта.

HER-2/neu (р185) представляет собой белковый продукт онкогена HER-2/neu. Ген HER-2/neu является амплифицированным, а белок HER-2/neu - сверхэкспрессированным в разнообразных видах рака, включая рак молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и предстательной железы. HER-2/neu связан с малигнизацией. Обнаружено, что 50-60% карциномы протоков in situ и 20-40% всех видов рака молочной железы, а также субстанциальная фракция аденокарцином, возникает в яичниках, предстательной железе, толстой кишке и легких. HER-2/neu, прямо связанный не только с малигнизированным фенотипом, но и с агрессивностью малигнизации, был обнаружен у одной четвертой всех инвазивных видов рака молочной железы. Сверхэкспрессия HER-2/neu коррелирует с плохим прогнозом и рака молочной железы, и рака яичников. HER-2/neu представляет собой трансмембранный белок с относительной молекулярной массой 185 kd, длиной, приблизительно, 1255 аминокислот (аа). Он обладает внеклеточным связывающим доменом (ECD) из, приблизительно, 645 аа, обладающим 40%-ной гомологией с рецептором фактора роста эпидермиса (EGFR), высокогидрофобным трансмембранным якорным доменом (TMD) и карбоксиконцевым цитоплазматическим доменом (CD) из, приблизительно, 580 аа, обладающим 80%-ной гомологией с EGFR.

Из-за трудностей в современных методах терапии видов рака, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu, существует необходимость совершенствования, в данной области, соединений и композиций. Настоящее изобретение восполняет эту потребность и, кроме того, несет другие, связанные с этим, выгоды.

Краткое изложение существа изобретения

Вкратце отметим, что настоящим изобретением создали полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты (управляющие экспрессией таких полипептидов) и вирусные векторы (управляющие экспрессией таких полипептидов) для применения в иммунизации теплокровных животных или для изготовления лекарственного средства для иммунизации при малигнизациях, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с этим изобретением, можно представить в виде композиции, которая включает в себя фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Такой полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вирусный вектор или фармацевтическую композицию можно применить для иммунизации однократно (напр., при подозрении на малигнизацию) или периодически (напр., для индивидуумов с повышенным риском приобретенной или повторно приобретенной малигнизации). Лекарственное средство для иммунизации может быть полезным при лечении имеющейся опухоли или для предупреждения возникновения или повторного появления опухоли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения создали полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из: (а) нуклеотидов 2026-3765SEQ ID NO:1; и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуют с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 из SEQ ID NO: 1 при умеренно строгих условиях, где последовательность ДНК кодирует полипептид, который дает иммунный ответ на белок HER-2/neu. В предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 от лизина, аминокислоты 676, до валина, аминокислоты 1255, или ее вариант, который дает, как минимум, эквивалентный иммунный ответ. Предусмотрено создание композиции, которая включает в себя полипептид настоящего изобретения, в соединении с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создание полипептида или композиции настоящего изобретения для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. В следующем варианте настоящего изобретения такой полипептид или композицию используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать молекулу нуклеиновой кислоты, управляющую экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации путем трансфекции клеток теплокровного животного молекулой нуклеиновой кислоты. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такую молекулу нуклеиновой кислоты используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации, путем инфицирования клеток теплокровного животного данным вектором. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такой вирусный вектор используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

Эти и другие цели настоящего изобретения становятся ясными при обращении к нижеследующему детальному описанию и прилагаемым чертежам.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет результаты праймирования первичных Т-лимфоцитов полипептидом HER-2/neu с помощью дендритных клеток. Производимые костным мозгом DC генерировали с помощью GM-CSF и IL6 из СD34+-стволовых клеток. DC, пульс-меченные по полипептиду HER-2/neu, индуцировали протеин-специфическую пролиферацию автологичных CD4+/CD45RA+-Т-лимфоцитов после 7 дней культивирования Т-клеток с DC. Производимые костным мозгом СD34+-стволовые клетки культивировали в течение одной недели в бессывороточной среде, содержащей GM-CSF и IL-6, использовали в качестве АРС. АРС помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning, NY, США) при различных концентрациях и инкубировали в течение 16-18 часов с 20-25 мкг/мл рекомбинантного полипептида HER-2/neu. Из автологичных моноядерных клеток периферической крови выделяли СD4+-Т-лимфоциты в результате положительной селекции, используя колонки для проведения хроматографии по иммуносродству (CellPro, Inc., Bothell, WA, США). Антиген-меченные АПК- облучали (10 Gy) и в каждую лунку добавляли 10⁵ СD4+-Т-лимфоцитов. Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению (³H)-тимидина (1 мкКи/лунку), добавляемого на 7-й день в течение 16-18 часов. Анализ пролиферации осуществляли в бессывороточной и цитокин-свободной среде в 5 репликах. Приведенные символы соответствуют: DC + полипептид HER-2/neu + СD4+/СD45RА+-Т-клетки; DC + СD4+/СD45RА+-Т-клетки; и DC + полипетид HER-2/neu.

Фигура 2 показывает ответ СD4+-клеток на полипептид HER-2/neu. Применяя метод праймирования, описанный для Фигуры 1, СD4+-Т-клетки от нормальных доноров тестировали на ответ к человеческому рекомбинантному полипептиду HER-2/neu. Приведенные символы соответствуют: SC-+CD4; и SC+СD4+НЕR-2/nеu-полипептид. "SC" - это стволовые клетки.

Фигура 3 показывает, что крысы, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu, вырабатывают специфические крысиные антитела nеu. Крыс иммунизировали рекомбинантным крысиным полипептидом HER-2/neu, 25 а.е.м.г, в MPL или vaccel-адъюванте. Было проведено три иммунизации, каждая с 20-дневным интервалом. Через двадцать дней после последней иммунизации у крыс определяли антительный ответ на крысиный nеu. Животные, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu и vaccel-адъювантом, показали высокий титр специфических ответов крысиного nеu. Контрольных животных иммунизировали человеческим полипептидом HER-2/neu (чужеродный белок). В отдельных экспериментах крысы, иммунизированные 100 а.е.м.г и 300 а.е.м.г очищенного целого крысиного nеu, не вырабатывали детектируемых специфических антител nеu (данные не показаны). Данные представляют среднее и стандартное отклонение по 3 животным. Приведенные символы соответствуют: крысиный полипептид HER-2/neu/MPL; крысиный полипептид HER-2/nеu/vaccel; только MPL; только vaccel; и контроль. "MPL" и "vaccel" представляют собой адъюванты (Ribi, Bozeman, МТ, США). "Neu" представляет собой HER-2/neu-белок.

Фигура 4 показывает, что пациенты с раком молочной железы обладают предсуществующим иммунитетом к полипептиду HER-2/neu. Пациента РМВС оценивали по включению тритиированного тимидина в 24 реплики. Отвечающие лунки оценивали как превышающие среднее и 3 стандартных отклонения (372 имп/мин) контрольных лунок. Этот пациент с позитивной стадией II рака молочной железы обладал существенным ответом на рекомбинантный человеческий полипептид HER-2/neu. Символ "р" соответствует пептидам белка HER-2/neu, символ "tt" соответствует столбнячному анатоксину, а символ "hHNP" соответствует рекомбинантному человеческому полипептиду HER-2/neu.

График на фигуре 5 иллюстрирует анализ высвобождения ⁵¹Сr, демонстрирующий ICD-специфичную активность ЦТЛ в линии Т-клеток, полученной путем примирования дендритных клеток (ДК), инфицированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ICD. Анализ представлял собой стандартный 4-часовой анализ высвобождения ⁵¹Сr; мишени представляли собой аутологичные B-LCL, инфицированные рекомбинантным возбудителем коровьей оспы, экспрессирующим ICD, EGFP, или ничем не инфицированные. Каждая точка является усредненным результатом по трем сериям.

На фигуре 6 проиллюстрированы результаты анализа IFNy ELISPOT CD8⁺ Т-клеточных линий, полученных путем примирования ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, в качестве антиген-презентирующих клеток. Результаты показаны в трек сериях в двух линиях, стимулированных в одном из циклов либо ДК, инфицированными аденовирусом-ICD (А), либо анти-СD3 (В), протестированных на аутологичных фибробластах, трансдуцированных ICD или EGFP. Фибробласты обрабатывали IFNγ за 48-72 часа до анализа и промывали для удаления цитокина. На лунку высевали 2×10³ стимуляторов при 2×10⁴ респондеров для исходной клеточной линии и при 4×10⁴ респондеров для стимулированной клеточной линии.

Подробное описание изобретения

Перед изложением данного изобретения и для его понимания полезно разъяснить используемые в нем некоторые термины.

Полипептид HER-2/neu, - как он используется здесь, относится к части белка HER-2/neu (данный белок известен также как р185 или с-еrbВ2), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2^- от лизина, аминокислота 676, до валина, аминокислота 1255; и может быть получен естественным образом, синтетически, биотехнологически или можно получить его функционально эквивалентный вариант, напр., при замене одной или нескольких аминокислот другой аминокислотой (кислотами) или не аминокислотой (кислотами), что существенно не влияет на получение или усиление иммунного ответа к белку HER-2/neu (напр., вариант стимулирует ответ с помощью хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток).

Пролиферация Т-клеток, - как она используется здесь, включает в себя размножение Т-клеток, а также стимуляцию Т-клеток, ведущую к размножению, т.е. инициацию событий, приводящих к митозу, и митозу как таковому. Способы обнаружения пролиферации Т-клеток обсуждаются ниже.

Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к соединениям и композициям, вызывающим или усиливающим иммунитет к белковому продукту, экспрессированному онкогеном HER-2/neu, включающего малигнизацию у теплокровного животного, у которого амплифицированный ген HER-2/neu ассоциирован с малигнизациями. Ассоциация амплифицированного гена HER-2/neu с малигнизацией не требует, чтобы экспрессируемый белковый продукт гена присутствовал в опухоли. Например, сверхэкспрессия экспрессируемого белкового продукта может быть вовлечена в инициацию опухоли, но экспрессия белка может быть затем утрачена. Настоящее изобретение можно применить для того, чтобы вызвать или усилить эффективный аутохтонный иммунный ответ для превращения HER-2/neu-позитивной опухоли в HER-2/neu-негативную.

Более конкретно, раскрытие настоящего изобретения, в соответствии с одной из целей, показывает, что полипептид, базирующийся на отдельной части (полипептид HER-2/neu) экспрессируемого белкового продукта гена HER-2/neu, может быть узнан тимус-зависимыми лимфоцитами (в дальнейшем "Т-клетки") и поэтому аутохтонный иммунный Т-клеточный ответ можно использовать профилактически или для лечения малигнизаций, в которых такой белок есть или был сверхэкспрессирован. Раскрытие настоящего изобретения показывает также, в соответствии с другой целью, что молекулы нуклеиновой кислоты, управляющие экспрессией такого пептида, можно использовать для иммунизации отдельно взятыми или в вирусном векторе.

Вообще, популяции CD4+ Т-клеток рассматривают по функции в качестве хелперов/индукторов, благодаря высвобождению лимфокинов при стимулировании специфическим антигеном; однако, подгруппа СD4⁺-клеток может действовать в качестве цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Аналогично рассматриваются по функции СD8⁺-Т-клетки, вследствие прямого лизиса антигенных мишеней; однако, в различных обстоятельствах они могут секретировать лимфокины, осуществляя хелперную или DTH-функцию. Несмотря на возможную перекрывающуюся функцию, фенотипические маркеры CD4 и CD8 сопряжены с узнаванием пептидов, связанных с антигенами МНС класса II или класса I. Узнавание антигена в контексте МНС класса II или класса I обязывает CD4⁺- и СD8⁺-Т-клетки отвечать на разные антигены или на один и тот же антиген, представленный в разных обстоятельствах. Связывание иммуногенных пептидов с антигенами МНС класса II наиболее обычно наблюдается для антигенов, поглощаемых антигенпрезентирующими клетками. Поэтому, CD4⁺-T-клeтки обычно узнают антигены, которые находились вовне опухолевых клеток. Напротив, при нормальных условиях, связывание пептидов с МНС класса II наблюдается только для белков, представленных в цитозоле и синтезированных самой мишенью, для белков внешней среды такая возможность исключается. Исключением из этого является связывание экзогенных пептидов с определенным мотивом, связывающим класс I, который находится за пределами клетки в высокой концентрации. Таким образом, CD4⁺- и СD8⁺-клетки обладают широко отличающимися функциями и тенденцией к узнаванию различных антигенов как отражением того, где эти антигены обычно пребывают.

Как описано в рамках настоящего изобретения, полипептидная часть белкового продукта, экспрессированного онкогеном HER-2/neu, распознается Т-клетками. Циркулирующий полипептид HER-2/neu деградирует до пептидных фрагментов. Пептидные фрагменты данного полипептида связываются с антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Благодаря расположению пептида, связанного с антигеном МНС на клеточной поверхности, и узнавания хозяйскими Т-клетками комбинации пептид плюс собственный антиген МНС, полипептид HER-2/neu (в том числе и экспрессированный на малигнизированной клетке) будет иммуногенным для Т-клеток. Тонкая специфичность Т-клеточного рецептора дает возможность отдельным T-клеткам распознавать пептиды, которые отличаются по единственному аминокислотному остатку.

В течение иммунного ответа на пептидный фрагмент данного полипептида Т-клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор, с высоким сродством связывающие комплекс пептид-МНС, будут связывать данный комплекс пептид-МНС и, таким образом, становиться активированными и индуцированными для того, чтобы пролиферировать. При первом столкновении с пептидом небольшое число иммунных Т-клеток будет секретировать лимфокины, пролиферировать и дифференцироваться на эффекторные и Т-клетки памяти. Первичный иммунный ответ, происходящий in vivo, трудно обнаруживать in vitro. Следующее столкновение с тем же антигеном Т-клеток памяти дает быстрый и более сильный иммунный ответ. Этот второй ответ можно наблюдать и in vivo, и in vitro. Данный in vitro ответ легко оценить путем измерения уровня пролиферации, уровня образования цитокинов или генерацией цитолитической активности Т-клеточной популяции, повторно подверженной действию антигена. Существенную пролиферацию Т-клеточной популяции в ответ на отдельный антиген считают указанием прежнего воздействия или праймирования по антигену.

Соединения этого изобретения повсеместно включают в себя HER-2/neu-полипептид или молекулы ДНК, которые управляют экспрессией таких пептидов, где молекулы ДНК могут присутствовать в вирусном векторе. Как отмечено выше, полипептиды настоящего изобретения включают в себя варианты полипептида SEQ ID NO:2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. Такие варианты включают различные структурные виды естественного полипептида. Благодаря наличию ионизируемых амино- и карбоксильных групп, к примеру, полипептид HER-2/neu может существовать в виде кислой или основной соли или находиться в нейтральной форме. Отдельные аминокислотные остатки можно также модифицировать окислением или восстановлением.

Варианты, в рамках объема настоящего изобретения, включают также полипептиды, в которых первичная аминокислотная структура естественного полипептида HER-2/neu модифицирована в результате образования ковалентных или агрегативных конъюгатов с другими пептидами или полипептидами, или химическими составляющими, такими как гликозильные группы, липидные, фосфатные, ацетильные группы и т.п. Ковалентные производные можно получить, например, путем присоединения отдельных функциональных групп к боковым аминокислотным цепям или к N- или С-концам.

Настоящее изобретение включает также в себя гликозилированные или негликозилированные HER-2/neu-полипептиды. Полипептиды, экспрессируемые в экспрессионных системах дрожжей или млекопитающих, в зависимости от экспрессионной системы, могут быть похожими или незначительно отличаться по молекулярному весу и типу гликозилирования, в сравнении с естественными молекулами. Например, экспрессия ДНК, кодирующей полипептиды в бактериях, таких как Е.coli, обычно дает негликозилированные молекулы. N-гликозилированные сайты эукариотических белков характеризуются аминокислотным триплетом Asn-A₁-Z, где A₁ представляет собой любую аминокислоту, за исключением Pro, a Z представляет собой Ser или Thr. Полипептидные варианты HER-2/neu, имеющие инактивированные N-гликозилированные сайты, можно получить с помощью методик, известных рядовым специалистам в данной области, таких как методики олигонуклеотидного синтеза и лигирования или сайт-специфичного мутагенеза, и представленных в рамках объема этого изобретения. Альтернативно, к полипептиду HER-2/neu можно добавить N-сцепленные гликозилированные сайты.

Полипептиды этого изобретения включают также варианты полипептида SEQ ID NO:2 (т.е. варианты полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255), которые имеют аминокислотную последовательность, отличающуюся от этой последовательности из-за одной или нескольких делеций, вставок, замен или других модификаций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие варианты, по существу, гомологичны естественному полипептиду HER-2/neu и сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. "Существенная гомология", в том смысле как она здесь используется, относится к аминокислотным последовательностям, которые могут быть кодированы последовательностями ДНК, способными гибридизовать в умеренно строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной естественно встречаемой последовательности ДНК, кодирующей указанную здесь часть SEQ ID NO:2 (т.е. нуклеотиды 2026-3765 SEQ ID NO:1). Соответствующие умеренно строгие условия включают в себя предварительную отмывку в растворе 5 Х SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5 Х SSC, в течение ночи; последующее промывание, дважды, при 65°С в течение 20 минут в каждом промывании, 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC (содержащего 0,1% SDS). Такие гибридизующие последовательности ДНК также представлены в рамках объема этого изобретения. Действие любой такой модификации на способность полипептида HER-2/neu давать иммунный ответ можно легко определить (напр., анализируя способность мутантного полипептида HER-2/neu индуцировать Т-клеточный ответ, используя, например, методы, описанные здесь).

Обычно, аминокислотные замены можно произвести различными способами, чтобы создать другие варианты осуществления в рамках настоящего изобретения. Во-первых, аминокислотные замены можно, например, осуществить консервативно, т.е. замещаемую аминокислоту заместить аминокислотой, которая обладает сходными свойствами, так чтобы специалист в области пептидной химии мог бы рассчитывать, что вторичная структура и гидрофильная природа данного полипептида существенно не изменится. В большинстве случаев консервативным изменениям соответствуют нижеследующие группы аминокислот: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Примером неконсервативного изменения является замещение аминокислоты одной группы на аминокислоту другой группы.

Другой способ осуществить аминокислотные замены, с образованием вариантов настоящего изобретения, состоит в идентификации и замещении аминокислот в мотивах Т-клеток, для возможного связывания с молекулами МНС класса II (для СD4⁺-Т-клеточного ответа) или с молекулами МНС класса I (для СD8⁺-Т-клеточного ответа). Пептидные сегменты (полипептида HER-2/neu), с мотивом для теоретически возможного связывания с молекулами МНС класса II, можно идентифицировать в компьютерном анализе. Например, можно использовать аналитический пакет белковой последовательности, Т Sites, который включает несколько компьютерных алгоритмов, предназначенных для различения возможных сайтов для Т-клеточного узнавания (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991). Использовали два поисковых алгоритма: (1) алгоритм AMPHI, описанный Margalit (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138:2213-2229, 1987), идентифицирующий эпитопные мотивы по альфа-спиральной периодичности и амфипатичности; (2) алгоритм Rothbard и Taylor, идентифицирующий эпитопные мотивы по заряду и паттерну полярности (Rothbard и Taylor, EMBO 7:93-100, 1988). Сегменты обоих мотивов более всего подходят для связывания молекул МНС класса II. СD8⁺-Т-клетки узнают пептид, связанный с молекулами МНС класса I. Falk et al. определили, что пептиды, связывающиеся с отдельными молекулами МНС, обладают различимыми последовательностями мотивов (Falk et al., Nature 351:290-296, 1991). Пептидный мотив для связывания в бороздке HLA-A2.1 определили путем Эдмановской деградации пептидов, удаленных из молекул HLA-A2.1, культивируемой клеточной линии (Таблица 2, из Falk et al., см. выше). Способ, идентифицирующий обычный или усредненный, связывающий HLA-A2.1 пептид, состоящий из 9 аминокислот в длину с доминантным якорным остатком, встречается в положении 2 (L) и 9 (V). Обычно наблюдаемые, сильно связывающие, остатки были идентифицированы в положениях 2 (М), 4 (Е, К), 6 (V), и 8 (К). Данный идентифицированный мотив представляет среднее многих связывающих пептидов (см. таблицу)

Полученный пептидный мотив, определенный как теоретический, не является особенно строгим. Некоторые связывающие HLA-A2.1 пептиды, не содержащие ни доминантных якорных остатков, ни аминокислот, фланкирующих доминантные якорные остатки, играют главную роль в осуществлении или неосуществлении связывания. Не каждый пептид в представленном связывающем мотиве будет связывать, но некоторые пептиды без данного мотива будут связывать. Однако представленный мотив является достаточно ценным для осуществления идентификации некоторых пептидов, способных к связыванию. Отметим, что представленный HLA-A2.1-мотив несет 6 аминокислот между доминантными якорными аминокислотами по остаткам 2 и 9.

Последующую идентификацию пептидных мотивов в рамках полипептида HER-2/neu, аминокислотных замен, можно осуществить консервативно и неконсервативно. Последний тип замен предназначен для получения улучшенного полипептида, который является более сильным и/или перекрестно реагирует более обширно (МНС полиморфизм). Примером более сильного полипептида является тот, который связан с высоким сходством с той же молекулой МНС в качестве естественного полипептида, не влияя на специфичное узнавание Т-клетками естественного полипептида. Примером полипептида с расширенной перекрестной реактивностью является тот, который более широко индуцирует перекрестно-реагирующие иммунные ответы (т.е. связывается с большим рядом молекул МНС), чем естественный полипептид. Аналогично, одна или несколько аминокислот, находящиеся между пептидными мотивами и обладающие спейсерной функцией (напр., препятствует взаимодействию с молекулой МНС или Т-клеточным рецептором), могут быть замещены консервативно или неконсервативно. Рядовым специалистам в данной области очевидно, что полипептиды, содержащие одну или несколько аминокислотных замен, можно протестировать на полезность или вредность иммунологических взаимодействий в разнообразных опытах, в том числе и в тех, которые описаны здесь, что касается способности стимулировать Т-клеточное узнавание.

Варианты в рамках объема этого изобретения могут также содержать или, напротив, не содержать другие модификации, включая удаление или добавление аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на нужные иммунологические свойства данного полипептида. Для рядовых специалистов в данной области понятно, что можно использовать неполные формы или неестественно протяженные формы полипептида HER-2/neu для создания требуемых иммунологических свойств, которые, приблизительно, эквивалентны полноразмерным формам естественного полипептида HER-2/neu. Цистеиновые остатки можно удалить или заместить другими аминокислотами, чтобы при ренатурации предотвратить образование некорректных внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Другие подходы в мутагенезе вовлекают модификацию смежных двуосновных аминокислотных остатков, чтобы усилить экспрессию в дрожжевых системах, в которых присутствует активность протеазы КЕХ2.

Обычно полипептид HER-2/neu можно получить, используя геномную или клоновую кДНК, кодирующую белок. Геномная последовательность, которая кодирует полноразмерный HER-2/neu, представлена в SEQ ID NO:1, а предсказанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2. Такие клоны можно выделить путем скринирования надлежащей экспрессионной библиотеки для клонов, которые экспрессируют белок HER-2/neu. Получение и скринирование библиотеки можно осуществить, используя методы, известные рядовым специалистам в данной области, такие как методы, описанные у Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y., 1989, которые включены здесь путем ссылки. Вкратце, их суть состоит в том, что экспрессионную библиотеку бактериофага культивируют на чашках и переносят на фильтры. Затем фильтры можно инкубировать с детектирующим реагентом. В контексте этого изобретения "детектирующий реагент" представляет собой любое соединение, способное связываться с белком HER-2/neu, которое можно затем выявлять любым из многих способов, известных рядовым специалистам в данной области. Обычные детектирующие реагенты, содержащие "связывающий агент", такой как протеин А, протеин G, IgG или лектин, присоединяются к репортерной группе. Предпочтительные репортерные группы включают в себя ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, красители, радионуклиды, люминисцетные группы, флуоресцентные группы и биотин. Более предпочтительно, чтобы репортерная группа представляла собой пероксидазу хрена, которую можно обнаружить в результате инкубации с субстратом, таким как тетра-метилбензидин или 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота. Бляшки, содержащие геномную или кДНК последовательность, которые экспрессируют белок HER-2/neu, выделяют и очищают методами, известными рядовым специалистам в данной области. Соответствующие методы можно найти, например, у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Варианты полипептида, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ, можно, в большинстве случаев, получить путем модификации определенной последовательности для одной или нескольких целей, описанных выше, анализируя полученный полипептид на способность стимулировать иммунный ответ, напр., Т-клеточный ответ. К примеру, такой анализ можно, как правило, осуществить в результате контактирования Т-клеток с модифицированным полипептидом и анализа полученного ответа. Естественно встречаемые варианты полипептида можно также выделить, например, путем скринирования надлежащей кДНК или геномной библиотеки с последовательностью ДНК, кодирующей полипептид или его вариант.

Вышеописанные модификационные последовательности можно интродуцировать, используя стандартные рекомбинантные методики, или путем автоматизированного синтеза модифицированного полипептида. Например, мутации можно интродуцировать в отдельные локусы путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, что дает возможность лигирования с фрагментами естественной последовательности. После лигирования, полученная перестроенная последовательность кодирует аналог, обладающий требуемой аминокислотной вставкой, заменой или делецией.

Альтернативно, можно применять методики олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза для создания гена, в котором отдельные кодоны изменены в соответствии с требуемой заменой, делецией или вставкой. Типичные методы по осуществлению указанных выше изменений описаны Walder et al., Gene 42:133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; и в Патентах США №4518584 и №4737462.

Мутации в нуклеотидных последовательностях, сконструированных для экспрессии таких HER-2/neu-полипептидов, должны, конечно, сохранять открытую рамку считывания кодирующих последовательностей и, предпочтительно, не должны создавать комплементарных областей, которые могли бы гибридизовать с произведенными вторичными структурами мРНК, такими как петли или шпильки. Хотя сайт мутации можно заранее определить, нет необходимости в том, чтобы определять природу мутации per se. Например, с целью отбора мутантов с оптимальными характеристиками по данному сайту, можно осуществить случайный мутационный процесс по кодону-мишени, а экспрессированные мутантные полипептиды HER-2/neu скринировать по нужной активности.

Не все мутации в нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид HER-2/neu, будут экспрессироваться в конечный продукт. Например, можно осуществить нуклеотидные замены, которые усиливают экспрессию, в первую очередь, чтобы избежать образования в транскрибированной мРНК вторичной структуры в виде петель (см., напр.. Европейскую Патентную Заявку №75444А) или чтобы создать кодоны, которые более легко транслируются при помощи выбранного хозяина, такие как хорошо известные предпочтительные кодоны Е.coli для экспрессии в Е.coil.

Полипептиды настоящего изобретения, естественно встречаемые и модифицированные, предпочтительно получают с помощью методов рекомбинантных ДНК. Такие методы включают в себя операцию по введению последовательности ДНК, кодирующей полипептид HER-2/neu в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирование данной последовательности ДНК в рекомбинантной экспрессионной системе клетки бактерии, млекопитающего или насекомого в условиях, промотирующих экспрессию. Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, созданные с помощью этого изобретения, можно укомплектовать фрагментами кДНК и короткими олигонуклеотидными линкерами или наборами олигонуклеотидов для создания синтетического гена, который может быть вставлен в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирован в рекомбинантной экспрессионной единице.

Рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность ДНК, кодирующей HER-2/neu-полипептид, присоединенный путем сшивки к подходящим транскрипционным или трансляционным элементам, получали из генов млекопитающего, бактерии, вируса или насекомого. Такие регуляторные элементы включают в себя промотор транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующую мРНК рибосомных сайтов связывания, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Можно дополнительно инкорпорировать начало области репликации и селектируемый маркер для усиления узнавания трансформантов.

Области ДНК, когда они функционально связаны друг с другом, присоединяют путем сшивки. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторный лидер) присоединяют путем сшивки к ДНК полипептида, если она экспрессируется в качестве предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор присоединяют путем сшивки к кодирующей последовательности, если она контролирует транскрипцию данной последовательности; а рибосомный участок связывания присоединяют путем сшивки к кодирующей последовательности, если она расположена таким образом, что допускает трансляцию. Вообще, присоединение путем сшивки подразумевает сцепление, а для случая секреторных лидеров, в открытой рамке считывание. Последовательности ДНК, кодирующие HER-2/neu-полипептиды, экспрессированные в микроорганизме, предпочтительно не будут содержать интроны, которые могли бы преждевременно терминировать транскрипцию ДНК в мРНК.

Экспрессионные векторы для бактериального использования могут включать в себя селектируемый маркер и бактериальное начало области репликации, полученные из коммерчески доступных плазмид, включающие в себя генетические элементы хорошо известного клонирующего вектора pBR322 (ATCC 37017). Такие коммерческие векторы включают в себя, например, рКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Швеция) и pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, США). Эти части "остова" pBR322 комбинируют с надлежащим промотором и экспрессируют структурную последовательность. Е.coli обычно трансформируют, используя производные pBR322, плазмидные производные из штаммов Е.coli (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 содержит гены для амплификации и устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, таким образом, предоставляет простые способы по идентификации трансформированных клеток.

Промоторы, обычно используемые в рекомбинантных бактериальных экспрессионных векторах, включают в себя β-лактамазную (пенициллиназную) и лактозную промоторную систему (Chang et al., Nature 275:615, 1978; и Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), триптофановую (три) промоторную систему (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; и Европейская Патентная Заявка №36776) и tac-промоторную (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982). Особенно полезная бактериальная экспрессионная система использует Р_L-промотор фага λ и термолабильный репрессор c1857ts. Плазмидные векторы доступны из Американской Коллекции Типовых Культур, в которой содержатся производные Р_L-промотора фага λ, включенного в плазмиду pHUB2, присущую штамму JMB9 Е.coli (ATCC 37092), и плазмиду pPLc28, присущую штамму RR1 Е.coli (ATCC 53082).

Соответствующие промоторные последовательности для дрожжевых векторов включают в себя промоторы для металлотионеина, 3-фосфоглицераткиназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) или для других гликолитических ферментов (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; и Holland et al., Biochem 17:4900, 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат-изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкоизомераза и глюкокиназа. Соответствующие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии описаны, кроме того, у R. Hitzeman et al. Европейская Патентная Заявка №73657.

Предпочтительные дрожжевые векторы можно укомплектовать, используя последовательности ДНК из pBR322 для селекции и репликации в Е.coli (ген Аmp^r и начало области репликации) и дрожжевые последовательности ДНК, включающие в себя репрессируемый глюкозой промотор ADH2 и секретируемый лидер α-фактора. Промотор ADH2 описан Russel et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) и Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Дрожжевой лидер α-фактора, который управляет секрецией гетерологичных белков, может быть вставлен между промотором и экспрессируемым структурным геном (см., напр., Kurjan et al. Cell 30:933, 1982; и Bitter et al. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81:5330, 1984). Лидерную последовательность можно модифицировать, чтобы она содержала вблизи своего 3'-конца один или несколько полезных сайтов рестрикции, способствующих слиянию лидерной последовательности с чужеродными генами. Транскрипционный и трансляционный контроль последовательностей в экспрессионных векторах, для применения трансформации клеток позвоночных, можно создать с помощью вирусных источников. Например, обычно используемые промоторы и энхансеры получают из полиомы, аденовируса2, обезьянего вируса 40 (SV40) и человеческого цитомегаловируса. Последовательности ДНК, полученные из вирусного генома SV40, например, начало области репликации SV40, ранний и поздний промотор, энхансер, сайты сплайсирования и полиаденилирования, можно использовать для создания других генетических элементов, необходимых для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК. Ранний и поздний промоторы являются особенно полезными, поскольку оба легко получить из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало области репликации SV40 (Fiers et al. Nature 273:113, 1978). Для включения можно также использовать маленькие или большие фрагменты SV40, создавая последовательность протяженностью, приблизительно, из 250 п.н., от сайта Hind III к сайту Вgl II, расположенному в вирусном начале области репликации. Кроме того, можно использовать вирусный геномный промотор, контрольную и/или сигнальную последовательности, создавая такие контрольные последовательности, которые совместимы с выбранной хозяйской клеткой. Типичные векторы можно сконструировать так, как описано у Okayama и Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983.

Полезную систему для стабилизации высокоэкспрессионных рецепторных кДНК млекопитающего в эпителиальных клетках молочной железы у С127-мыщей можно сконструировать практически такой же, какая описана у Cosman еt al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Предпочтительным эукариотическим вектором для экспрессии ДНК белка LbeIF4A является pDC406 (NcMahan et al.) EMBO J. 20:2821, 1991) и включает регуляторные последовательности, полученные из SV40, человеческого вируса иммунодефицита (HIV), и вируса Эпштейн-Барра (EBV). Другие предпочтительные векторы включают в себя pDC409 и pDC410, которые получены из pDC406. Вектор pDC410 получали из вектора pDC406 путем замещения начала области репликации EBV на последовательности, кодирующие большой Т-зависимый антиген SV40. Вектор pDC409 отличается от вектора pDC406, в котором сайт рестрикции Вgl II, за исключением множественного клонирующего сайта, был делетирован, получением уникального сайта Вgl II в рамках множественного клонирующего сайта.

Полезной клеточной линией, которая допускает эписомную репликацию экспрессионных векторов, таких как pDC406 и pDC409, содержащих начало области репликации EBV является CV-1/EBNA (АТСС CRL 10478). Клеточную линию CV-L/EBNA получили в результате трансфекции клеточной линии CV-1 геном, кодирующим ядерный антиген-I вируса Эпштейн-Барра (EBNA-1), а конститутивно экспрессируемый EBNA-1 вставляли непосредственно из раннего энхансера/промотора человеческого CMV.

Трансформированные хозяйские клетки представляют собой клетки, которые трансформировали или трансфицировали экспрессионными векторами, сконструированными с использованием методов рекомбинантной ДНК, и которые содержат последовательности, кодирующие полипептид HER-2/neu настоящего изобретения. Трансформированные хозяйские клетки могут экспрессировать желаемый HER-2/neu-полипептид, однако, хозяйские клетки, трансформированные для целей клонирования или амплификации ДНК HER-2/neu, не должны экспрессировать полипептид HER-2/neu. Экспрессированные полипептиды предпочтительно выделяются в культуральный супернатант, в зависимости от выбранной ДНК, но могут также депонироваться в клеточной мембране.

Соответствующие хозяйские клетки для экспрессии рекомбинантных белков включают в себя прокариотические, дрожжевые или эукариотические клетки высших организмов под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают в себя грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Е.coli или Bacilli. Высшие эукариотические клетки включают в себя адаптированные клеточные линии насекомых или происходящие от млекопитающих, как описано ниже. Бесклеточные трансляционные системы могли бы также использоваться для получения полипептидов HER-2/neu с применением РНК, полученными из ДНК-конструктов. Соответствующие клонирующие и экспрессионные векторы, используемые в клетках-хозяевах бактерий, грибков, дрожжей и млекопитающих, описаны, например, у Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.

Прокариотических экспрессионных хозяев можно использовать для экспрессии HER-2/neu-полипептидов, которые нуждаются в экстенсивном протеолитическом и дисульфидном процессинге. Прокариотические экспрессионные векторы включают, как правило, один или несколько фенотипических селектируемых маркеров, например, ген, кодирующий белки, придающие устойчивость к антибиотику или восполняющие аутотрофную потребность, а начало области репликации, узнаваемое данным хозяином, гарантирует амплификацию в рамках данного хозяина. Соответствующие Прокариотические хозяева для трансформации включают в себя Е.coli. Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и разные виды рода Psuedomonas, Streptomyces и Staphylococcus, хотя можно также использовать и других хозяев.

Рекомбинантные HER-2/neu-полипептиды можно также экспрессировать в дрожжах-хозяевах, предпочтительно из видов Saccharomyces, таких как S. cerevisiae. Дрожжи другого рода, такого как Pichia или Kluyveromyces, также можно использовать. Дрожжевые векторы содержат, обычно, начало области репликации, из 2 мк дрожжевой плазмиды или из автономно реплицирующейся последовательности (ARS), промотор, ДНК, кодирующую HER-2/neu-полипетид, последовательности для терминирования полиаденилирования и транскрипции и селектируемый ген. Предпочтительно, дрожжевые векторы включают в себя начало области репликации и селектируемый маркер, позволяющий трансформироваться и дрожжам, и Е. coli, например, ген устойчивости к ампициллину у Е.coli и ген trpl у S. cerevisiae, который создает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, утративших способность к росту на триптофане, и промотор, полученный из высокоэкспрессируемого дрожжевого гена для индукции транскрипции нижележащей структурной последовательности. Наличие повреждения гена trpl в геноме дрожжевой хозяйской клетки создает впоследствии эффективную среду для выявления трансформации, благодаря росту в отсутствие триптофана.

Надлежащие условия осуществления дрожжевой трансформации хорошо известны специалистам в данной области. Типичная методика, описанная у Hind et al. (Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 75:1929, 1978), включает селекцию по Trp⁺ -трансформантам на селективной среде, состоящей из 0,67% основного дрожжевого азота, 0,5% казаминовых кислот, 2% глюкозы, 10 мг/мл аденина и 20 мг/мл урацила. Хозяйские штаммы, трансформированные с помощью векторов, включающие в себя ADH2-промотор, можно выращивать для экспрессии в богатой среде, состоящей из 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 1% глюкозы с добавлением 80 мг/мл аденина и 80 мг/мл урацила. Дерепрессия промотора ADH2 наблюдается при исчерпании глюкозы среды. Неочищенные дрожжевые супернатанты собирали фильтрацией и держали при 4°С перед дальнейшей очисткой.

Для экспрессии рекомбинантного полипептида можно также использовать различные системы клеточной культуры млекопитающих или насекомых (напр., Spodoptera или Trichoplusia). Обзор бакуловирусных систем для получения гетерологичных полипептидов в клетках насекомых представлен, например, у Luckow и Summers, Bio/Technology 6:47, 1988. Примеры соответствующих хозяйских клеточных линий млекопитающих включают в себя COS-7-линии клеток почек обезьяны, описанные у Gluzman (Cell 23:175, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать соответствующий вектор, включающий в себя, например, CV-1/EBNA (АТСС CRL 10478), L-клетки, С127, 3Т3, овариальные клетки китайского хомячка (СНО), COS, NS-1, HeLa и ВНК клеточные линии. Экспрессионные векторы млекопитающих могут включать в себя нетранскрибируемые элементы, такие как начало области репликации, соответствующий промотор и энхансер, сцепленные с экспрессируемым геном, и другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности и 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности, такие как рибосом-связывающие саиты, сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга и последовательности, терминирующие транскрипцию.

Очищенные HER-2/neu-полипептиды можно получить путем культивирования соответствующих систем хозяин/вектор для экспрессии рекомбинантных трансляционных продуктов ДНК настоящего изобретения, которые затем выделяют очисткой из культуральной среды или клеточных экстрактов. Например, супернатанты из систем, которые выделяют рекомбинантный полипептид в культуральную среду, можно, во-первых, сконцентрировать, используя коммерчески доступные фильтры для концентрирования белков, такие как изделия фирмы Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат можно нанести на матрицу очистки. К примеру, соответствующая матрица по сродству может включать в себя белок противоположной структуры (напр., белок, с которым полипептид HER-2/neu связывается путем специфического взаимодействия, основанным на структуре) или лектин, или молекула антитела, связанная с соответствующим носителем. Альтернативно, можно использовать анионобменную смолу, например матрицу или субстрат, обладающие дополнительными диэтиламиноэтиловыми (DEAE) группами. Матрицы могут быть акриламидными, агарозными, декстрановыми, целлюлозными или других типов, обычно употребляемых для очистки белка. Альтернативно, можно применить катионобменную стадию. Соответствующие катионобменники представлены различными нерастворимыми матрицами, включающими в себя сульфопропиловые или карбоксиметиловые группы. Сульфопропиловые группы являются предпочтительными. Гель-фильтрующая хроматография также предоставляет возможности по очистке HER-2/neu.

Хроматография по сродству является предпочтительным методом очистки полипептида HER-2/neu. При использовании методов, которые хорошо известны специалистам в данной области, моноклональные антитела к HER-2/neu-полипептиду, например, могут быть также пригодны для очистки хроматографией по сродству.

Наконец, одно- или многостадийная обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого давления (RP-HPLC), использующая гидрофобную RP-HPLC-среду (напр., силикагель, имеющий дополнительные метильные или другие алифатические группы) можно применить для дополнительной очистки композиции с HER-2/neu-полипептидом. Некоторые или все предшествующие стадии очистки, в различных сочетаниях, можно также применить для создания гомогенного рекомбинантного полипептида.

Рекомбинантный HER-2/neu-полипептид, полученный в бактериальной культуре, предпочтительно выделяют в результате начальной экстракции из клеточного осадка, с последующей одной или несколькими стадиями концентрирования, высаливанием, ионобменной или эксклюзионной хроматографией по размеру. Жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC) применяли на конечных стадиях очистки. Бактериальные клетки, используемые для экспрессии рекомбинантного LbeIF4A-белка, можно разрушить с помощью любого подходящего способа, включая неоднократное замораживание-оттаивание, механическое разрушение или используя лизирующие клетки агенты.

Ферментация дрожжей, которые экспрессируют HER-2/neu-полипептид в виде секретируемого белка, очень упрощает очистку. Секретируемый белок, получаемый при крупномасштабной ферментации, можно очистить методами, описанными у Urdal et al. (J. Chromatog. 296:111, 1984). Этот источник описывает две последовательные стадии обращенно-фазовой HPLC для очистки рекомбинантного человеческого GM-CSF на препаративной HPLC -колонке.

Препараты HER-2/neu-полипептидов, синтезированных в рекомбинантной культуре, могут содержать клеточные компоненты, не относящиеся к HER-2/neu, в том числе и белки в количествах и качестве, которые зависят от соответствующих стадий очистки, осуществляемых при извлечении HER-2/neu-полипептида из данной культуры. Эти компоненты обычно имеют дрожжевой, прокариотический или эукариотический, не принадлежащий человеку, источник.. Такие препараты обычно свободны от других белков, которые в норме могут быть ассоциированы с HER-2/neu-белком, что естественно связано с их видовым происхождением.

Автоматизированный синтез представляет собой альтернативный способ получения полипептидов этого изобретения. Например, можно применять любую из коммерчески доступных твердофазных методик, такую как твердофазный метод синтеза Merrifield, в котором аминокислоты последовательно включаются в растущую аминокислотную цепь (см. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 65:2149-2146, 1963). Оборудование для автоматизированного синтеза коммерчески доступно от поставщиков, таких как Applied Biosystems, Inc. of Foster City, Ca, и может быть в большинстве случаев задействовано в соответствии с инструкциями изготовителя.

В рамках одной из целей настоящего изобретения, использование HER-2/nеu-полипептида (или молекулы ДНК, которая управляет экспрессией такого пептида), для получения иммунного ответа к данному HER-2/neu-белку (в том числе и тому, который экспрессируется малигнизированным трансформантом, ассоциированному с онкогеном HER-2/neu), может быть выявлено. Представительные примеры таких малигнизированных трансформантов включают рак молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и предстательной железы. Иммунный ответ к данному HER-2/neu-белку, однажды полученному при помощи HER-2/neu-полипептида, может быть долговечным и может долго детектироваться после иммунизации, независимо от того, присутствует или отсутствует данный белок в организме на момент тестирования. Иммунный ответ к данному HER-2/neu-белку, полученный в реакции с HER-2/neu-полипептидом, может быть выявлен в результате проверки на наличие или отсутствие, или усиления специфической активации CD4⁺- или CD8⁺-клеток. В частности, Т-клетки выделяли из иммунизированных особей с помощью стандартных методик (таких как центрифугирование лимфоцитов периферической крови в градиенте плотности Фиколл/Гипак) и инкубировали с HER-2/neu-белком. Например, Т-клетки можно инкубировать in vitro в течение 2-9 дней (обычно 4 дня) при 37°С с HER-2/neu-белком (обычно, 5 мкг/мл цельного белка или отобранных клеток, синтезирующих HER-2/neu-белок). По желанию, можно проинкубировать второй аликвот Т-клеточного образца в отсутствие HER-2/пеи-белка, который служит в качестве контроля.

Специфическую активацию CD4⁺- или СD8⁺-клеток можно выявлять разнообразными способами. Методы выявления специфической Т-клеточной активации включают в себя выявление пролиферации Т-клеток, образование цитокинов (напр., лимфокинов) или генерирование цитолитической активности (т.е., генерирование цитотоксических Т-клеток, специфичных по HER-2/neu-белку). Для CD4⁺-T-клeтoк предпочтительным способом по выявлению специфической Т-клеточной активации является обнаружение пролиферации Т-клеток. Для СD8⁺-Т-клеток предпочтительным способом выявления специфической Т-клеточной активации является обнаружение генерированной цитолитической активности.

Обнаружение пролиферации Т-клеток можно осуществить с помощью различных известных методик. Например, Т-клеточная пролиферация может быть обнаружена путем измерения скорости синтеза ДНК. Т-клетки, которые стимулировали к пролиферации, проявляют повышенную скорость синтеза ДНК. Обычный способ измерить скорость синтеза ДНК осуществляют, например, с помощью пульсмеченья культур Т-клеток тритиированным тимидином, нуклеозидным предшественником, который инкорпорируется во вновь синтезированную ДНК. Количество инкорпорированного тритиированного тимидина можно определить, используя жидкостный сцинтилляционный спектрофотометр. Другие способы обнаружения Т-клеточной пролиферации включают в себя измерение увеличения образования интерлейкина-2 (IL-2), потока Са²+ или поглощения красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий. Альтернативно, синтез лимфокинов (такого как гамма-интерферон) можно измерить или количественно определить по числу Т-клеток, которые могут отвечать на интактный р185^HER-2/neu-белок.

При использовании или экспрессии HER-2/neu-полипептида Т-клетки, которые узнают HER-2/neu-белок, могут быть пролиферированы in vivo. Например, лекарственное средство, для иммунизации HER-2/nеu-пептидом (т.е. в виде вакцины), можно индуцировать непрерывной экспансией множества Т-клеток, необходимых для терапевтической атаки против опухоли, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. Обычно, от, около, 0,01 мкг/кг до, около, 100 мг/кг веса тела вводят внутрикожно, подкожно или внутривенно. Предпочтительная доза составляет от, около, 1 мкг/кг до, около, 1 мг/кг, но наиболее предпочтительной является доза от, около, 5 мкг/кг до, около, 200 мкг/кг. Специалистам в данной области очевидно, что количество и частота введения будет зависеть от ответа, получаемого от конкретного пациента. Желательно вводить полипептид HER-2/neu повторно. Специалистам в данной области очевидно, что вводить можно более чем один вид полипептида HER-2/neu, одновременно или последовательно. Предпочтительными пептидами, для использования в лекарственном средстве для иммунизации, являются пептиды, которые включают в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, начинающуюся, примерно, от лизинового остатка на аминокислотной позиции 676 и простирающейся, примерно, до валинового остатка на аминокислотной позиции 1255. Специалистам в данной области необходимо иметь ввиду, что настоящее изобретение рассматривает использование интактного HER-2/neu-полипептида, а также деление такого полипептида на множество пептидов. Поодиночке, для иммунизации, не использовали ни интактный p185^HER-2/neu-бeлoк, ни пептид, имеющий аминокислотную последовательность во всей полноте внеклеточного домена (т.е. пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты на позиции 1 до аминокислоты на позиции 650, плюс-минус, примерно, 1-5 позиций, и, с или без, первых 21 аминокислотных позиций).

HER-2/neu-полипептид (или нуклеиновая кислота) является, предпочтительно, рецептурным для использования в вышеуказанных способах в виде фармацевтической композиции (напр., вакцины). Фармацевтические композиции, в большинстве случаев, включают в себя один или несколько полипептидов в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем. Такие носители не должны быть токсичными для реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Рассматривается также использование HER-2/neu-полипетида в соединении с химиотерапевтическими агентами.

Помимо HER-2/neu-полипептида (который функционирует в качестве антигена) в вакцину желательно включать другие компоненты, такие как посредник для доставки антигена и иммуностимулирующие вещества, предназначенные для усиления белковой иммуногенности. Примеры посредников для доставки антигена включают в себя соли алюминия, вода-в-масле эмульсии, биодеградируемые масляные посредники, масло-в-воде эмульсии, биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры иммуностимулирующих веществ (адъюванты) включают в себя N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (LPS), глюкан, IL-12, GM-CSF, гамма-интерферон и IL-15. Рядовым специалистам в данной области очевидно, что HER-2/neu-полипептид для вакцины можно получить синтетически и естественным способом.

Хотя в фармацевтических композициях этого изобретения можно использовать любой подходящий носитель, известный рядовым спецалистам в данной области, вид носителя меняется в зависимости от способа введения и того, является ли его высвобождение желательным. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно включает в себя воду, физраствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из вышеуказанных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и углекисый магний. Биодеградируемые микросферы (напр., полилактикгалак-тид) также можно использовать в качестве носителей для фармацевтических композиций этого изобретения. Соответствующие биодеградируемые микросферы описаны, например, в Патентах США №4897268 и 5075109. HER-2/neu-полипептид можно инкапсулировать в биодеградируемую микросферу или связать с поверхностью микросферы. Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255, инкапсулирован в биодеградируемую микросферу. В этом отношении, предпочтительным является то, что микросфера, примерно, более 25 микрон.

Фармацевтические композиции (в том числе, вакцины) могут также содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы, в том числе, глюкозу или доктрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, глутатион, и другие стабилизаторы и наполнители. Нейтральный забуференный физраствор или физраствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином, представляют собой типичные подходящие разбавители. Предпочтительно, продукт представляет собой лиофилизированную форму, с использованием надлежащих наполняющих растворов (напр., глюкозы) в качестве разбавителей.

Как альтернативу представляемым HER-2/neu-полипептидам, предмет изобретения включает в себя композиции, способные доставлять молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HER-2/neu-полипептид. Такие композиции включают в себя рекомбинантные вирусные векторы (напр., ретровирусы (см. WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 и W094/03622), аденовирус (см. Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al. Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al. Nat. Genet. 5:130-134, 1993; и Kolls et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994), поксвирус (см. Патент США №4769330; Патент США №5017487; и WO 89/01973)), изолированную ДНК (см. WO 90/11092), молекулу нуклеиновой кислоты, скомплексированную с поликатионной молекулой (см. WO 93/03709), и нуклеиновую кислоту, ассоциированную с липосомами (см. Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК присоединяли к убитому или инактивированному аденовирусу (см. Curiel et al. Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Другие подходящие композиции включают в себя сочетания ДНК-лиганд (см. Wu et al. J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) и липид-ДНК (см. Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989). Кроме того, эффективность изолированной ДНК, поглощенной в клетках, можно повысить путем помещения ДНК в биодеградируемые бусинки.

В дополнение к прямым in vivo методикам, можно использовать ех vivo методики, в которых клетки удаляют из организма животного, модифицируют и помещают в то же или в другое животное. Очевидно, что для интродукции HER-2/neu-молекул нуклеиновой кислоты в тканевые клетки можно использовать любую из композиций в контексте ех vivo. Условия применения вирусных, физических и химических методов поглощения хорошо известны в данной области.

В соответствии с этим, настоящее изобретение является полезным для усиления или получения у пациента или в клеточной культуре клеточного иммунного ответа (напр., генерированием антигенспецифических цитолитических Т-клеток). Термин "пациент", как он используется здесь, относится к любому теплокровному животному, предпочтительно - к человеку. Пациент может быть поражен раковым заболеванием, таким как рак молочной железы, или может быть здоровым (т.е. не обнаруживать болезни и инфекции). "Клеточная культура" подразумевает любой препарат Т-клеток или выделенного компонента клеток (включая, но не ограничиваясь ими, макрофаги, моноциты, В-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделить с помощью любой методики, хорошо известными рядовым специалистам в данной области (такой как центрифугирование в градиенте плотности Фиколл-гипак). Данные клетки можно (но не обязательно) выделить от пациента, пораженного малигнизацией, ассоциированной с HER-2/neu, и могут быть вновь интродуцированы пациенту после лечения.

Настоящее изобретение указывает также, что HER-2/neu-полипептид, помимо того, что является иммуногенным к Т-клеткам, стимулирует В-клетки к образованию антител, способных узнавать HER-2/neu-полипептид. Антитела, специфичные (т.е., которые проявляют сродство к связыванию почти 10⁷ литра/моль или лучше) по HER-2/neu-белку, можно найти в разных жидкостях тела, в том числе в сыворотке и в асците. Вкратце, суть заключается в том, что образец организменной жидкости выделяют из теплокровного животного, такого как человек, чтобы определить действительное наличие антител, специфичных к HER-2/neu-полипептиду. Организменную жидкость инкубируют с HER-2/neu-полипептидом при условиях и в течение времени, достаточных, чтобы позволить образоваться иммунокомплексам между данным полипептидом и антителами, специфичными к данному белку. Например, организменную жидкость и HER-2/neu-полипептид можно икубировать при 45°С в течение 24-48 ч. После инкубации реакционную смесь тестируют на наличие иммунокомплексов. Обнаружение одного или нескольких иммунокомплексов, образованных между HER-2/neu-полипептидом и антителами, специфичными к HER-2/neu-полипептиду можно осуществить с помощью различных известных методик, таких как радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Соответствующий иммунный метод включает в себя методику сэндвич-иммунотеста David et al. (Патент США №4376110) с помощью двойных моноклональных антител; метод получения сэндвича из моноклонального-поликлонального антитела (Wide et al., Kirkham и Hunter, редакторы, Radio-immunoassay Methods, E. и S. Livingstone, Edinburgh, 1970); метод "вестерн-блот" Gordon et al. (Патент США №4452901), иммунопреципитацию меченного лиганда (Brown et al. J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); твердофазный иммунофер-ментный анализ, как он описан, например, у Raines и Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); иммуноцитохимические методики, включающие применение флуорохромов (Brooks et. al. Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); и нейтрализацию активности [Bowen-Pope et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400 (1984)], которые все включены здесь в качестве ссылки. Кроме вышеуказанных иммунных методов, использовали ряд других иммунных методов, в том числе и те, которые описаны в Патентах США №3817827; 3850752; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074 и 4098876, которые все включены здесь в качестве ссылки.

Для целей детектирования, HER-2/neu-полипептид ("антиген") мог быть помечен или быть немеченым. В случае немеченья, антиген обнаруживали в опытах по агглютинации. Кроме того, немеченый антиген можно использовать в сочетании с мечеными молекулами, которые реагируют с иммунокомплексами, или в сочетании с мечеными антителами (вторичные антитела), которые реагируют с антителом, направленным против HER-2/neu-полипептида, такими как антитела, специфичные по иммуноглобулину. Альтернативно, данный антиген может быть непосредственно помечен. Когда он помечен, репортерная группа может включать в себя радиоизотопы, флуорофоры, ферменты, люминофоры или красящие частицы. Эти и другие метки хорошо известны в данной области и описаны, например, в следующих Патентах США: №3766162; 3791932; 3817837; 3996345 и 4233402.

В обычном твердофазном иммуноферментном анализе антиген адсорбируется на поверхности лунки планшета для микротитрования. Остаточные белок-связывающие участки на поверхности лунки блокируются затем соответствующим агентом, таким как бычий сывороточный альбумин (BSA), инактивированной нагреванием нормальной козей сывороткой (NGS), BLOTTO (забуференный раствор сухого обезжиренного молока, которое содержит также консервант, соли и пеногаситель). Затем лунку инкубируют с образцом, предположительно содержащим специфическое антитело. Образец наносят неразбавленным или, что более часто, его можно разбавлять, обычно, в забуференном растворе, который содержит небольшое количество (0,1-5,0% по весу) белка, такого как BSA, NGS или BLOTTO. После инкубации в течение достаточно длительного времени, позволяющего осуществиться специфическому связыванию, лунку промывают для удаления несвязавшегося белка и затем инкубируют со специфическим иммуноглобулиновым антителом к другому виду, меченному репортерной группой. Репортерную группу можно выбрать из разных ферментов, включающих в себя пероксидазу хрена, бета-галактозидазу, щелочную фосфатазу и глюкозооксидазу. Специфическому связыванию позволяет осуществиться в течение достаточного периода времени, затем лунку снова промывают для удаления несвязавшегося конъюгата и добавляют субстрат для выбранного фермента. Развитие окраски и оптическую плотность содержимого лунки определяют визуально или инструментально.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого аспекта настоящего изобретения, репортерную группу связывают с HER-2/neu-белком. Стадия детектирования иммунокомплексов предусматривает полное удаление любого несвязавшегося HER-2/neu-белка и последующее обнаружение наличия или отсутствия данной репортерной группы.

В другом предпочтительном варианте, репортерную группу связывают с вторичным антителом, способным связываться с антителами, специфичными по HER-2/neu-белку. Стадия детектирования иммунокомплексов предусматривает (а) полное удаление любого несвязавшегося антитела, (b) внесение вторичного антитела, (с) полное удаление любого несвязавшегося вторичного антитела и, затем, (d) детектирование наличия или отсутствия данной репортерной группы. Когда антитело, специфичное по HER-2/neu-белку, получают у человека, вторичное антитело представляет собой антитело к антителу человека.

В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для детектирования иммунокомплексов репортерную группу связывают с молекулой, способной связываться с иммунокомплексами. Стадия детектирования предусматривает (а) внесение данной молекулы, (b) полное удаление любой несвязавшейся молекулы и, затем, (с) детектирование наличия или отсутствия данной репортерной группы. Примером молекулы, способной связываться с соответствующими иммунокомплексами, является молекула протеина А.

Специалистам в данной области очевидно, что в рамках настоящего изобретения можно использовать разные методы по детектированию иммунокомплексов. Репортерные группы, приемлемые для применения в любом из данных методов, включают в себя радиоизотопы, флуорофоры, ферменты, люминофоры и красящие частицы.

В родственном аспекте настоящего изобретения, детекцию иммунокомплексов, образованных между HER-2/neu-полипептидом и антителами организменной жидкости, которая специфична по HER-2/neu-полипептиду, можно использовать для мониторинга эффективности терапии рака, в которой участвует HER-2/neu-полипептид малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. Образцы организменной жидкости, взятой у индивидуумов до и после начала терапии, можно анализировать по иммунокомплексам, с помощью вышеописанных подходов. Вкратце, сравнивают количество иммунокомплексов, выявляемых в обоих образцах. Существенное изменение количества иммунокомплексов во втором образце (после начала терапии), по отношению к первому образцу, отражает успех терапии.

Нижеследующие примеры предлагаются способом иллюстрации, а не способом ограничения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО HER-2/neu-ПОЛИПЕПТИДА

Человеческий HER-2/neu-полипептид воспроизводили методом ПЦР (напр., Патенты США №4683195; 4683202; 4800159) из плазмиды, полученной согласно Di Fiore et al. (King с еt al. Science 225:974-976, 1985; Di Fiore et al. Science 237:178-182, 1987), с использованием олигонуклеотидных праймеров, которыми дополнительно интродуцировали сайт рестрикции BssHII и сайт энтерокиназной протеазы по 5'-концу, а EcoRI-сайт - по 3'-концу. Праймер для 5'-конца представляет собой 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3’ (SEQ ID NO:3) праймер для 3'-конца представляет собой 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 4).

Получаемый 1,8 kb PCR-фрагмент субклонировали в Т-вектор из Novagen (Madison, WI, США), а последовательность из селектированных клонов определяли на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI 373 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, США), с использованием перекрывающихся секвенирующих праймеров. Затем PCR-фрагменты, с последовательностью, которая совпадает с опубликованной последовательностью ДНК для человеческой HER-2/neu-кДНК (SEQ ID NO:1; Coussens et al. Science 230:1132, 1985; Yamamoto et al. Nature 319:230, 1986), присоединяли с помощью BssHII-сайта к модифицированной тиоредоксин-редуктазе Е.coli для корректирования открытой рамки считывания. Используемую 6Хгистидиновую метку по сродству, для Ni-NTA очистки по сродству экспрессированного слитого белка, включали в участника слияния - тиоредоксин-редуктазу. Эту кДНК для слитого белка, trxA-человеческий HER-2/neu-полипептид, субклонировали в модифицированном экспрессионном векторе рЕТ для экспрессии в Е.coli.

Поскольку тиоредоксин-редуктаза, как сообщали, стабилизирует и солюбилизирует другие гетерологичные белки, экспрессируемые в Е.coli, она не придает сколь-нибудь ощутимого преимущества экспрессии в Е.coli человеческому HER-2/neu-полипептиду. Так как значительная часть слитого белка trx-HER-2/neu-полипептид была растворимой, он, в основном, экспрессировался во внутриклеточных тельцах. Во время экспрессии в Е.coli данный слитой белок был также подвержен деградации. Наличие тиоредоксин-редуктазы, как участника слияния, может, однако, стабилизировать белок в процессе очистки. Доступность моноклональных антител для тиреодоксин-редуктазы создает удобный маркер для последующей очистки.

Для очистки человеческого HER-2/neu-полипептида, слитого с тиреодоксин-редуктазой, содержащей 6XHis-метку по сродству, осадок клеток Е.coli ресуспендировали с протеазными ингибиторами и лизозимом и обрабатывали ультразвуком. Внутриклеточные тельца выделяли центрифугированием и троекратно промывали дезоксихолатом, последнюю промывку осуществляли в течение ночи для удаления LPS. Отмытые внутриклеточные тельца солюбилизировали в GuHCl для Ni-очистки. Ni-колонку промывали имидазолом в мочевине и диализовали против 10 мМ Tris pH 8,0. Извлечение HER-2/neu-полипептида, с использованием этих условий опыта, составляло 80-95% полноразмерного белка, загрязненного, в основном, разрушенным белком. Из 500 мл ферментированной жидкости извлекали 20 мг белка. Это составляет >98% HER-2/neu-полипептида. Данные методики, используемые здесь, хорошо известны специалистам в данной области и были описаны, например, у J. Sambrook с et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York, США.

ПРИМЕР 2

Дендритные клетки можно праймировать HER-2/neu-полипептидом

А. Получение культур DC из костного мозга

Культуры DC получали из СD34+-предшественников гемопоэтических клеток (НРС). СD34+-клетки выделяли очисткой из костного мозга нормальных доноров, с использованием сепарирующей системы Ceprate LC Kit (Cellpro, Bothell, WA, США). Степень очистки извлеченных СD34+-клеток, определяяемая в проточном цитометрическом анализе, составляла 80-95%. СD34+-клетки культивировали в бессывороточной среде (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, США) с добавлением L-глутамина (584 мкг/л), пенициллина (10 МЕ/мл, стрептомицина (100 мкг/мл), 100 нг/мл человеческого rGM-CSF и 50 нг/мл человеческого rIL-6 (Immunex, Seattle, WA, США).

Клетки собирали через 0-17 дней культивирования и использовали их для фенотипирования и анализа Т-клеточной стимуляции. GM-CSF в отдельности и в сочетании с IL-4 или, как описано, с TNFα индуцировал рост in vitro DC. В экспериментах с использованием KLH и OVA, в качестве антигенов для праймирования первичных Т-клеток, GM-CSF плюс IL-6 устойчиво давали стимуляцию, близкую к тотальной, но с пониженным фоном, и поэтому, по сравнению со стимуляцией GM-CSF плюс IL-4 или TNFα индекс стимуляции был выше.

В. Анализ Т-клеточного праймирования

Производимые костным мозгом СD34+-ПГК, культивированные в бессывороточной среде, содержащей GM-CSF и IL-6, использовали в качестве АРС после периода культивирования в течение 0-17 дней. Праймирующую способность DC определяли путем их культивирования с автологичными, первичными Т-лимфоцитами на наличие или отсутствие белкового антигена рекомбинантного человеческого HER-2/neu-полипептида (hHNP) (10 мкг/мл). СD4+-Т-лимфоциты выделяли из моноядерных клеток периферической крови путем положительной селекции с использованием колонок для проведения хроматографии по иммуносродству (CellPro, Inc., Bothell, WA, США). CD4+-CD45RA+-(первичные) Т-лимфоциты отбирали из CD4+-T-лимфоцитов, на проточном цитометрическом сортере, используя анти-СD45КА mAb, непосредственно конъюгированных с FITC (Immunotech, Westbrook, ME, США). Эти полученные CD4+-СD45RА+-Т-клетки имели 99% чистоты. Культуры DC в различных концентрациях помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning, NY, США) и инкубировали в течение 16-18 часов с hHNP в конечной концентрации 10 мкг/мл. Антиген-меченные DC облучали (10 Gy) и вносили автологичные CD4+-СD45RА+-Т-лимфоциты (5×10⁴/лунку). Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению ³H-тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого на 6-й день, в течение 16-18 часов. Изучение пролиферации осуществляли в бессывороточной и цитокин-свободной среде. Полученные результаты представлены на Фигуре 1. Фигура 2 показывает результаты тестирования CD4+-T-клеток от здорового донора на ответ к hHNP. Аналогичные данные получены для Т-клеток для девяти из десяти нормальных индивидуумов.

ПРИМЕР 3

Метод детектирования предшественников лимфоцитов, встреченных с низкой частотой

Можно применить три вида анализа для выявления CD4⁺-ответов: стандартный метод пролиферации, метод скрининга для низкочастотных событий и метод лимитирующих разведении (LDA). Стандартный пролиферативный анализ позволяет легко обнаруживать праймированные ответы. Индекс стимуляции профилеративного ответа предусматривает грубую корреляцию с частотой предшественника антигенреактивных Т-клеток. Любой специфический Пролиферативный ответ, выявляемый в PBL, считается праймированным ответом.

Чтобы обеспечить в большей мере количественную интерпретацию CD4⁺-T-клeтoчныx ответов, применили разработанную аналитическую систему для детектирования лимфоцитарного предшественника с низкой частотой ответов (описывается ниже). Этот анализ является простым и значительно менее дорогостоящим. В условиях, когда необходима большая точность, частоту предшественника учитывали, с помощью метода лимитирующих разведении (Bishop и Orosz, Transplantation 47:671-677, 1989).

Превышение ответов, по сравнению с обнаруживаемыми у нормальных индивидуумов, квалифицируется как праймирование ответов, и означает существование иммунитета. Ответы с низкой частотой, выявляемые только с помощью LDA, считаются непраймированными ответами. Отсутствие ответа при LDA или снижение ответов, по сравнению с обычным анализом популяции, рассматривается как устойчивость/анергия.

Вообще, праймированные CD4⁺-T-клeтoчныe ответы можно выявить в обычном пролиферативном анализе, тогда как в таком же анализе непраймированные ответы не выявляются. Обнаружение небольшого количества непраймированных Т-клеток ограничено из-за смешения фона тимидинового поглощения с автологичным смешанным лимфоцитарным ответом (AMLR) к собственному антигену МНС плюс ответы к процессированным собственным сывороточным белкам и экзогенно добавленным сывороточным белкам.

Чтобы установить и выявить непраймированные Т-клетки, применяли анализ системы низкочастотных ответов, основанный на Пуассоновской выборочной статистике (В: Pinnacles, Chiron Corporation, 2:1-2. 1991). Этот вид анализа относится, в частности, к низкочастотным событиям в том отношении, что если частота предшественника меньше, чем количество клеток в реплицированной культуре, требуется много повторов для обнаружения статистически значимого числа позитивов. Теоретически, анализ будет корректным для автологичных ответов в результате постановки известного позитивного контроля (такого как PHA или столбнячного анатоксина) и известного негативного контроля (без антигена) и оценивания всех данных наблюдений от самой нижней до самой высшей точки, независимо от принадлежности к экспериментальной группе. Значение предельной частоты вычисляют по уравнению предельной частоты = М + (F + 3D), где М = средняя арифметическая, F=3,29, множитель из таблиц стандартизованного нормального распределения, выбранный таким образом, чтобы не превышать 0,1% от "истинного негатива" нормально распределенного фона вышеуказанной предельной частоты, а SD = стандартное отклонение. В этом скринирующем анализе лунки, находящиеся выше предельной частоты, считаются истинными позитивами, которые потенциально содержат лимфоцит, который пролиферирует именно с интересующим антигеном. Хотя оценка частоты предшественника лимфоцита возможна при использовании этого метода, точное определение нуждается в формальном LDA -анализе.

ПРИМЕР 4

Вакцина, основанная на HER-2/neu-полипептиде, проявляет иммунность К HER-2/neu-белку

А. Животные

Крысы, используемые в этом исследовании, представлены штаммом 344 Fischer (CDF (F-344)/CrlBR) (Charles River Laboratories, Portage MI). Животных содержали в виварии Вашингтонского университета в условиях, свободных от определенных патогенов, и обычно использовали для экспериментальных исследований в возрасте между 3 и 4 месяцами.

В. Иммунизация

Крыс Fischer иммунизировали рекомбинантным крысиным HER-2/neu-полипептидом (rHNP) в разных адъювантах (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, МТ, США). Животные получали 50 мкг rHNP в смеси с адъювантом подкожно. Через двадцать дней животных вторично иммунизировали 50 мкг rHNP, вводимого тем же образом. Еще через двадцать дней повторно иммунизированных животных, тестировали на наличие антител к крысиному HER-2/neu-белку (neu).

С. Клеточные линии

В качестве источника neu-белков использовали две клеточные линии. Линию раковых клеток молочной железы человека. SKBR3, которую маркировали сверхэкспрессором HER-2/neu (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD), поддерживали в культуре в 10%-ной сыворотке плода коровы (FBS) (Gemini Bioproducts, Inc., Catabasas, CA) и RPMI. Линию клеток NIH/3T3, DHFR-G8, контрансфицированную cneu-p и pSV2-DHFR (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD), использовали в качестве источника нетрансформирующего крысиного, nеu-белка (Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6854-6858, 1987). Эту клеточную линию поддерживали в 10%-ной FBS и среде Игла, модифицированной Дюльбекко, с 4,5 г/л глюкозы. DНFR-G8-клетки пассировали в той же среде с добавлением 0,3 мкМ метотрексата в каждом третьем пассаже для поддержания neu-трансфектанта.

D. Получение клеточных лизатов

Лизаты линии SKBR3 и линии DHFR-G8 получали и использовали в качестве источника neu-белка. Вкратце, готовили лизирующий буфер, содержащий трис-основание, хлорид натрия и Тритон-Х (1%) рН 7,5. Добавляли протеазные ингибиторы; апротинин (1 мкг/мл), бензамидин (1 мМ) и PMSF (1 мМ). 1 мл лизирующего буфера использовали для суспендирования 10⁷ клеток. Клетки встряхивали в течение 15 секунд каждые 10 минут в течение часа до их разрушения. Все процедуры выполняли на льду при 4°С в холодной комнате. После разрушения клетки откручивали на микроцентрифуге при 4°С в течение 20 минут. Супернатант отделяли от клеточного дебриса и хранили небольшими аликвотами при -70°С перед использованием. Наличие человеческого и крысиного nеu подтверждали с помощью Вестерн-блот-анализа.

Е.ELISAответов антител на крысиный nеu

4 96-луночных иммунологических планшета (Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories) инкубировали в течение ночи при 4°С с моноклональным антителом, специфичным к крысиному neu (Oncogene Science), 7.16.4, при концентрации 10 мкг/мл, разбавленного в карбонатном буфере (эквимолярные концентрации Na₂CO₃ и NaHCO₃ pH 9,6). После инкубации все лунки блокировали PBS-1% BSA (Sigma Chemical, St. Louis, МО, США), 100 мкл/лунка, в течение 3 часов при комнатной температуре. Планшет промывали PBS-0.5% Tween и лизатой DHFRG8, мышиную клеточную линию трансфицировали ДНК крысиного nеu (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD, США); источник крысиного neu-белка, вносили в перемежающиеся ряды. Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшет промывали PBS-0.5% Tween и исследуемую сыворотку добавляли при следующих разведениях: 1:25-1:200. Эту сыворотку разбавляли в PBS-1% BSA-1% FBS-25 мкг/мл мышиного IgG-0,01% NaN₃ и затем, последовательно, в PBS-1% BSA. Разбавленную сыворотку, из расчета 50 мкл/лунка, вносили в лунки и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Каждую исследуемую сыворотку вносили в лунку с крысиным neu и в лунку без крысиного neu. Конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела барана к анти-IG F(ab')2 крысы вносили в эти лунки при разведении 1:5000 в PBS-1% BSA и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре (Amersham Co., Arlington Heights, IL, США). После последней промывки добавляли реактив для развития окраски, ТМВ (Kirkegaard и Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Цветную реакцию прочитывали при оптической плотности 450 нм. Оптическую плотность каждой разбавленной сыворотки вычисляли как ОП крысиного neu, покрывающего лунку, минус ОП лунок, покрытых PBS-1% BSA. Аналогичным образом оценивали также сыворотку животных, иммунизированных одним только адъювантом, и животных, иммунизированных hHNP (чужеродный белок). Эти результаты показаны на Фигуре 3.

F. Анализ Т-клеточной пролиферации

Для анализа ответов, специфичных к HER-2/neu-полипептиду, клетки свежевзятых селезенки или лимфатических узлов получали путем механического разрушения тканей, продавливания через металлическую сетку и промывания. 2×10⁵ клеток/лунка селезенки и 1×10⁵ клеток/лунка лимфатических узлов помещали в 96-луночные круглодонные планшеты для микротитрования (Corning, Corning, NY) в 6 репликах на исследуемую группу. Среда состояла из ЕНАА 120 (Biofluids) с L-глутамином, пенициллин/стрептомицином, 2-меркаптоэтанолом и 5% FBS. Клетки инкубировали с полипептидами. Через 4 дня клетки метили в течение 6-8 часов импульсной меткой с 1 мкКи [³H]тимидина и считали. Данные выражали в виде индекса стимуляции (SI), который определяли как среднюю экспериментальных лунок, деленную на среднюю контрольных лунок (без антигена). Для анализа ответов, специфичных к HER-2/neu-белку, клетки селезенки и лимфатических узлов культивировали для 3-х стимуляций in vitro. Для проведения анализа 1×10⁵ культивированных Т-клеток селезенки или лимфатических узлов помещали в 96-луночные планшеты для микротитрования, как описано выше. Клетки инкубировали с 1 мкг/мл, очищенным хроматографией на колонке по иммуносродству крысиным neu (из DHFR-G8-клеток, как источнике крысиного neu). Через 4 дня лунки метили импульсной меткой в течение 6 часов с 1 мкКи [³H]тимидина и считали. Данные выражали в виде индекса стимуляции, который определяли как среднюю экспериментальных лунок, деленную на среднюю контрольных лунок (без антигена).

ПРИМЕР 5

Праймированные ответы к человеческому HER-2/neu-полипептиду можно обнаружить у пациентов, пораженных раком молочной железы

Гепаринизированную кровь получали от пациентов на II стадии рака молочной железы со сверхэкспрессией HER-2/neu. Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) отделяли центрифугированием в градиенте плотности Фиколл-гипак. РВМС в концентрации 2×10⁵/лунка помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning NY, США). По каждой экспериментальной группе осуществлено 24 реплики.

Антигены, состоящие из пептидов, полученных из HER-2/neu (длиной 15-20 аминокислот, начиная с первой аминокислоты указанной последовательности) 25 мкг/мл, человеческого HER-2/neu-полипептида (hHNP) 1 мкг/мл, столбнячного анатоксина 1 мкг/мл, и р30 пептида, полученного из анатоксина 25 мкг/мл, вносили в каждую из 24 реплик. Анализ проводили в среде, содержащей 10% человеческой сыворотки. Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению (³H)тимидина (1 мкКи/лунка), вносимого в течение 10 часов на 4-й день. Позитивные лунки, антигенреактивные лунки оценивали как позитивные, если количество имп/мин было выше средней и 3 стандартных отклонений для лунок без антигена. Полученные результаты показаны на Фигуре 4. Эта стадия II у пациента, пораженного раком молочной железы, обладала существенным ответом к рекомбинантному hHNP.

Пример 6

Иммунизация in vitro рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим icd, индуцирует иммунный ответ на белок HER-2/neu

Была продемонстрирована иммунизация in vitro с использованием инфекции дендритных клеток (ДК) рекомбинантным аденовирусом. Конструировали аденовирусный вектор, делегированный по Е1А и рекомбинантный по внутриклеточному домену (ICD) белка HER-2/neu, и полученный вектор использовали для инфицирования ДК. После созревания ДК с CD40-L инициировали примирующие культуры, содержащие 1,3×10⁶ инфицированных и зрелых ДК и 1,8×10⁷ МКПК. Культуры также содержали по 10 нг/мл IL-7 и IL-12, добавленных в 0 сутки и 10 МЕ/мл IL-2, добавленного на 3 сутки. Перед второй стимуляцией CD8⁺ клетки выделяли из культуры с использованием колонок MACS и CD8⁺ клетки повторно стимулировали в 24-луночных планшетах ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, в качестве антиген-презентирующих клеток (АПК). Культуру еще дважды стимулировали аутологичными фибробластами, трансдуцированными с помощью ретровируса ICD, и тестировали на предмет ICD-специфичной активности ЦТЛ по методу анализа высвобождения ⁵¹Сr. Как показано на фиг.5, что культивируемая клеточная линия обладала специфичной активностью по отношению к ICD, поскольку указанная линия лизировала аутологичные клетки B-LCL, трансдуцированные с помощью возбудителя коровьей оспы ICD, но не лизировала трансдуцированные EGFP или интактные клетки.

Затем ICD-специфичную клеточную линию повторно стимулировали сначала аутологичными клетками B-LCL, трансдуцированные с помощью возбудителя коровьей оспы ICD, a затем либо аутологичными ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, либо анти-CDS; обе указанные линии тестировали на предмет распознавания клеток-мишеней, экспрессирующих ICD, с помощью анализа IFNγ ELISPOT. Как показано на фиг.6, ICD-специфичная реактивность определялась как в культуре, стимулированной антигеном (вверху), так и в культуре, стимулированной анти-CD3 (внизу). Среднее количество пятен в трех сериях лунок составляло 344 для ICD-фибробластов и 22 для EGFP-фибробластов (стимуляция антигеном) и 365 (ICD) и 17 (EGFP) (стимуляция aнти-CD3).

Таким образом, иммунизация in vitro рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ICD, индуцирует иммунный ответ на белок HER-2/neu.

Из вышеизложенного следует, что хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, описаны здесь в иллюстративных целях, в них можно вносить различные модификации без отклонения от существа и объема настоящего изобретения.

Формула изобретения

1. Полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO: 1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu, или фрагмент указанного полипептида, применяемые для иммунизации теплокровного животного для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu.

2. Полипептид по п.1, применимый для иммунизации в сочетании с адъювантом.

3. Слитый полипептид, содержащий полипептид по п.1 или 2, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

4. Полипептид по п.3, применимый для иммунизации в сочетании с адъювантом.

5. Молекула ДНК, применяемая для иммунизации для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu, посредством трансфекции клеток теплокровного животного указанной молекулой ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:l в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu.

6. Вирусный вектор, применяемый для иммунизации для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu, посредством инфицирования клеток теплокровного животного вектором, управляющим экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комлементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

7. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в сочетании с полипептидом, кодируемым последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

8. Композиция по п.7, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

9. Композиция по п.7, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

10. Композиция по п.7, дополнительно содержащая адъювант.

11. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в сочетании с полипептидом, кодируемым последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

12. Композиция по п.11, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

13. Композиция по п.11, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

14. Композиция по п.11, дополнительно содержащая адъювант.

15. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая молекулу ДНК, выбранную из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

16. Композиция по п.15, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

17. Композиция по п.15, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

18. Композиция по п.15, дополнительно содержащая адъювант.

19. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая молекулу ДНК, выбранную из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID N0:l в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

20. Композиция по п.19, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

21. Композиция по п.19, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

22. Композиция по п.19, дополнительно содержащая адъювант.

23. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный к с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

24. Композиция по п.23, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

25. Композиция по п.23, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

26. Композиция по п.23, дополнительно содержащая адъювант.

27. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.

28. Композиция по п.27, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.

29. Композиция по п.27, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.

30. Композиция по п.27, дополнительно содержащая адъювант.

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6