Универсальный вектор для стабильной трансформации хлоропластного генома, способ стабильной трансформации растения-мишени, способ придания устойчивости к гербициду растению-мишени, способ определения трансформации хлоропласта и стабильно трансформированный хлоропластный геном

 

Изобретение относится к генной инженерии растений. Вектор включает экспрессионную кассету, содержащую последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид, которая соединена с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластах растения-мишени. Фланкирующие кассету последовательности гомологичны консервативным спейсерным последовательностям хлоропластного генома мишени, что обеспечивает стабильную интеграцию кодирующей последовательности в хлоропластный геном. Введение упомянутого вектора в геном самых разных видов растений позволяет придавать им новые свойства, которые стабильно наследуются в потомстве. 5 с. и 24 з.п. ф-лы, 29 ил., 2 табл.

Данная заявка утверждает преимущество находящейся на рассмотрении предварительной заявки под регистрационным номером 60/055314, зарегистрированной 7 августа 1991, включенной в качестве ссылки в настоящую заявку. Данная заявка также утверждает преимущество находящейся на рассмотрении предварительной заявки под регистрационным номером 60/079042, зарегистрированной 23 марта 1998, озаглавленной Универсальный хлоропластовый интеграционный и экспрессионный вектор, трансформированные растения и продукты из них, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, данная заявка является частичным продолжением находящейся на рассмотрении заявки на патент под регистрационным номером 08/591407, зарегистрированной 25 января 1996, Henry Daniell, являющейся частичным продолжением заявки под регистрационным номером 08/591407, зарегистрированной 18 марта 1994, теперь абандонированной, которая, в свою очередь, является продолжением заявки под регистрационным номером 07/249616, зарегистрированной 26 сентября 1988, теперь абандонированной.

Область техники, к которой относится изобретение

Данная заявка относится к области генной инженерии геномов растений, в частности к генной инженерии генома пластид, таких как хлоропласты, и к устойчивой трансформации хлоропластового генома растения любого вида.

Родственные технические решения

Данная заявка относится, в частности, к универсальному хлоропластовому экспрессионному и интеграционному вектору, компетентному для трансформации любого растения одним или несколькими генами, представляющими интерес. В ранее зарегистрированной заявке на патент под регистрационным номером 08/591407 описываются растительные клетки, трансформированные с помощью экспрессионной кассеты, содержащей последовательность экзогенной ДНК, которая устойчиво интегрирована (ковалентно связана) с хлоропластовым геномом клетки растения-мишени. Устойчиво интегрированными последовательностями ДНК являются последовательности, которые наследуются через репликацию генома дочерними клетками или организмами. Эта устойчивость проявляется через способность создавать постоянные клеточные линии, клоны или трансгенные растения, составляющие популяцию, содержащую экзогенную ДНК.

Подобным образом в патенте США 5693507 (1997), Danielle and McFadden, описываются устойчивая интеграция с помощью экспрессионной кассеты, содержащей последовательность экзогенной ДНК, кодирующей нужный признак, и трансформированные растения.

Предпосылки создания изобретения

Преимущества трансформации хлоропластов перед трансформацией ядер.

Привлекательность трансформации хлоропластового генома перед трансформацией ядерного генома связана с серьезными опасностями, являющимися результатами последней. Общеизвестное беспокойство вызывает утечка чужеродных генов при рассеивании пыльцы от трансгенных культурных растений к их диким родственным формам. Показано, что трансгенная пыльца будет доставлять чужеродные (трансгенные) гены к другим растениям, совместимым по половым признакам (что определяется распространенностью гена-маркера в потомстве, собранном от нетрансгенных растений, выросших на прилегающих площадях). Например, наблюдалось рассеяние пыльцы с центральной опытной делянки, содержащей трансгенные растения хлопчатника, на окружающие нетрансгенные растения на разных расстояниях в разных направлениях (Lewellyn and Fitt, 1996; Umbeck, P.F., et al., 1991). Кроме того, концентрация генов-маркеров в диком подсолнечнике составляла в среднем примерно 28-38%; в дикой землянике, растущей в пределах 50 метров от участка с земляникой, свыше 50% диких растений содержали гены-маркеры от культурной земляники (King, J., 1996).;

Утечка чужеродных генов через пыльцу вызывает особенно сильное беспокойство за окружающую среду в случае генов устойчивости к гербицидам из-за высокой степени потока от культурных растений к диким родственным формам. Вызывает тревогу, что утечка генов от трансгенных культурных растений к их диким родственным формам будет создавать супер-сорняки. Для риса (Oryza sativa) отмечен поток генов от культурных сортов к диким родственным формам - к О. perennis (Barrett, 1983) и к красному рису (О. sativa; Langevin et al., 1990). На юге США красный рис становится основным сорняком, поскольку гербициды, поражающие его, также поражают культурный рис. На рис, загрязненный красным рисом, устанавливаются более низкие цены. Некоторые исследователи вводят в культурный рис ген bar, придающий устойчивость к глуфозинату (Liberty), чтобы бороться с его дикой формой (Oard et al., 1996; Sankula et al., 1996). Однако из-за совместимости по половому признаку введение гена, экспрессируемого в ядре, будет допускать передачу признака такой устойчивости красному рису через пыльцу.

Подобным образом трансгенный масличный рапс, которому методами генной инженерии придана устойчивость к гербицидам, непреднамеренно скрещивался с дикой родственной формой Brassica campestris (горчица полевая) и придавал устойчивость к гербицидам даже у первой генерации от обратного скрещивания в полевых условиях (Mikkelson, T.R., et al., 1996).

Материнская наследственность введенных генов предотвращает утечку генов через пыльцу. Введение чужеродных генов через хлоропластовые геномы (которые матерински наследуются в случае большинства культур) является решением этой проблемы. Также ферменты или белки мишени для большинства гербицидов (например, пути биосинтеза аминокислот и жирных кислот или фотосинтез) являются компартментализованными в пределах хлоропласта. Другим важным преимуществом трансформации хлоропластов является более высокий уровень экспрессии чужеродных генов из-за очень высокого числа копий (5000-10000) хлоропластовых геномов в растительных клетках. Поскольку механизм транскрипции и трансляции хлоропласта является прокариотным по природе, гены устойчивости к гербицидам бактериального происхождения можно экспрессировать в хлоропластах на чрезвычайно высоком уровне.

Трансформация хлоропластового генома.

Ранние исследования по трансформации хлоропластов сосредотачивались на разработке органелло-систем с использованием интактных хлоропластов, способных к эффективной и длительной транскрипции и трансляции (Daniell and Rebeiz, 1982; Daniell et al., 1983), и экспрессии чужеродных генов в выделенных хлоропластах (Daniell and McFadden, 1987). Эти эксперименты проводились на основании предпосылки, что можно ввести выделенные интактные хлоропласты в протопласты и регенерировать трансгенные растения (Carlson, 1973). Открытие генной пушки в качестве приспособления для трансформации предоставило возможность прямой пластидной трансформации в растениях (Daniell, 1993). С использованием генной пушки были осуществлены неустойчивая экспрессия чужеродных генов в пластидах двудольных (Daniell et al., 1990; Ye et al., 1990), однодольных (Daniell et al., 1991), длительная экспрессия чужеродных генов с использованием независимо реплицирующихся хлоропластовых экспрессионных векторов (Daniell et al., 1990) и устойчивая интеграция селектируемого маркера в хлоропластовый геном табака (Svab and Maliga, 1993). Растения табака, устойчивые к некоторым насекомым, получены посредством интеграции гена cryIAc в хлоропластовый геном табака (McBride et al., 1995; патент США 5451513, включены в настоящее описание в качестве ссылок). Устойчивая трансформация пластид высших растений осуществлена пока только в табаке.

Известные исследования хлоропластового генома.

Что касается устойчивой интеграции чужеродного гена в хлоропластовый геном высшего растения, то на сегодняшний день есть сообщения о такой интеграции только в табаке. Это достигнуто с помощью вектора, специфического для табака, который получен из хлоропластового генома табака,; т.е. вектор содержал последовательность, гомологичную только хлоропластовому геному табака, которая не является высококонсервативной в хлоропластовых геномах других растений. Такой вектор не подходит для устойчивой трансформации растений иных, чем табак, видов. Единственное опубликованное сообщение об экспрессии чужеродного гена в ином, чем табак, виде растения относится к листьям и зародышам пшеницы (Daniell et al., 1991), но устойчивая интеграция не осуществлена. Никогда не сообщалось об устойчивой интеграции чужеродного гена в хлоропластовый геном однодольного растения. По крайней мере, ранее описанные схемы трансформации/регенерации в хлебных злаках (однодольные) нельзя приспособить к трансформации пластид из-за неэффективности наследования в пределах таких систем. Также считавшиеся важными для достижения гомоплазмии последовательные/серийные отборы (повторные отборы) (Daniell, 1997) нельзя осуществить с применением таких используемых систем регенерации. Разработанные в последнее время уникальные схемы трансформации/регенерации кукурузы (Rudraswamy, 1997) и риса (не опубликовано) обладают потенциалом для проявления существенно возросшей эффективности и допускают свыше одного цикла отбора во время регенерации.

В патенте США 5451513, Maliga et al., и в работе Svab et al., 1990, описывается трансформация пластидного генома табака с помощью метода нелетального отбора, при котором используется пластидная ДНК, кодирующая нелетальный селектируемый фенотип. Согласно Maliga et al., необходим именно нелетальный отбор для получения транспластгенных линий.

В отличие от метода Maliga et al. способ изобретения относится к отбору, который является летальным для всех нетрансформированных растений за исключением табака. Выживают и продолжают расти только трансформированные растения. Такой летальный отбор происходит практически со всеми антибиотиками, включая спектиномицин и стрептомицин, в среде, содержащей антибиотик в концентрации 500-1000 мкг/мл. Maliga et al. показали, что подобные условия не являются летальными для табака. Более того, в отличие от метода Maliga et al. в соответствии со способом изобретения трансформации до гомоплазмии можно достичь даже в первом цикле отбора.

В заявке на европейский патент №0251654, Cannon et al., описывается транспозонопосредованная трансформация хлоропластов табака, например, с использованием бактериального транспозона Тn5. Вектор, содержащий транспозон, направляется в хромосомную область, известную как транскрипционно молчащая область, для того, чтобы сохранить транскрипционную целостность нативных генов. Такая транскрипционно молчащая область идентифицируется как область, локализованная между двумя дивергентными промоторами хлоропластовых генов, например, промоторами для генов для большой субъединицы хлоропласта рибулозобисфосфаткарбоксилата (RbcL, LS RuBisCo) и для -АТФазы (atpB). Эти промоторы транскрибируют гены в противоположных направлениях от молчащей области хромосомы. Cannon et al. не описывают терминатор транскрипции в экспрессионном векторе, но известно, что для экспрессии генов в пластидах необходимы именно такие терминаторные области. Наконец, не показано, что Cannon et al. осуществили устойчивую трансформацию хлоропластов.

Описанное здесь изобретение имеет несколько признаков отличия от метода Cannon et al. В изобретении описывается устойчивая трансформация, передаваемая потомству. Интеграция не направляется в транскрипционно неактивную область хлоропластовой хромосомы. По изобретению кассету (содержащую терминатор транскрипции, как описано здесь далее) интегрирует в транскрипционно активную область хлоропластового генома. Промоторы регулируют экспрессию одного или нескольких генов. В отличие от метода Cannon et al. в соответствии с данным изобретением транспозон не участвует в трансформации хлоропласта.

В публикации в NATO Asi Series, Daniell et al., 1994 сообщается о придании устойчивости к вредным насекомым через хлоропластовые геномы, причем демонстрируется экспрессия белка CryIIA в растениях для борьбы с насекомыми. Сообщение Daniell et al. поддерживают работа McBride et al., 1995, и патент США 545818 (1996), где описывается экспрессия белка CRYAc Bacillus thurin-giensis в пластидах. Векторы, описанные McBride, созданы для введения конструкции только в хлоропластовый геном табака.

Потребность в векторе для трансформации различных растений.

Из уровня техники очевидно, что существует насущная потребность в хлоропластовом интеграционном и экспрессионном векторе для трансформации, предпочтительно устойчивой, хлоропластовых геномов многих различных видов растений. Такой универсальный вектор позволил бы осуществить трансформацию хлоропластового генома выбранного растения-мишени гетерологичной (чужеродной) кодирующей последовательностью ДНК и устранил бы необходимость создания векторов, каждый из которых специфически подходит для трансформации хлоропластового генома определенного вида растения, которое необходимо трансформировать.

Проблема создания такого универсального вектора, отвечающего требованиям трансформации различных растений, знакома авторам изобретения, но пока не решена.

Представления известного уровня техники о межгенной спейсерной области.

В то время как нуклеотидная последовательность кодирующих областей генома, в том числе хлоропластового генома, часто консервативна среди видов, последовательности, фланкирующие функциональные гены, т.е., спейсерные области между кодирующими областями, напротив, как правило, не являются консервативными. Признанное мнение по поводу утраты консервативности и, таким образом, низкой степени гомологии между видами спейсерных областей состоит в том, что спейсерные области, как правило, не осуществляют существенных функций. Следовательно, имеется небольшое, если вовсе не отсутствует, селекционное давление для сохранения последовательности спейсерных областей среди видов. Последовательность спейсерных областей может изменяться без нежелательных эффектов.

Stummann et al., 1988, сообщают, что последовательность генов оперона рибосомной РНК хлоропластового генома одинакова в разных видах растений, включая табак, маис и печеночник (Marchantia), и что кодирующие последовательности этого оперона высокогомологичны. Stummann также сообщает, что межвидовая гомология оперона меньше, чем межвидовая гомология кодирующих областей генов. Это обстоятельство согласуется с утратой консервативности спейсерных областей и означает, что межвидовая гомология спейсерных областей в опероне рибосомной РНК является относительно низкой.

В изобретении в противоположность мнению об утрате консервативности спейсерных областей для создания векторов, компетентных для трансформации различных растений, используются спейсерные области, которые являются высококонсервативными среди различных растений.

Общее представление об изобретении

Изобретение относится к универсальным хлоропластовым интеграционным и экспрессионным векторам, которые компетентны для устойчивой трансформации и интеграции генов, представляющих интерес, в хлоропластовый геном многих видов растений. Изобретение относится к трансформированным растениям и их потомству. Трансформируются однодольные и двудольные растения, которые прежде никогда не трансформировались. Растения трансформируют синтетическим геном для экспрессии ценных разлагающихся под действием микроорганизмов полимеров на основе белков (РВР). Трансформированные растения продуцируют очень ценные молекулы. Сельскохозяйственным культурам придается устойчивость к основным классам химических гербицидов. Устойчивость к гербицидам используется в качестве летального селектируемого маркера для трансформации хлоропластов. Трансформированные растения способны экспрессировать кроме намеченного признака, желательный вторичный ненамеченный признак. Трансформированным растениям придается устойчивость к насекомым, как по отношению к насекомым, чувствительным к Bt-токсинам, так и по отношению к насекомым, которые выработали устойчивость к Bt-токсинам.

Краткое изложение сущности изобретения

Межвидовая спейсерная область. Концепция изобретения.

Обнаружено в противоположность общепринятому мнению, что хлоропластовый (ct) геном растений содержит спейсерные области с весьма консервативными нуклеотидными последовательностями. Высококонсервативный характер нуклеотидных последовательностей этих спейсерных областей хлоропластового генома делает такие спейсерные области, как обнаружено, идеальными для создания векторов для трансформации хлоропластов самых разных видов растений и устраняет необходимость создания отдельных векторов для разных растений или отдельных культурных видов, что могло бы потребовать определения сначала последовательности ДНК каждого из хлоропластовых геномов. Это открытие имеет множество полезных последствий и важно для практических применений.

Некоторые варианты воплощения изобретения

Универсальный вектор.

Изобретение имеет несколько полезных вариантов своего воплощения. Изобретение относится к универсальному интеграционному и экспрессионному вектору, называемому здесь далее UV, и к его применению для экспрессии по меньшей мере одного фенотипа во многих различных растениях.

Интеграционный эксперссионный универсальный вектор изобретения содержит экспресионную кассету (также описанную ниже), содержащую необходимые генетические элементы для неустойчивой или предпочтительно устойчивой трансформации пластид, например, хлоропластового генома, клетки растения-мишени чужеродной (гетерологичной) ДНК, кодирующей представляющую интерес молекулу, как фенотипа, который экспрессируется растительной или нерастительной высокоценной молекулой, подобной биологически активному пептиду (или полипептиду). Универсальный вектор создают с транскрипционно активной областью хлоропластового генома, которая является высококонсервативной во многих хлоропластовых геномах высших растений. Предпочтительно, чтобы эта область являлась спейсером 2 - межгенной спейсерной областью между t-RNAIle и областью tRNAAla. Такая область здесь частно относится к спейсерной области, поскольку в хлоропластовом геноме она является межгенной между несколькими генами в опероне рРНК, который транскрибируется одним промотором. Когда такую область встраивают в универсальный вектор, ее обычно называют здесь пограничной или, предпочтительно, фланкирующей последовательностью или фланкирующими последовательностями. Это так, поскольку в универсальном векторе операбельно связанные генетические элементы для устойчивой трансформации пластиды растения-мишени фланкируются с каждой стороны последовательностью, т.е. фрагментом спейсерной области. Флакирующие последовательности в векторе и спейсерные последовательности в хлоропластовом геноме имеют достаточную гомологию друг с другом, чтобы претерпевать гомологичную рекомбинацию. Универсальный вектор встраивают в спейсер транскрипционно активной области в хлоропластовом геноме. Как правило, спейсерная область расположена в области инвертированного повтора хлоропластового генома. Остальную часть конструкции, т.е. кроме фланкирующих последовательностей и экспрессионной кассеты, как правило, здесь называют вектором, содержащим бактериальные последовательности, подобные плазмидным клонирующим векторам pUC, pBR322, pGEM или pBlueScript.

Экспрессионный вектор или кассета.

Универсальный вектор содержит экспрессионную кассету, которая фланкирована с каждой стороны фланкирующей последовательностью. Подходящая для применения в изобретении экспрессионная кассета описана в патенте США 5693507 (1997), включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Такая кассета содержит операбельно связанные область инициации транскрипции, функциональную в хлоропласте растения, по меньшей мере одну гетерологичную последовательность ДНК, кодирующую представляющую интерес молекулу-мишень, например, ген (или его функциональную часть), кодирующий биологически активное соединение, и регулярные последовательности, расположенные перед 5- и после 3-концов, и область терминации транскрипции, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластовом геноме растения-мишени. Предпочтительно экспрессионная кассета фланкируется последовательностями ДНК растения, подобными последовательностям ДНК хлоропласта, для того, чтобы облегчить устойчивую интеграцию экспрессионного вектора в хлоропластовый геном. В конструкции экспрессионной кассеты последовательность ДНК содержит один или несколько сайтов клонирования для интеграции представляющего интерес гена (генов).

Спейсерные последовательности, идентифицированные в пластидах высших растений, повсеместно консервативны среди большого разнообразия растений. Найдено, что эти последовательности идеальны для создания универсальных векторов изобретения, которые в результате компетентны для трансформации хлоропластового генома самых разных (или множества) растений-мишеней посредством гомологичной рекомбинации. Таким образом, несущественно, из какого отдельного спейсера определенного растения создают универсальный вектор.

Как известно, как правило, будет целесообразно иметь по меньшей мере одну дополнительную гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую отбираемый фенотип, такую как ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам, или его функциональную часть, которые будут служить в качестве маркера, связанного с экспрессионной кассетой или с универсальным интеграционным экспрессионным вектором. Это облегчает идентификацию растительных клеток, в которые устойчиво интегрирован чужеродный ген. Маркерные гены известны из литературы, например -лактаназа, гены устойчивости к гербицидам, такие как мутантный ген psbA, или EPSPS-aroA, cat-ген, кодирующий хлорамфениколацетотрансферазу, и ген uidA, кодирующий -глюкуронидазу (gus), и другие.

Выяснилось, что табак является уникальным в отношении невосприимчивости к летальному воздействию стрептомицина и спектиномицина. Хотя листья табака теряют пигментацию под воздействием среды с такими антибиотиками, можно наблюдать продолжение роста. Однако в этом свойстве табака легко обмануться. Существует множество доступных антибиотиков, летальных для табака, таких как гидромицин. При другом подходе следует отбирать ген, который экспрессирует видимый маркер, подобный окраске, флуоресценции и т.п., подобный репортерному гену mGFP, кодирующему белок зеленой флуоресценции.

Способ трансформации.

Изобретение относится к способу трансформации, который может обеспечить гомоплазмию (интеграцию чужеродных генов во все хлоропластовые геномы растительной клетки) после первого цикла отбора без необходимости дальнейшего процесса отбора. В способе трансформации растения используется универсальный вектор, построенный с фланкирующими последовательностями из иного вида растения, чем вид трансформируемого растения-мишени. С другой стороны, вектор может; содержать фланкирующие последовательности из того же вида, что и растение-мишень, в том числе из табака.

Способ создания универсального вектора.

Изобретение также относится к способу создания универсального хлоропластового интеграционного и экспрессионного вектора. Для того чтобы это осуществить, установили, что спейсерная часть хлоропластового генома из любого растения высоко гомологична в нескольких видах растений. Нуклеотидную последовательность, соответствующую этой спейсерной области, получают из идентифицированного хлоропластового генома (или синтезируют) и вводят в подходящий вектор, например в плазмиду, посредством субклонирования. Спейсерная область располагается как фланкирующие последовательности к экспрессионной кассете, содержащей необходимые генетические элементы для трансформации пластиды и экспрессии чужеродного гена (генов).

Можно использовать любой способ трансформации хлоропласта. Любой ген (или его функциональная часть), который можно использовать для трансформации хлоропласта и который кодирует нужный пептид, придающий нужный признак растению-мишени, подходит для трансформации с помощью универсального вектора.

Трансформированные растения. Изобретение также относится к растениям, в которых хлоропластовый геном устойчиво, т.е. перманентно, трансформирован универсальным вектором изобретения, включая их потомков.

Изобретение включает однодольные растения, подобные хлебным злакам, такие как маис, рис, ячмень, овес, пшеница и злаковые, или растительные клетки, и их потомство, в которых хлоропластовый геном устойчиво трансформирован универсальным вектором, полученным из того же вида, что и трансформируемое растение, или из другого вида. Изобретение относится к двудольным и однодольным растениям, устойчиво трансформированным за один цикл отбора, вследствие гомоплазмии, достигнутой с помощью универсального вектора, содержащего хлоропластовую точку начала репликации (ori). Изобретение также относится к устойчиво трансформированным растениям различных видов, включая сорта одного и того же вида, родов, семейств, отрядов и типов растений.

В соответствии с изобретением растение, в котором хлоропластовый геном устойчиво трансформирован одним или несколькими чужеродными генами, представляющими интерес, включает зрелые растения и их потомство, подобное проросткам и зародышам. Термин растение в данном контексте включает также части растения, такие как эксплантаты, подобные черенкам, тканевые культуры, клеточные суспензии и каллюсы.

Таким образом, изобретение включает устойчиво трансформированные многоклеточные растения, их потомство, семена и трансформированные пластиды, например, хлоропласт и т.п., и способ регенерации трансформированных растений.

В данном описании и в формуле изобретения, когда упоминаются различные виды, термин вид относится не только к видам, но и к сортам в пределах вида, родам, семействам, отряду и типам растительного мира. Таким образом, следует иметь в виду, что универсальный вектор, который можно использовать для трансформации растений различных видов, способен трансформировать растения различных сортов в пределах вида, различных родов, различных семейств, различных отрядов и различных типов. Подразумевается, что термин растение (или растения), используемый здесь, является обобщающим.

Экспрессия нерастительных продуктов

Гены биополимеров.

Другой вариант воплощения изобретения с использованием универсального интеграционного и экспрессионного вектора относится к растениям, трансформированным геном синтетического биополимера, который кодирует разлагаемые микроорганизмами полимеры на основе белков (РВР).

Эти полимеры обладают важными, имеющими большое практическое значение свойствами, описанными далее.

Получение высокоценных молекул - биологически активных молекул.

Вызывающее интерес открытие, что осуществима трансформация синтетическим геном для получения ВРВ, который не требует природного аналога в животном или растении, демонстрирует широкую применимость вектора еще в одной области человеческой деятельности - получения в растениях биологически активных молекул, подобных фармацевтическим средствам, из любого синтетического или природного гена или его функциональной части.

Следовательно, еще одним вариантом воплощения изобретения является применение трансформированных растений в качестве биореакторов (фабрик) для фармацевтических средств. Существуют по меньшей мере две потенциальные возможности, обычно необходимые для получения белков или ценного фармацевтического продукта, которые невозможны в прокариотных системах. Растения в отличие от бактерий способны продуцировать чужеродный белок в биологически активной форме. Растения часто также более толерантны к изменению их путей биосинтеза. Таким образом, растения можно трансформировать геном, нефункциональным в растениях (или чужеродным для них), который может быть синтетическим или нет, который может являться нормально функционирующим (компетентным) в животных (млекопитающих), яйцекладущих, в насекомых или других видах.

Изобретение также относится к трансформированным растениям, содержащим ген, полученный с помощью экспрессионной кассеты, предпочтительно - универсального вектора, который кодирует множество нужных продуктов, в частности биологически активные молекулы, подобные пептидам (полипептидам), белкам, инсулину, сывороточному альбумину человека (HSA), и другие молекулы, также описанные здесь далее. Растениям дают возможность расти или вызывают их рост и выделяют продукты из трансформированной культуры, подобной табаку, маису и т.п., и, если необходимо, сначала собирают и, если необходимо, очищают.

Толерантность к гербицидам.

Еще один важный вариант воплощения изобретения относится к трансгенным устойчивым к гербицидам растениям, в которых в хлоропластовый геном с помощью универсального вектора введен, предпочтительно - устойчиво, чужеродный трансген, придающий устойчивость к одному или нескольким гербицидам. Особенно важными являются трансформированные растения, обнаруживающие устойчивость к глифозату и, таким образом, устойчивы к ROUNDUP - гербициду, коммерчески доступному от Monsanto Company. Универсальный вектор обеспечивает эффективное средство трансформации хлоропластового генома любого растения и придания устойчивости (или толерантности) к любому из гербицидных химикатов.

Другим аспектом изобретения является способ трансформации растения с помощью экспрессионной кассеты, предпочтительно с помощью универсального вектора, чтобы вызвать в нем продуцирование ненамеченного (вторичного или другого) признака (или фенотипа). (См., например, Penazloza, V., et al. (1995), где сообщается, что экспрессия геном громицин--фосфотрансферазы придает устойчивость к гербициду глифозату.]

В другом аспекте изобретения устойчивость к гербициду используют в качестве маркерного гена для трансформации хлоропластов.

Устойчивость к насекомым. Другой вариант воплощения изобретения относится к устойчивости к насекомым. При возрастании беспокойства в связи с применением химических пестицидов широко пропагандируется применение композиций с Bacillus thuringiensis (Bt). Bacillus thuringiensis продуцирует многие типы кристаллических включений, токсичных для насекомых. Белки, содержащие такие включения, классифицированы на основании круга насекомых-хозяев и гомологии белков. Токсины CRYI и CRYII обладают инсектицидной активностью против чешуекрылых или чешуекрылых и двукрылых соответственно. Протоксины CRYI имеют размер 130-135 кД и ферментативно расщепляются на белки в 65 кД с инсектицидным действием. Протоксин CRYII имеет размер 65 кД с белком с молекулярной массой 60-62 кД для инсектицидной активности. Многие имеющие значение для хозяйства насекомые-вредители (особенно семейства огневок) восприимчивы к токсину CRYIIA, в том числе мотылек кукурузный Ostrinia nubilalis, точильщик зерновой кукурузный Elasmopalpus lignosellus, огневка бобовая Maruca testulalis, совка Heliothis virescens, бражник Manduca sexta и шелкопряд непарный Lymantria dispar, Daniell et al., 1994.

Однако композиции с Bt не настолько эффективны, как первоначально ожидалось, из-за их чувствительности к УФ-излучению, неадекватного покрытия, дороговизны и ограниченного круга хозяев. Поэтому привлекательна доставка токсинов Bt с помощью Bt-трансгенных растений.

Приемлемый уровень борьбы с насекомыми имеет место в случае ядерного трансгенного Bt-хлопчатника против совки Heliothis virescens, но эти растения экспрессируют недостаточно Bt-токсина для борьбы с совкой хлопковой Helicoverpa zea. Кроме того, эти Bt-гены могут непреднамеренно переноситься на родственные растения через пыльцу. С целью обойти эти трудности оценивали трансформацию хлоропластов и экспрессию в соответствии с изобретением по перечисленным далее причинам. 1) Растительные клетки, содержащие хлоропласты, могут содержать до 10000 копий генов на клетку, 2) хлоропласты могут считывать интактную бактериальную ДНК, включая опероны, и 3) хлоропластовые геномы наследуются матерински и, следовательно, утечка чужеродного гена через пыльцу решительно исключается, поскольку ДНК хлоропластов, как правило, разрушается в пыльце.

CRY2A выбран, потому что CRY2A относительно негомологичен CRY1A и, следовательно, проявляет только слабую перекрестную устойчивость против некоторых устойчивых к CRY1A популяций Н. virescens. Поскольку CRY2A является укороченным по природе, можно достичь высоких уровней экспрессии, не жертвуя 3-областью.

Соответствующая устойчивость для хлоропластового генома табака, трансформированного универсальным вектором изобретения, достигнута к насекомым, по природе чувствительным к Bt-токсинам, а также к насекомым, которые выработали устойчивость или меньшую восприимчивость к Bt-токсинам. Насекомые, которые никогда не погибали под действием какого-либо токсина CRY, показали 100% смертность на трансформированном табаке.

Следовательно, экспрессия cry2А в растении может представлять чрезвычайно полезный инструмент при борьбе со многими насекомыми-вредителями, причем в это же время преодолевается устойчивость к Bt. В хлоропластах на высоком уровне экспрессируются другие инсектицидные белки, такие как холестеролоксидаза, которые убивают долгоносика хлопкового по другому механизму.

В дальнейшем станут очевидными другие варианты воплощения изобретения.

Описание чертежей

Фигура 1 показывает карту хлоропластового генома табака. Жирные линии на карте генома представляют области инвертированного повтора хлоропластового генома. Стрелки, помеченные UV, показывают инсерционные последовательности для предпочтительного варианта универсального интеграционного и экспрессионного вектора (UV); стрелка, помеченная TV, показывает инсерционную последовательность для табачного вектора (TV).

Фигура 2А показывает хлоропластовый вектор табака (TV) pZS-RD-EPSPS для экспрессии устойчивости к гербицидам.

Фигура 2Б показывает универсальный хлоропластовый экспрессионный и интеграционный вектор (UV) pSBL-RD-EPSPS для экспрессии устойчивости к гербицидам.

Фигура 3А показывает универсальный хлоропластовый интеграционный и экспрессионный вектор pSBL-CG-EG121 для экспрессии биополимеров.

Фигура 3Б показывает интеграцию и экспрессию в табаке и вектор pZS-CG-EG121 для экспрессии биополимеров.

Фигуры 4А-4Д показывают гомологию последовательностей спейсерных областей табака и других видов культурных растений. Сайт встраивания чужеродного гена показан стрелками. Перед сайтом встраивания чужеродного гена показан сайт точки начала репликации (ori).

Фигуры 4Е-4Ж показывают выстроенные в ряд последовательности рДНК 16S-23S спейсерной (64 п.о.) области некоторых культурных видов и последовательности хлоропласта табака, где (+) представляет положительные и (-) отрицательные цепи соответственно.

Фигуры 5А-В показывают построение границы вектора pSBL-Ct.

Фигуры 6А-В показывают построение кассеты гена селектируемого маркера вектора pSBL-CtV1, содержащей промотор 16S рРНК хлоропласта (Prrn), ген aadA и 3 нетранслируемую область гена хлоропласта psbA.

Фигуры 7А-7Г показывают векторы pSBL-CtV2, pSBL-CtV3, pSBL-CtVH и pSBL-CtVHF соответственно.

Фигуры 8А-Б показывают векторы pSBL-CtVHBt и pSBL-CtVHBtR соответственно.

Фигура 9 показывает трансформированные и нетрансформированные растения табака, растущие в присутствии спетиномицина, указывая на нелетальный отбор на данной среде (500 мкг/мл). Отмечается рост трансформированных (обесцвеченных) и нетрансформированных (зеленых) листьев.

Фигуры 10А-Ж показывают пластидную трансформацию и регенерацию кукурузы.

Фигура 11 показывает пластидную трансформацию кукурузы. Трансформированные растения кукурузы растут нормально (средний побег), в то время как нетрансформированные растения погибают на летальной среде, подтверждая летальный отбор с помощью антибиотика (1000 мкг/мл, спектиномицин).

Фигуры 12А-12Е показывают пластидную трансформацию и регенерацию риса.

Фигуры 13А и 13Б показывают анализ методом PCR ДНК, выделенной из листьев трансформантов риса.

Фигура 14 показывает пластидную трансформацию арахиса. Трансформированные растения арахиса растут нормально (средняя и левая части фигуры), в то время как нетрансформированные растения погибают на летальной среде (500 мкг/мл спектиномицина).

Фигура 15 показывает пластидную трансформацию сои. Два трансформированных растения дают побеги, в то время как другие растения погибают на летальной среде, подтверждая летальный отбор с помощью антибиотика (500 мкг/мл, спектиномицин).

Фигура 16 показывает трансформацию зародышей сладкого картофеля на среде для летального отбора (500 мкг/мл спектиномицина).

Фигура 17 показывает трансформацию клеток винограда. Трансформированные культивированные клетки становятся зелеными, в то время как нетрансформированные клетки погибают в среде для летального отбора (500 мкг/мл спектиномицина).

Фигура 18 показывает синтез биополимера на основе белка (РВР) в Е. coli. с помощью хлоропластовых интеграционных и экспрессионных векторов.

Фигура 19 показывает анализ методом Саузерн-блоттинга, осуществленный с транформантами РВР-трансгенных растений с использованием табачного вектора (TV). Зонды из пограничных последовательностей хлоропластов (А) или из последовательностей гена полимера (EG121) (В).

Фигура 20 показывает анализ методом Саузерн-блоттинга, осуществленный с транформантами РВР-трансгенных растений с использованием универсального вектора (UV). Зонды из пограничных последовательностей хлоропластов (А) или из гена aadA (В).

Фигура 21А показывает содержание транскриптов чужеродного гена, проанализированное методом Нозерн-блоттинга с использованием полной РНК, выделенной из контрольного растения, хлоропластовых трансформантов и ядерного трансгенного растения табака, интенсивно экспрессирующих ген синтетического биополимера (EG121).

Фигура 21Б показывает увеличенное изображение полос 4-7 с фигуры 21А.

Фигура 22 показывает анализ методом Вестерн-блоттинга очищенного полимера-белка из трансгенных растений.

Фигура 23А показывает повышенную скорость роста Е. coli, содержащей табачный вектор с геном EPSPS.

Фигура 23Б показывает повышенную скорость роста Е. coli, содержащей универсальный вектор с геном EPSPS.

Фигуры 24А-24Б показывают интеграцию чужеродных генов в пластидный геном с помощью PCR с использованием праймеров rbcL и aadA (А) или праймеров 16SRNA и aadA (В).

Фигуры 25А-25В показывают с помощью анализа по Саузерну интеграцию гена аrоА в хлоропласт и высокую генерацию гомоплазмии с использованием зонда EPSPS (А) или зонда rcbL-orf512. Сайт интеграции показан на фигуре (В).

Фигуры 26А и 26Б показывают генерацию семян, собранных с контрольных и трансформированных растений табака соответственно, в присутствии селектируемых маркеров.

Фигуры 27А и 27Б показывают трансгенные и контрольные растения табака, опрысканные глифозатом.

Фигуры 28А и 28Б показывают растения табака, чувствительные (контрольные) и устойчивые (трансгенные) к насекомым.

Фигура 29 показывает (анализ методом Вестерн-блоттинга) полный белок, выделенный из контрольных и трансгенных растений табака.

Далее более подробно описываются предпочтительные варианты воплощения изобретения.

Подробное описание изобретения

Универсальный интеграционный и экспрессионный вектор.

Универсальный интеграционный и экспрессионный вектор изобретения компетентен для устойчивой трансформации хлоропластов самых разных видов растений. Гетерологичные кодирующие последовательности ДНК можно получить в кассете для кодирования фенотипа, такого как устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым, или других признаков. Вектор также содержит фланкирующую последовательность на каждой стороне кодирующей последовательности ДНК, которая гомологична спейсерной последовательности хлоропластового генома, и такая спейсерная последовательность консервативна в хлоропластовых геномах различных растений. При таком подходе устойчивая интеграция гетерологичного гена в хлоропластовый геном растения-мишени облегчается за счет гомологичной рекомбинации фланкирующих пограничных последовательностей с комплементарными спейсерными последовательностями в хлоропластовом геноме. Универсальный вектор компетентен для трансформации любых видов растений.

Обнаружено, что спейсерная область trnI и trnA является весьма консервативной в очень многих видах растений от цианобактерий до высших растений, таких как однодольные и двудольные. Гены trnI и trnA фланкируют с каждой стороны спейсерную область, названную спейсер 2 или область spa 2 (фигуры 4Е-4Ж). Области с любой стороны спейсерной области также обладают почти полной гомологией с соответствующими областями в разных видах растений от цианобактерий до высших растений за исключением того, что высшие растения содержат два интрона в генах trnI и trnA. Более длинные пограничные последовательности имеют свойство благоприятствовать более эффективной интеграции чужеродной ДНК. Поэтому, хотя и не в основном, гомология между видами генов trnI и trnA в дополнение к гомологии спейсерной области вносит вклад в эффективность трансформации и интеграции (фигуры 4А-4Д).

Если в вектор включаются более длинные последовательности, содержащие негомологичные части, негомологичная часть последовательности будет выпетливаться и вырезаться в процессе рекомбинации и не будет интегрироваться в хлоропластовый геном-мишень.

Различные универсальные векторы можно создать со спейсерной областью. Например, более короткие или более длинные фланкирующие последовательности можно соединить с частями или со всеми генами trnI и trnA, примыкающими к spa 2.

Предпочтительный универсальный вектор содержит фланкирующие последовательности и экспрессионную кассету, содержащую перечисленные далее генетические элементы для обеспечения транскрипции и трансляции кодирующей последовательности ДНК, выстроенные в следующем порядке (от 5- к 3-концам): часть 5 фланкирующей последовательности, промотор, функциональный в хлоропласте, последовательность ДНК с соответствующим сайтом (сайтами) клонирования для встраивания одной или нескольких кодирующих последовательностей для нужного фенотипа или представляющей интерес молекулы, и для селектируемого маркера, терминатор транскрипции и часть 3 фланкирующей последовательности. Порядок расположения последовательностей ДНК, кодирующих нужный фенотип, и селектируемого маркера может быть изменен. Можно добавить фланкирующие последовательности ДНК растения для промотирования устойчивой интеграции. Предпочтительно фланкирующая последовательность содержит точку начала репликации (ori).

Особенно отмечается, что высококонсервативная спейсерная область находится в инвертированном повторе хлоропластового генома. Однако особое местоположение спейсера в хлоропластовом геноме не так важно, как его высокая гомология со спейсерной областью различных растений.

Кроме того, как можно видеть из фигур 4Е-4Ж, последовательность спейсера 2 (или spa 2), имеющая длину в 64 п.о., является слишком короткой, чтобы включать ori хлоропластового генома, которая располагается перед этим спейсером. При необходимости включения ori следует отбирать более длинную спейсерную последовательность, заключающую в себе ori, которая будет включать спейсерную последовательность и дополнительную последовательность во фланкирующих последовательностях. При этом получится более длинная матрица для гомологичной рекомбинации в хлоропластовый геном реципиента и промотирования гомоплазмии.

Другим предпочтительным вектором является вектор, в котором фланкирующие последовательности содержат, каждая, кроме спейсера 2, часть или всю межгенную спейсерную область между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома (фигуры 4А-4Д). Кроме того, фланкирующие последовательности могут включать части или все гены tRNAIle и tRNAAla соответственно. Необязательно, фланкирующие последовательности содержат, каждая, части или полные последовательности генов rRNA 16S и/или 23S.

Примеры универсальных векторов.

Предпочтительный универсальный вектор содержит последовательность ДНК, которая содержит последовательность области спейсера 2 между высококонсервативными генами trnI и trnA между генами 16S-23S rRNA хлоропластового генома. Предпочтительно эта область содержит часть или всю последовательность ДНК (фигуры 4Е-4Ж) генов trnI и trnA. Эту область вырезают из отобранного растения, подобного табаку, и субклонируют в обычную доступную плазмиду, подобную pUC19, например, в сайте PvuII. В плазмиду встраивают экспрессионную кассету, которая содержит ген селектируемого маркера, хлоропластовый промотор 16SrRNA, ген, кодирующий фермент, придающий устойчивость к антибиотику, подобный гену aadA, кодирующему аминогликозид-3-аденил-трансферазу, придающую устойчивость к стрептомицину и спектиномицину, и 3 нетранслируемую область гена хлоропласта psbA.

Конкретно, когда создают универсальный вектор с плазмидой pSBL-Ct-bor (фигура 5), в плазмиду встраивают кассету гена селектируемого маркера, содержащую хлоропластовый промотор 163 rRNA, ген aadA, кодирующий аминогликозид-3-аденилтрансферазу, придающую устойчивость к стрептомицину и спектиномицину, или ген устойчивости к гербицидам, и 3 нетранслируемую область гена хлоропласта psbA (фигура 6). Затем эту кассету гена селектируемого маркера встраивают в универсальную границу в двух разных направлениях. В векторе pSBL-CtV1 кассету с геном селектируемого маркера встраивают в ген trnI (фигура 6А). В векторе pSBL-CtV2 (фигура 7А) кассету с геном селектируемого маркера встраивают между генами trnI и trnA в спейсерной области в направлении транскрипции 16S рДНК. В векторе pSBL-CtV2 R (карта не показана) кассету гена селектируемого маркера встраивают между генами trnI и trnA в спейсерной области в направлении, противоположном транскрипции 16S рДНК.

В вектор pSBL-CtV2 - предпочтительный вариант универсального вектора - встроены некоторые интересные гены. Например, вектор pSBL-CtV3 (фигура 7Б) содержит репортерный ген mGFP, кодирующий белок зеленой флуоресценции, выделенный из медузы. Этот ген также может быть полезен для видимого отбора трансформированных растений или в декоративном садоводстве, например в декоративных культурах, подобных рождественским деревьям, или даже в газонных травах, которые могут давать зеленую флуоресценцию при освещении синим светом.

Вектор pSBL-CtVH (фигура 7В) содержит другой селектируемый маркер гидромицинфосфотрансферазу (ген hph, полученный с помощью хлоропластового промотора гена atpB), который придает устойчивость к антибиотику гидромицину. Этот вектор можно использовать для трансформации растений, которые устойчивы к другим антибиотикам, и особенно полезен для трансформации однодольных, которые, как правило, устойчивы к другим обычно применяемым антибиотикам. Этот ген может придать дополнительные признаки, такие как устойчивость к гербицидам - ненамеченный признак.

Вектор pSBL-CtVH (фигура 7) содержит гены GFP и hph, которые можно использовать для летального или комбинированного отбора - летального и по видимым признакам.

Хлоропластовый вектор, специфический для табака, и универсальный хлоропластовый вектор.

Хлоропластовый вектор для табака pZS-RD-EPSPS (фигура 2А) (TV) и универсальный вектор pSBL-RD-EPSPS (фигура 2Б) (UV) содержат, оба, промотор Prrn (из 16S rRNA), ген aadA (для отбора со спетиномицином), мутантный ген aroA, который кодирует фермент EPSPS-синтазу (для отбора с глифозатом) и область psbA 3. Фланкирующие последовательности в pZS-RD-EPSPS содержат rbcL и orf 512, а в pSBL-RD-EPSPS содержат гены trnI и trnA, облегчающие интеграцию или в большую область уникальной копии (фигура 1, стрелка TV), или в области инвертированных повторов (фигура 1, стрелки UV) хлоропластового генома табака соответственно.

Глифозат является активным ингредиентом в гербициде фирмы Monsanto ROUNDUP и используется в качестве селектируемого маркера для гербицидного отбора трансгенных растений.

Конструктирование хлоропластовых векторов.

Используют стандартные схемы конструктирования векторов, включающие дефосфорилирование достроенных фрагментом Кленова концов. Табачный хлоропластовый экспрессионный вектор pZS-RD-EPSPS показан на фигуре 2А. Универсальный хлоропластовый вектор показан на фигуре 2Б. Конструктирование этих векторов также показано в примерах. Обе плазмиды амплифицируют в штамме Е. coli XL1 Blue. Кривые роста регистрируют в минимальной среде М-9. Оба вектора используют для отбора на глифозате для придания устойчивости к ROUNDUP.

Хлоропластовый экспрессионный вектор pZS-RD-EPSPS специфичен для табака и, как отмечалось ранее, непригоден для трансформации других растений (Maier et al., 1995). В противоположность этому универсальный хлоропластовый экспрессионный и интеграционный вектор pSBL-RD-EPSPS (фигура 2Б) компетентен для трансформации хлоропластвых геномов многих других видов растений в силу универсальности вектора, как описано выше. Универсальный вектор интегрирует чужеродные гены в спейсерную область 16S-23S хлоропластового генома. В универсальном векторе в качестве фланкирующих последовательностей для гомологичной рекомбинации используются гены trnA и trnI (трансферные РНК хлоропластов, кодирующие аланин и изолейцин) из области инвертированного повтора хлоропластового генома. Хлоропластовая пограничная последовательность, используемая в данном изобретении, также содержит хлоропластовую точку начала репликации (oriA), что подтверждено для некоторых видов культурных растений, включая горох (Nielsen et al., 1993) и табак (Lu et al; 1996), что может объяснить гомологию высококонсервативных последовательностей в этой области. Эта точка начала репликации обеспечивает повышенное число плазмидных матриц для эффективной интеграции в хлоропластовый геном реципиента и достижение гомоплазмии.

Как показано выше, при конструктировании универсального вектора в подходящий сайт рестрикции во фрагмент ДНК, содержащий спейсерную область, встраивают экспрессионную кассету, содержащую хлоропластовый промотор, ген селектируемого маркера, придающий устойчивость к антибиотику (или другой селектируемый маркер), ген, кодирующий молекулу-мишень, и другие элементы (описанные здесь). При необходимости чужеродный ген, кодирующий молекулу-мишень, можно встроить в экспрессионную кассету после встраивания кассеты во фрагмент ДНК, содержащий консервативную спейсерную область, так что до встраивания кассета будет содержать много сайтов клонирования для встраивания одной или нескольких кодирующих последовательностей ДНК.

Расположение сайта рестрикции в спейсерной последовательности может определить соответствующую длину двух фланкирующих последовательностей, которые будут представлять собой части (или разной или одинаковой длины) спейсерной области. Таким образом, нет необходимости в идентичности двух фланкирующих последовательностей по длине, пока каждая из них содержит достаточно комплементарности к хлоропластовому геному-мишени для промотирования гомологичной рекомбинации.

Поскольку вектор изобретения имеет гомологию такой высокой степени к спейсерной области хлоропластовых геномов многих видов растений, он компетентен для трансформации не только вида растений, из которого получена пограничная последовательность вектора, но и для любого вида растений.

Используемый в данном описании термин гомологичная означает, что последовательность ДНК из одного вида растений обладает областями последовательности, идентичными частям последовательности ДНК из другого вида растений. Иными словами, если две последовательности ДНК являются высокогомологичными, образцы ДНК могут иметь 100% идентичность последовательностей или идентичность последовательностей менее 100%. Например, для целей интеграции в хлоропластовый геном последовательность в 400 п.о., которая имеет общую гомологию только 25%, но которая содержит часть в 100 п.о., гомологичную на 85-90% или более, считается высокогомологичной по отношению к хлоропластовому геному.

Также показано, что включение хлоропластовой ori во фланкирующие последовательности универсального вектора является благоприятным. Не вдаваясь в теорию, полагают, что присутствие ori в универсальном векторе промотирует гомоплазмию после одного цикла отбора без необходимости во второй стадии отбора. Это особенно важно при трансформации однодольных растений, таких как маис или рис, в которых стадия второго отбора неосуществима из-за трудностей выращивания этих растений при культивировании из листового черенка, в результате чего необходимо выращивать эти растения из зародышей. Если ori необходима, но утрачивается, ее можно ввести во фланкирующую последовательность или в какое-либо другое место. Если необходимо увеличить число копий вводимого универсального вектора, фрагмент ДНК хлоропласта, содержащий ori, следует встраивать вне фланкирующей последовательности, так что она будет функционировать только для амплификации числа копий универсального вектора и не станет интегрироваться в хлоропластовый геном.

В противоположность получению из определенного растения фланкирующие последовательности можно получить из спейсерной области, полученной синтетически, как показано ниже.

Для транскрипции и трансляции последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, используют, как правило, всю промоторную область из гена, способного к экспрессии в хлоропласте. Промоторная область может включать промоторы, которые можно получить из генов хлоропласта, таких как ген psbA из шпината или гороха, промоторную область rbcL и atpB из маиса и промоторы rRNA. Компетентные промоторы также описаны в патенте №5693507, где указываются также и другие литературные источники.

Фланкирующие последовательности, указанные в патенте №5693507 и других публикациях для промотирования устойчивой интеграции, не являются фланкирующими последовательностями универсального экспрессионного и интеграционного вектора, описанного здесь, и являются высококонсервативными в растениях от вида к виду, в то время как фланкирующие последовательности, описанные в указанном патенте и других публикациях, таковыми не являются.

Идентификация межгенных спейсерных последовательностей.

Изобретение относится к способам идентификации соответствующих нетранскрибируемых межгенных спейсерных последовательностей в растениях, которые подходят для создания универсальных векторов. Способ включает выделение пластидной геномной ДНК, осуществление гибридизации с меченным радиоактивным изотопом зондом известного спейсера, обнаружение и выделение пластидных последовательностей, проявляющих нужную степень гомологии с зондом. В порядке примера, для того чтобы определить, обладает ли пластидный геном неизвестного строения и последовательности спейсерной областью, осуществляют Саузерн-блоттинг с использованием в качестве зонда спейсерной области табака. Пластидную геномную ДНК выделяют и расщепляют подходящей рестриктазой в соответствии с установленными процедурами. Проводят гибридизацию со спейсерным зондом как в строгих условиях (например, 50% формамида при 68С, промывка в 0,1SSC при 68С), так и в нестрогих условиях (например, 6SSC, при 68С, промывка в 2SSC при 50С) (1SSC представляет собой раствор 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата натрия), и обнаруживают последовательности пластиды, проявляющие приблизительно 90-100%-ную гомологию или 60-100%-ную гомологию со спейсером табака соответственно. Затем идентифицированные пластидные последовательности выделяют. Если требования к гомологичной рекомбинации менее строгие, можно удовлетвориться невысокой степенью гибридизации с зондом, такой как примерно 60%.

Таким образом, любая известная или неизвестная спейсерная область с достаточной гомологией для рекомбинации подходят для создания UV. Подобным образом известную последовательность любой межгенной высококонсервативной спейсерной последовательности можно использовать для идентификации выделенных пластидных последовательностей, которые гомологичны с известной спейсерной последовательностью.

С другой стороны, описанную выше программу BLAST можно использовать для идентификации высококонсервативных областей в пластидных геномах, последовательности которых известны.

Растения, которые можно трансформировать.

К растениям, которые можно трансформировать с помощью универсального вектора изобретения, относятся любые низшие растения, такие как цианобактерии, и любые высшие растения, такие как однодольные и двудольные виды растений. Трансформируемые растения могут быть растениями, растущими при солнечном освещении, или растениями, растущими под землей. Не являющийся ограничительным перечень примеров высших растений, которые можно трансформировать с помощью универсального вектора, включает хлебные злаки, такие как ячмень, кукуруза, овес, рис и пшеница, дыни, такие как огурец, дыня сетчатая и арбуз; бобовые, такие как фасоль, вигна китайская, горох, арахис; масличные культуры, такие как canola и соя; пасленовые растения, такие как табак, клубнеплодные культуры, такие как картофель и сладкий картофель; овощные культуры, такие как томат, перец и редька; плодово-ягодные культуры, такие как груша, виноград, персик, слива, банан, яблоко и земляника; волокнистые культуры, подобные роду Gossypium, такие как хлопчатник, лен и конопля; и другие растения, такие как свекла, хлопчатник, кофе, редька, промышленные цветущие растения, такие как гвоздика и розы; злаковые, такие как сахарный тростник или газонная трава; вечнозеленые деревья, такие как пихта, ель и сосна, и листопадные деревья, такие как клен и дуб. Наибольший интерес представляют главные экономически важные культуры, подобные маису, рису, сое, пшенице и хлопчатнику. Насколько известно авторам изобретения, ни одно из этих растений, кроме табака, никогда не подвергалось устойчивой трансформации с помощью хлоропластового генома и ни одно, в том числе и табак, не подвергалось устойчивой трансформации с помощью универсального вектора, описанного здесь. Растение, из которого обычно получают последовательность ДНК, представляет собой табак, поскольку он является наиболее полно охарактеризованным растением, но подходит хлоропластовый геном любого другого растения.

Следует напомнить, как описано выше, что вектор, применяемый для устойчивой трансформации табака, некомпетентен для трансформации хлоропластового генома других растений.

Способ трансформации. Экспрессионные кассеты можно трансформировать в представляющую интерес растительную клетку любым хорошо известным способом. К таким способам относятся, например, следующие способы: трансформация посредством бомбардировки частицами вольфрама, трансформация при посредничестве полиэтиленгликоля, применение лазерного луча, электропорация, микроинъекция, или любой другой способ, позволяющий ввести ДНК в хлоропласт. См., например, Sanford, 1988; Daniell, 1993; Daniell, 1997; патент США №5693507; Kin Ying et al., 1996. Использование этих методов допускает применение описанного здесь изобретения к самым разным как однодольным, так и двудольным растениям.

Экспрессия нерастительных молекул в трансформированных растениях

Повышенная полезность универсального экспрессионного интеграционного вектора изобретения четко демонстрируется компетентностью вектора для получения трансформированных растений для экспрессии нерастительных и ценных молекул.

Полимеры на основе белков, разрушающиеся под действием микроорганизмов.

В соответствии с другим вариантом воплощения изобретения универсальный вектор применяют для трансформации табака синтетическим геном, экспрессирующим полимеры на основе белков (РВР). Такие полимеры и экспрессирующие их гены известны из литературы (Daniell, et al., 1997). Особенно интересны полимеры на основе белков (РВР), содержащие пентамерные последовательности, подобные GVGVP (Yen et al., 1987). Такие полимеры ВРВ проявляют полезные свойства обратного фазового температурного перехода. Белок становится нерастворимым, когда температура поднимается выше температуры перехода. РВР представляют собой широкий ряд материалов, подобных нефтеполимерам, такие как гидрогели, эластомеры и пластики. Они также демонстрируют заметную биосовместимость, причем это делает их пригодными для целого ряда применений в медицине, в том числе для предотвращения образования послеоперационных спаек, реконструкции тканей и планируемой доставки лекарственных средств (Urry et al., 1993). Кроме медицины возможные применения включают использование в преобразователях, молекулярных устройствах, суперабсорбентах и пластиках, разлагаемых микроорганизмами (Daniell et al., 1997). К таким полимерам относится полимер (Val1-Pro2-Gly3-Val4-Gly5)n (VPGVP)n, где n может изменяться от 1 до сотен единиц, например 250, или его аналоги. Важные промышленные возможности и родственные аспекты рассматриваются Daniell, 1995. Из РВР получают полезные пластики, разлагаемые микроорганизмами. Гены, экспрессирующие такие РВР, также полезны в изобретении в том отношении, что их можно использовать в качестве носителей, т.е. ген нужной молекулы можно гибридизировать с геном РВР интеграции и экспрессии хлоропласта.

В предшествующих исследованиях ген синтетического полимера, кодирующий (GVGVP)121, был гиперпродуцирован в E.coli до такой степени, что полимерные тельца включения занимали почти 80-90% объема клетки (Guda et al., 1995; Daniell et al., 1997). Тот же ген также экспрессирован в ядерном компартменте культивированных клеток табака (Zhang et al., 1995) и в листьях трансгенных растений табака (Zhang et al., 1996).

На модели межгенную область генов trnI и trnA в спейсерной области 16S-23S rRNA генома табака (фигура 1) используют для создания универсального вектора для интеграции гена селектируемого маркера, гена aadA и гена синтетического полимера (EG121). Вектор встраивают в область инвертированного повтора хлоропластового генома. Трансформированные растения табака экспрессируют белок в большом количестве. Хлоропластовые геномы других видов растений также можно трансформировать синтетическим геном для экспрессии полимера на основе белка с использованием универсального вектора.

Получение высокоценных молекул. Исследования с биополимерами показали, что нерастительный продукт можно экспрессировать с помощью синтетического гена, причем появляется возможность с помощью векторов изобретения синтезировать биологически ценные молекулы в трансформированных растениях с самыми разными кодирующими последовательностями ДНК. Кодирующая последовательность ДНК будет содержаться в универсальном векторе или, если требуется, в экспрессионной кассете, как описано выше.

Известно, что трансгенные растения продуцируют биологически активные молекулы путем ядерной трансформации, а не хлоропластовой трансформации. См. перечисленные далее ссылки, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. Daniell, 1995; Miele, 1997; Lyons, 1996; Daniell and Guda, 1997; Arntzen, 1997.

Экспрессия биологически активных молекул.

Растения, трансформированные в соответствии с изобретением универсальным вектором или экспрессионной кассетой, можно получить для экспрессии ценных биологически активных молекул в содержащих хлоропласт частях растения. Затем растения собирают известными в практике способами. Трансформированные растения, содержащие указанные продукты, можно, таким образом, вводить перорально. Arntzen, 1997. Получение фармацевтических средств с помощью трансгенных растений осуществлено с пептидами (белками) для многих фармацевтических применений, включая вакцины, иммуномодуляторы, факторы роста, гормоны, белки крови, ингибиторы и ферменты. Типичными биопрепаратами, полученными из трансгенных растений, о которых сообщается в литературе, являются вакцины против вирусных заболеваний; вирусные пептидные эпитопы, подобные вирусу иммунодефицита человека, невирусные пептидные эпитопы, бактериальные антигенные белки; биоактивные пептиды, рекомбинантные токсины, plantibodies (рекомбинантные антитела), сывороточные белки и вторичные растительные метаболиты. Все эти продукты можно экспрессировать в хлоропластах трансгенных растений в соответствии с изобретением.

Типичными фармацевтическими пептидами или белками, продуцируемыми в трансгенных растениях, являются поверхностный антиген гепатита В, капсидный белок вируса norwalk, вирус ящура, риновирус 14 человека, вирус иммунодефицита человека, поверхностный белок S. mutans, энтеротоксин Е. coli, субъединица В, эпитопы малярийных круглых спорозоитов, эпитоп мышиного белка ZP3 (вакцина); мышиное каталитическое антитело 6D4, мышиный mAB Guys 13, mАВ В1-8, антифитохромный Fv-белок, антитело Р (антитело); сывороточный альбумин человека (HSA), белок С человека (сывороточный белок); -трихозантин, рицин (цитотоксин); эпидермальный фактор роста человека (фактор роста); лейэнкефалин (нейропептид) и кислая -глюкозидаза человека (hGC) (фермент). Многие из этих молекул экспрессированы в табаке, клубнях картофеля и т.п.

Особый интерес в соответствии с изобретением вызывает получение инсулина и сывороточного альбумина человека (HSA) с помощью универсального интеграционного и экспрессионного вектора или экспрессионного вектора. HSA уже получен в трансгенных (ядерных) растениях картофеля и табака (Sijmons et al., 1990). Указанные выше продукты можно получить через трансформацию хлоропластов в соответствии с изобретением.

Инсулин.

Изобретение относится к способу экспрессии инсулина в трансформированном растении в виде белка, слитого с полимером. Растение можно трансформировать экспрессионной кассетой или универсальным интеграционным и экспрессионным вектором, содержащими ген синтетического биополимера, подобного (GVGVP)40. Подходящим растением является табак из-за простоты обработки методами генной инженерии и необходимости поиска альтернативного применения этой спорной культуры.

В случае экспрессии в бактериях способ включает создание вектора для экспрессии в Е. coli в виде гена полимера (GVGVP)40, слитого с геном проинсулина, экспрессию слитых белков полимер-инсулин в Е. coli (выращенной известным способом), очистку рекомбинантного белка с использованием свойств температурного перехода полимера на основе белка и отщепление инсулина от полимера с использованием хорошо известных способов.

Для трансформации растения в растение-мишень, подобное табаку, вводят экспрессионную кассету или универсальный интеграционный и экспрессионный вектор, содержащие ген полимера, слитый с геном проинсулина. Слитый белок полимер-инсулин экспрессируется в растении, белок, слитый с полимером, экстрагируют из хлоропласта и цитозольных компартментов растительных клеток, инсулин отщепляют от полимера-белка с помощью дитреитола (DTT) или другими известными способами и собирают инсулин. С другой стороны, продукт слияния инсулина и полимера можно экспрессировать в пищевой культуре или в съедобных частях культурного растения.

Метод слияния последовательности ДНК, кодирующей молекулу с биологической активностью, с синтетическим геном, экспрессирующим полимер на основе белка, для экспрессии в подходящем хозяине-бактерии, или дрожжах, или в трансформированном растении является весьма перспективным способом широкого применения.

Рекомбинантный сывороточный альбумин человека в растениях. Рекомбинантный сывороточный альбумин человека (rHSA), не отличимый от аутеничного белка человека, получен в ядерных трансгенных растениях табака и картофеля (Sijmons et al., 1990). Это событие показало экспрессию ценного белка в трансгенных растениях, но также и то, что можно добиться соответствующей обработки посредством слияния HSA с пропоследовательностью растения, что проявилось в отщеплении и секреции нужного белка. Хлоропластовый геном выбранного растения, подобного табаку, можно легко трансформировать универсальным вектором, описанным здесь, и вызвать экспрессию HSA.

Общая применимость.

Как описано здесь, универсальный вектор допускает в соответствии с изобретением трансформацию растений, побуждает растение экспрессировать биологическую молекулу, которая может придать нужный фенотип растению, и/или продуцировать нужный продукт, который может, но необязательно, обладать биологической активностью (или предшественника конечного продукта). Кодирующая нуклеотидная последовательность может быть синтетической или природной. Продуцируемая молекула может быть чужеродной для растений, не функционирующей в растении или функционирующей. Универсальный вектор имеет широкий спектр применения в области трансформации растений.

Предполагается, что любую биологически активную молекулу (ее предшественника или производное) можно получить с помощью трансгенного растения, трансформированного универсальным вектором изобретения, с соответствующей адаптацией, которая может потребоваться в конкретном случае.

Толерантность к гербицидам трансформированных в хлоропластах растений

Другой вариант воплощения изобретения относится к применению универсального вектора для придания растениям устойчивости или толерантности к гербицидам. Прогресс технологии переноса генов сделал возможным введение в растения гена устойчивости к гербицидам, причем посредством этого достигается гербицидная селективность для определенной культуры.

Модификации фермента-мишени. Первой стадией при таком подходе является идентификация и необходимая модификация фермента-мишени (гена) гербицида для придания толерантности, которую осуществляют достаточно экстенсивно. Сульфометурон-метил является гербицидом класса сульфонилмочевин, который блокирует рост бактерий, дрожжей и высших растений посредством ингибирования первого фермента разветвленного каскада реакций аминокислот ацетолактатсинтазы (ALS). Мутантные гены для ALS, придающие устойчивость к сульфометурон-метилу, выделяют из Е. coli и дрожжей (Yadav, et al., 1986). Устойчивость к гербициду табака и некоторых других культур достигнута методами генной инженерии с геном ALS (Gabard, et al., 1989; Miki, et al., 1990). Еще одним подходом для создания устойчивости к гербицидам у растений является экспрессия фермента фосфинотрицин-ацетилтрансферазы (PAT), которая детоксифицирует гербицид фосфинотрицин (DeBlock, et al., 1987).

Глифозат.

Глифозат является сильным гербицидом широкого спектра действия, весьма эффективным против однолетних и многолетних злаковых и широколистных сорняков. Глифозат безопасен для окружающей среды, так как он быстро разлагается в почве, имеет минимальную подвижность в почве и имеет очень низкую токсичность по отношению к нерастительным формам жизни. Глифозат действует путем связывания и ингибирования фермента 5-енол-пирувилшикимат-3-фосфат(EPSP)-синтазы. EPSP-синтаза (EPSPS) катализирует образование EPSP, которая важна на пути биосинтеза ароматических аминокислот из шикимат-3-фосфата и неорганического фосфата. Глифозат нетоксичен для животных благодаря тому факту, что эта реакция происходит только в растениях и микроорганизмах. К несчастью, поскольку реакция образования EPSP происходит во всех растениях, глифозат не делает выбора между сорняками и полезными растениями, такими как сельскохозяйственные и декоративные культуры.

Можно использовать два подхода при попытке разработать методами генной инженерии растение, устойчивое к глифозату. Один из подходов основан на перепроизводстве ESPS-синтазы дикого типа, так что после конкурирующего ингибирования ESPS-синтазы глифозатом оставшаяся ESPS-синтаза придает устойчивость к глифозату. Другой подход основан на экспрессии мутантного гена (aroA), кодирующего устойчивую к глифозату ESPS-синтазу.

Во всех без исключения вышеуказанных примерах гены устойчивости к гербицидам вводили в ядерный геном.

Потребность в трансформации хлоропластов.

Существует серьезная необходимость разработать устойчивое к гербицидам растение, в особенности растение, устойчивое к большинству широко используемых гербицидов, в котором белок, придающий устойчивость к гербицидам, продуцируется в хлоропласте, из которого ген, придающий устойчивость к гербицидам, не может уходить с пыльцой в окружающую среду.

Универсальный вектор изобретения отвечает этой потребности посредством трансформации любого растения-мишени с приданием ему устойчивости к любому выбранному гербициду, подобному глифозату. Важные для хозяйства культуры, подобные пшенице, рису, кукурузе (маису), сое, можно сделать устойчивыми к выбранному гербициду с помощью универсального вектора.

Изобретение относится к трансгенному устойчивому к гербицидам растению, в котором чужеродный трансген, придающий устойчивость к одному или нескольким гербицидам, интегрирован в хлоропластовый геном с помощью универсального вектора. Трансгенное растение может представлять собой зрелое растение, незрелое растение, такое как проросток, зародыш, каллюс, культивированную ткань или клеточную суспензию, или часть растения, такую как черенок или каллюс. Гербициды, подходящие для изобретения, в случае которых гены, придающие устойчивость, можно устойчиво интегрировать в хлоролластовый геном в соответствии с изобретением, включают все известные (а также разрабатываемые) гербициды.

Класс гербицидов.

Гербициды, которые поддаются воздействию способа изобретения, вообще, делятся на несколько химических классов.

К первому классу относятся гербициды PSII (фотосистема II), которые препятствуют восстановлению пластохинона на акцепторном центре PSII, к нему относятся такие химикаты, как триазины, триазиноны, производные мочевины, карбаматы (biscarmates), нитрилы, нитрофенолы, замещенные пиридазиноны, фенилкарбаматы, анилиды, цианоакрилат, DCMU, карбоанилиды, урацилы, конкретно, например, дихлорфенилдиметилмочевина, атразин, метрибузин, ленацил, фенмедифам, иоксинил и диносеб. Эти химикаты связываются с белком связывания в 32 кД (белок QB, D1, гербицид связывающий белок) в тилакоидной мембране хлоропластов, причем посредством этого блокируют перенос электронов при фотосинтезе. Пластидный ген, кодирующий предшественника белка Qb, называется psbA, и его последовательности обнаруживают весьма высокую степень гомологии в различных растениях. Наиболее важным гербицидом класса PSII является атразин, разработанный Ciba-Gergy.

Другим классом являются гербициды PSI (фотосистемы I), мембраносвязанный белковый комплекс которых катализирует управляемое светом окисление пластоцианина (PC) и восстановление ферродоксина (Fd). Типичными такими химикатами являются бипиридильные гербициды паракват и дикват.

Еще одним классом гербицидов являются арилоксифеноксипропаноаты (АРР) или гербициды типа ацетил-коэнзим А-карбоксилазы, которая ингибирует ацетил-СоА-карбоксилазу и последующий биосинтез жирных кислот в пластидах. Типичными АРР являются цидогександион (CHD), сетоксидин, галоксифол, хизалофоп, феноксапроп (и его молекулы, замещенные низшим алкилом), диколофоп, сетоксидин, клетодин и тралкоксидим.

Еще одним классом гербицидов являются аналоги ауксина, подобные макропопу, хлорамбену, дикамба, беназолину, 1-нафтилуксусной кислоте; 3,6-дихлорпиколиновая кислота, пиклорам, флуороксипир, хинклорак, МСРА и 2,4-D.

Еще одним классом являются митототические гербициды, называемые динитроанилиновыми гербицидами, подобные трифлуралину, оризалину и пендиметалину.

Другим химическим классом гербицидов, к которому применимо изобретение, являются гербициды, действующие при биосинтезе аминокислот, такие как третичноаминометилфосфоновые кислоты хлорсульфурон, глуфозин и глифозат.

Другим классом гербицидов являются гербициды, ингибирующие ацетолактатсинтазу (ALS), подобные сульфонилмочевинам, имидазолинонам, триазолопиримидинам и пиримидинилтиобензоатам, такие как хлорсульфурон, имазафир, флуметцулам (и другие, перечисленные в главе 4, табл.1, в книге Herbicide Resistance in Plants, 1994, цитированной ниже).

Примерами гербицидов-сульфонилмочевин являются сульфометурон-метил (активный ингредиент Oust) и хлорсульфурон (активный ингредиент Glean). Один из имидазолинонов имазапир является активным ингредиентом гербицида Арсенал компании American Cyan-amid, a имазаметабенз представляет собой смесь двух имидазолинонов (Merk Index, 11th Ed. 4825). Мутированные формы ALS, локализованной в структурных генах ALS ilvG и ILV2, можно использовать для придания устойчивости к гербицидам с использованием универсального вектора.

Несмотря на химические различия между имидазолинонами и сульфонилмочевинами, эти вещества ингибируют один и тот же фермент ALS. Оказывается, что хиноны и имидазолиноновый гербицид конкурируют с сульфонилмочевинным гербицидом за общий центр на ALS. Соответственно согласно изобретению растения можно трансформировать таким образом, что они будут обладать устойчивостью к обеим группам тех и других гербицидов.

Типичным представителем другой группы химикатов, поддающихся контролю с помощью изобретения с использованием универсального вектора и обладающих гербицидной активностью, является L-фосфино-трицин, который является компонентом трипептида биалафоса. Этот трипептид продается под торговым названием Гербиас компанией Meiji Seika, Япония, и как Баста Hoechst AG, Германия. L-Фос-финотрицин является сильным ингибитором глутаминсинтетазы, вызывающим быстрое возрастание концентрации аммиака в растениях, и ведет к гибели растительной клетки.

Несмотря на широкие исследования, удовлетворительный продукт для придания растениям толерантности к гербицидам посредством трансформации хлоропластов, не разработан. В случае с гербицидом типа глифозата сообщается, что регенерированные трансформированные в ядрах трансгенные растения демонстрируют толерантность к глифозату, но также демонстрируют ухудшение роста и не приводят к трансгенным растениям с высоким уровнем толерантности к глифозату (Shultz, et al., 1990).

Хлоропластовые трансформанты.

В соответствии с изобретением, хлоропласт растений-мишеней, чувствительных к гербицидам, трансформируют вектором изобретения, несущим необходимую кодирующую последовательность, причем посредством этого придается устойчивость к гербицидам. Трансформированный хлоропласт содержит геном, несущий чужеродный трансген, придающий устойчивость к гербицидам. Хлоропласт может представлять собой зрелый хлоропласт или может являться незрелым хлоропластом, таким как этиопласт. Предпочтительно ген, придающий устойчивость к гербицидам, кодирует EPSP-синтазу, которая связывается менее охотно (имеет пониженную аффинность) с глифозатом, чем EPSP-синтаза дикого типа. Если присутствует другой трансген, это, как правило, ген, придающий растению устойчивость к антибиотикам. Таким образом, устойчивость к гербицидам можно использовать в качестве маркера для летального отбора в случае трансформации хлоропластов посредством отбора трансформантов при воздействии среды с летальной концентрацией выбранного гербицида, в которой трансформанты будут выживать.

Источник второго гена может быть прокариотным (например, бактериальным) или эукариотным (например, растением).

Изобретение также относится к получению растения, устойчивого к нескольким гербицидам, являются ли они гербицидами одного и того же класса или гербицидами разных классов, и трансформированного растения, устойчивого ко многим гербицидам.

Известно, что некоторые виды растений выработали естественную и временную толерантность к некоторым типам гербицидов. Положения данного изобретения легко применимы и к ним.

Изобретение относится к способу получения устойчивого к гербицидам растения, включающему трансформацию хлоропласта растения посредством введения одного или нескольких чужеродных трансгенов, кодирующих белок, придающий устойчивость к гербицидам, в геном хлоропласта растения. Предпочтительно трансген кодирует мутантную форму фермента, обладающего пониженной по сравнению с встречающимся в природе ферментом аффинностью к данному гербициду.

В приведенной далее таблице I перечисляются разные типы детерминанты устойчивости (химические вещества или молекулы), ингибирующие или придающие устойчивость, и типичные гербициды, соответствующие им.

Всесторонней обзор, касающийся устойчивости растений к гербицидам, см. в книгах Herbicide Resistance Crops, Agricultural, Environmental, Economic, Regulatory and Technical Aspects, 1996, CRC Press, Inc., Editor, Stephen O. Duke, и Herbicide Resistance in Plants, Biology and Biochemistry, 1994, CRC, Press, Edited by Stephen B. Powels and Joseph A.M. Hoi turn. В первой из этих указанных книг особый интерес вызывает глава 3, посвященная методам получения устойчивых культур (и многочисленные цитированные в ней ссылки), как предпосылка создания изобретения. Обе книги включены в настоящее описание в качестве ссылок.

В соответствии с изобретением также обнаружено, что в процессе экспрессии намеченного признака трансформированным растением может быть экспрессирован другой признак, который может являться очень нужным, даже может оказаться более нужным, чем первоначально намеченный признак. В такой ситуации в растениях можно допускать экспрессию и производить отбор на основании этого другого признака.

В дальнейшем изобретение описывается с помощью примеров, не являющихся ограничительными.

Пример 1

Универсальные хлоропластовые интеграционные и экспрессионные векторы

Табак. Являющиеся примерами универсальные хлоропластовые векторы создают посредством вырезания сначала фрагмента ДНК хлоропласта табака BamHI (130656-140992), содержащего гены rRNA 16S и 23S, и субклонирования его в обычную доступную бактериальную плазмиду pUC19. Карта хлоропластового генома табака приводится на фигуре 1. Находящийся в этом фрагменте фрагмент HindIII-EcoRI в 2,1 кб, содержащий универсальную пограничную последовательность, содержащую гены trnI и trnA (фигура 5А), в том числе спейсерную область между этими генами, субклонируют в плазмиду pUC19 в сайте PvuII (фигура 5Б). Полученную плазмиду обозначают pSBL-Ct Bor (фигура 5В).

Вектор pSBL-RD-EPSPS (фигура 2Б) содержит мутантный ген EPSP-синтазы, кодирующий фермент EPSP-синтазу. Глифозат активный ингредиент гербицида ROUNDUP, Monsanto, связывается с белком EPSP-синтазой и блокирует синтез незаменимых аминокислот, что приводит к гибели растения. EPSP-синтаза, кодированная мутантным геном, не связывает глифозат и, таким образом, придает культурным растениям устойчивость к гербициду.

Другие гены, такие как гены, придающие устойчивость к вредным факторам окружающей среды, такую как соле- и засухоустойчивость (гены осмотолерантности, такие как бетаинальдегид-дегидрогеназа (BADH), для избыточного продуцирования глицинбетаина), или термотолерантность (гены, кодирующие белки теплового шока), или белки устойчивости к холодовому шоку или устойчивости к патогенам, такие как антимикробные (литические пептиды, хитиназа) или противовирусные (белки оболочки), можно ввести по отдельности или в неконфликтных сочетаниях в универсальный вектор для хлоропластов или в различные кассеты одного и того же универсального вектора для хлоропластов, для трансформации растения-мишени в растение с нужным признаком.

Конструктирование универсального хлоропластового интеграционного вектора, содержащего синтетическую область спейсер 2

Универсальный вектор для хлоропластов, содержащий только область спейсер 2 хлоропластового генома табака, конструктируют посредством сначала субклонирования синтетического олигонуклеотида, содержащего область спейсер 2, в бактериальную плазмиду pUC19. Синтезируют плюс и минус цепи спейсерной последовательности в 64 пар оснований, где последовательность плюс цепи выглядит следующим образом:

5-GCTGCGCCAGGGAAAAGAATAGAAGAAGCATCTGACTACTTCATGCATGCTCCACTTGGCTCGG-3.

Синтетические фрагменты смешивают и отжигают, а затем лигируют в pUC19 в сайте PvuII (фигура 5Б). Встраивание соответствующего гена селектируемого маркера и гомологичного гена осуществляют так, как описано выше для pSBL-CtBor (фигура 5В).

Для того чтобы получить более длинную последовательность, включающую гены tRNAIle и tRNAAla, используют ту же методологию.

Трансформация различных растений

Пример 2

Трансформация хлоропластов табака.

В этом примере описывается классическая схема трансформации хлоропласта табака, для которой можно использовать любой вектор. Два таких вектора идентифицированы ниже. Все новые векторы для хлоропластов сначала проверяют на табаке, как описано в Daniell (1997). Растения табака (Nicotiana tabacum, сорт Petit Havana) выращивают асептически посредством проращивания семян на среде MSO, содержащей соли MS (4,3 г/л), смесь с витамином В5 (миоинозит, 100 мг/л; тиамин-НСl, 10 мг/л; никотиновая кислота, 1 мг/л; пиридоксин-HCl, 1 мг/л), сахарозу (30 г/л) и фитагар (6 г/л), при рН 5,8. Для бомбардировки отбирают полностью распустившиеся листья растений в возрасте примерно двух месяцев.

Листья для бомбардировки помещают абаксиальной стороной на фильтровальную бумагу Whatman №1, лежащую на среде RMOP* в стандартных чашках Петри (10015 мм). На микрочастицы вольфрама (1 мкм) или золота (0,6 мкм) наносят нужную плазмидную ДНК (например, pSBL-RD-EPSPS или pZS-RD-EPSPS), и осуществляют бомбардировку с помощью biolistic устройства PDS1000/He (Bio-Rad), как описано в Daniell, 1997. После бомбардировки чашки Петри заклеивают парафильмом и инкубируют при 24С при 12-часовом световом периоде. Через двое суток после бомбардировки листья разрезают на небольшие кусочки размером примерно 5 мм2 и помещают на среду для летального отбора (RМОР, содержащая селектируемый маркер, такой как примерно 500 мкг/мл дигидрохлорида спетиномицина), в глубокие (10025 мм) чашки Петри (примерно 10 кусочков на чашку) таким образом, что абаксиальная сторона прикасается к среде. Отделенные от погибших побегов регенерированные устойчивые к спектиномицину побеги разрезают на небольшие кусочки (примерно 2 мм2) и субклонируют в чистые глубокие чашки Петри (примерно 5 кусочков на чашку), содержащие ту же среду для летального отбора. Устойчивые побеги второго цикла культивирования переносят в среду для роста (среда MSO с добавлением IBA, 1 мкг/л, и соответствующего антибиотика, например 500 мкг/мл дигидрохлорида спектиномицина). Пустившие корни растения переносят в почву и выращивают при 26С в условиях непрерывного освещения для последующего анализа.

После переноса в среду для летального отбора эксплантаты постепенно бледнеют, а примерно через 3-8 недель из подвергшейся бомбардировке стороны 0 листа развиваются зеленые каллюсы и побеги. Устойчивые побеги из каждого каллюса рассматривают как клон.

Скрининг методом PCR хлоропластовых трансформантов после первого цикла культивирования показал, что в 12 из 20 устойчивых клонов чужеродные гены, подобные гену aadA, связанные с геном EG121, интегрированы в хлоропластовый геном. Эти 12 клонов передают на следующие стадии регенерации. Весь процесс регенерации, начиная от бомбардировки и до переноса в почву, занимает примерно 3-5 месяцев.

Фигура 9 показывает трансформированные и нетрансформированные пластиды табака, растущие в присутствии спектиномицина, что указывает на нелетальный отбор на данной среде (500 мкг/мл).

Пример 3

Трансформация хлоропластов кукурузы.

Поверхностная стерилизация и проращивание семян кукурузы. Семена кукурузы подвергают поверхностной стерилизации в растворе, содержащем 20% (о/о) промышленного отбеливателя и 0,5% SDS, в течение 15 мин в условиях встряхивания, затем последовательно четыре-пять раз промывают в стерильной дважды дистиллированной воде (sddw). Жидкую среду для проращивания (модифицированная CGS), содержащую соли MS (4,3 г/л), сахарозу (30 г/л), DM-витамины (1,0 г/л тиамина-НСl, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина-НСl и 100 мг/л миоинозита) и ВА (2,0 мг/л) при рН 5,8 распределяют в камере Magenta (45 мл), содержащей восемь слоев суровой марли, и затем автоклавируют. В модифицированную среду CGS помещают семена (25 семян любого генотипа на камеру) и культивируют в течение трех суток (16 ч непрерывного освещения; 25С) для проращивания. Из трехдневных растений асептически иссекают узловые срезы. Узловое сечение выглядит как четкое разграничение на развивающемся проростке и представляет седьмой узел (фигура 10А). Иссеченные узловые срезы имеют в длину приблизительно 1,2-1,5 мм (фигура 10Б).

Фигуры 10А-Ж показывают трансформацию пластиды кукурузы и схему регенерации. А) Трехдневный проросток кукурузы; стрелки и линия показывают седьмой узел для иссечения эксплантата; Б) узловые поперечные срезы до бомбардировки; стрелки показывают край одного среза; В) GUS-положительный узловой срез (трансформация ядра); гистохимический анализ проведен через три дня после бомбардировки; Г) индукция многочисленных побегов из одного узлового среза (контроль) после восьми недель культивирования; Д) контрольный побег на среде для элонгации через три недели; Е) укоренившийся контрольный проросток; Ж) отбор кукурузы, трансформированной в пластидах, в жидкой среде, содержащей спектиномицин и стрептомицин, в течение восьми недель.

Индукция многочисленных побегов. Эксплантаты узловых срезов помещают на среду для индукции побегов кукурузы (CSI; соли MS, сахароза и DM-витамины, как указано выше, ВА (2,0 мг/л), СРА (0,25 мг/л) и фитагар (8 г/л) при рН 5,8) акропетальным концом вверх и помещают в условия для культивирования, указанные ранее. Во всех средах за исключением модифицированной CSG и RG1 (рис), PGR и антибиотики стерилизуют фильтрацией и добавляют после автоклавирования. Ткани субкультивируют каждые две недели на свежую среду CSI для образования многочисленных побегов (фигура 10Е). Придаточные побеги отделяют от группы побегов через восемь недель культивирования и проводят элонгацию на полутвердой среде на основе MS, содержащей сахарозу, DM-витамины, глицин (10 мг/л) и аспарагин (150 мг/л), при рН 5,8 в течение трех недель (фигура 10Д). Ростки пускают корни (фигура 10Е) на той же среде, содержащей IBA (0,5 мг/л). Ростки с корнями для достижения более быстрого роста можно выращивать на жидкой среде MS без PGR в пробирках (15025 мм), содержащих суровую марлю в качестве удерживающего материала. Регенерированные ростки пересаживают в среду для выращивания в горшках, дают акклиматизироваться и затем выращивают до зрелого состояния в теплице.

Фигура 11 показывает пластидную трансформацию кукурузы. Трансформированные растения кукурузы растут нормально (средний побег), в то время как нетрансформированные растения погибают на летальной среде, что подтверждает летальный отбор с помощью антибиотика спектиномицина (1000 мг/мл).

Пример 4

Трансформация хлоропластов риса.

Поверхностная стерилизация семян риса и предварительное культивирование. Вылущенные семена любого генотипа (индийских или японских сортов) подвергают поверхностной стерилизации сначала в 70% этаноле в течение 10 мин в условиях непрерывного встряхивания, затем промывают ddw примерно пять раз. Затем семена погружают в 0,2% (м/о) раствор бенлата на 20 мин, промывают sddw пять раз, затем погружают в 50% отбеливатель на 20 мин, и повторно промывают sddw. Семена предварительно культивируют в среде RG1 (соли MS, сахароза и DM-витамины, как указано выше, ВА (0,2 мг/л) при рН 5,8). Как и в случае кукурузы, жидкую RG1 перед автоклавированием распределяют в камерах Magenta, содержащих суровую марлю. Семена помещают в RG1 (100 семян любого генотипа на камеру) и предварительно культивируют в течение ночи (16-часовое или непрерывное освещение; 23С) перед бомбардировкой на следующий день.

Бомбардировка зародышей на интактных семенах риса.

Предварительно культивированные семена плотно укладывают вертикально зародышевым концом вверх (фигура 12А) в центральную часть диаметром 2,5 см чашки Петри (25 на чашку), содержащей среду Rg1.1 (RG1 с добавлением 8,0 г/л фитагара), и бомбардируют покрытыми ДНК микрочастицами.

Осаждение ДНК.

Методика такая же, какая описана для кукурузы, со следующими изменениями. Используют 10 мкл ДНК (1,0 мкг/мл) и 20 мкл изопропанола (2Х объема ДНК), 60 мкл 2,5 М раствора CaCl2 и 15 мкл 0,1 М раствора спермидина. Каждая доза доставляет 2,0 мкг ДНК и 720 мкг вольфрама.

Фигуры 12 А-Е показывают пластидную трансформацию риса и схему регенерации. А) Семена риса, зародышевым концом вверх, непосредственно перед бомбардировкой; стрелки показывают края зародыша; Б) индукция многочисленных побегов из одного контрольного зародыша после семи недель культивирования; В) отбор побегов риса, трансформированного в пластидах, появляющихся из одного начального зародыша риса, в среде, содержащей спектиномицин и стрептомицин, после восьми недель на селективной среде; стрелки указывают на два предполагаемых трансформанта; Г) контрольные восстановленные растения риса; Д) трансгенные Priscilla 2.3; Е) трансгенные Priscilla 2.4.

Индукция многочисленных побегов и отбор пластидных трансформантов после бомбардировки. Семена риса отделяют и высевают на среду RG1.1 (сохраняющую полярность) и после бомбардировки помещают в темноту на двое суток. Затем зародышевый конец семени отсекают (зародыш вместе с небольшим количеством эндосперма) от остальной части эндосперма, которую отбрасывают. Зародыши помещают в 50 мл жидкой среды RG2 (в 250-мл колбу) для индукции многочисленных побегов (фигура 12Б). RG2 содержит соли MS, сахарозу и DM-витамины, как указано выше, и ВА (6,0 мг/л) при рН 5,8. RG2, используемая для отбора, содержит спектиномицин (1000 мкг/мл) с добавлением сульфата стрептомицина (100 мкг/мл). Культуры помещают в ростовую камеру (16-часовой световой период; 25С) и субкультивируют каждые две недели в свежую среду для отбора. Из группы побегов, появившихся из каждого зародыша, отбирают зеленые побеги и снова помещают в селективную среду (фигура 12В). Появления корней достигают в среде RG3 (соли MS, сахароза и DM-витамины, как указано выше, IBA (0,5 мг/л, при рН 5,8) с добавлением антибиотиков. (Корни могут появиться или по отдельности, или в виде группы корней.) Ростки пересаживают в среду для выращивания в горшках, дают акклиматизироваться, затем снова пересаживают в горшки со смесью глина и песка (1:1) и выращивают до зрелого состояния в теплице (фигуры 12Г, Д, Е).

Разработка схем пластидной трансформации и регенерации для кукурузы и риса.

Как описано выше, разработаны (Rudraswamy, 1997) уникальные схемы трансформации ядер кукурузы и регенерации (фигура 10) и приспособлены к трансформации пластид. (До настоящей работы эксплантаты узловых срезов не использовались для трансформации или регенерации.) Индуцируются многочисленные побеги на узловых срезах, иссеченных из трехдневных проростков 21 генотипа (ни один из них не является родственным А188 или В73), которые включают гибридные (16-зерновые, один сладкий) или инбредные (четыре) генотипы. После восьми недель культивирования генерируются 16-32 (в среднем 24) побега на эксплантат. Стебли укореняют, и восстановленные растения не демонстрируют аберрантные фенотипы при анализах в теплице (исследования ограничивались двумя растениями на генотип). ДНК можно также доставить в эксплантаты узловых срезов всех генотипов (фигура 10В; неустойчивая экспрессия -глюкуронидазы). Для пластидной трансформации эксплантаты узловых срезов бомбардируют pSBL-ctV2, затем помещают на среду для индукции многочисленных побегов, содержащую спектиномицин и стрептомицин. Появляющиеся побеги можно вырезать и снова поместить на среду для индукции для последующих циклов отбора.

Как описано выше, уникальные вылущенные интактные зрелые семена-мишени риса, зародышевым концом вверх, не применявшиеся в схемах трансформации, о которых сообщалось ранее, соединяют со схемой индукции многочисленных побегов (фигура 12) для зрелых зародышей (иссеченных через двое суток после бомбардировки). Многочисленные побеги индуцируются на всех восьми испытанных генотипах (Litton и Priscilla - два новых сорта, выведенных в Миссисиппи, плюс шесть выведенных линий). Отмеченная реакция должна быть схожей во многих других сортах, так как исходным эксплантатом является зрелый зародыш. Восстановленные (нетрансформированные) растения сохраняют для сбора семян F1. После пластидной трансформации размножение побегов происходит в присутствии спектиномицина/стрептомицина, и, как в случае с кукурузой, побеги можно подвергать многим циклам отбора из-за пролиферации побегов (неизвестно, являются ли они пазушными или придаточными по происхождению) из основы иссеченных побегов. Укоренение также осуществляют на селективных средах.

Фигуры 13А-Б показывают анализ методом PCR ДНК, выделенной из листьев первой генерации трансформантов риса. Продукты PCR не столь обильны, как наблюдается в хлоропластовых трансгенных растениях табака (фигура 13А, полоса 11, фигура 13Б, полоса 12). Это может происходить по двум причинам. Схема, используемая для выделения ДНК, не подходит для крупных листьев риса, или праймеры, созданные для табака, не ренатурируют так же хорошо с ct ДНК риса. Тем не менее, для предварительного анализа используют праймеры табака, чтобы проверить интеграцию гена aadA в геном растения из универсального вектора. Отсутствие продукта может указывать на спонтанные мутанты, способные расти на спектиномицине без гена aadA (фигура 13А, полосы 7-10). Продукт PCR в 1,57 кб обнаруживают в четырех линиях (фигура 13А, полосы 2-6), трансформированных универсальным вектором. В используемых условиях отбора обнаружено четыре мутанта из десяти линий, трансформированных универсальным вектором. Создают также праймеры для специфической идентификации интеграции в пластидный геном. В случае универсального вектора праймер на нативный хлоропластовый геном помещают в ген 16S rRNA вне фланкирующей последовательности хлоропластового вектора (продукт PCR в 1,60 кб). Ожидаемые продукты наблюдают в случае трансгенных линий, полученных с использованием универсального вектора (фигура 13Б, полосы 5, 6). Как и ожидалось, в растениях, не подвергавшихся бомбардировке (контроль), продукты PCR не обнаружены (фигура 13Б, полоса 2; фигура 13А, полоса 1). Результаты PCR выявляют два растения риса Priscilla (2.3 и 2.4), содержащих трансформированные пластиды (фигуры 12 и 13).

Пример 5

Трансформация хлоропластов арахиса (Arachis hypogaea)

Трансгенный арахис с трансформированными хлоропластовыми геномами получают с использованием универсального вектора pSBL-CG-CtV2 (фигура 7А). Ткань арахиса выращивают при культивировании в соответствии со схемой, описанной Kanyand et al., 1994. Условия бомбардировки такие же, как в случае трансформации хлоропластов табака, описанной выше, за исключением того, что для бомбардировки используют срезы эпикотиля несмотря на использование разрывных дисков переменного давления. О трансформации хлоропластов арахиса ранее никогда не сообщалось.

Фигура 14 показывает пластидную трансформацию арахиса. Трансформированные растения арахиса растут нормально (в середине и на левой стороне фигуры), в то время как нетрансформированные растения погибают на летальной среде (500 мкг/мл).

Пример 6

Трансформация хлоропластов сои.

Трансгенную сою, содержащую трансформированные хлоропластовые геномы, получают с использованием универсального вектора pSBL-CG-CtV2 (фигура 7А). Условия бомбардировки такие же, как при трансформации хлоропластов табака. О трансформации хлоропластов сои ранее никогда не сообщалось.

Фигура 15 показывает пластидную трансформацию сои. Два трансформированных растения демонстрируют побеги, другое растение погибает на летальной среде, подтверждая летальный отбор при помощи антибиотика спектиномицина (500 мкг/мл).

Пример 7

Трансформация хлоропластов сладкого картофеля.

Трансгенные растения сладкого картофеля, содержащие трансформированные хлоропластовые геномы, получают с использованием универсального вектора pSBL-CG-CtV2 (фигура 7А). Ткань сладкого картофеля выращивают при культивировании в соответствии со схемой, описанной Zhang et al., 1996. Условия бомбардировки такие же, как при трансформации хлоропластов табака, описанной выше, за исключением того, что бомбардируют каллюсы и первичные зародыши и после бомбардировки переносят их в чашки, содержащие 100 мг/мл спектиномицина. О трансформации хлоропластов сладкого картофеля ранее никогда не сообщалось.

Фигура 16 показывает трансформацию зародышей сладкого картофеля на летальной селективной среде с антибиотиком спектиномицином (500 мкг/мл). Отмечаются обесцвеченные каллюсы (справа) и зеленые зародыши (слева).

Пример 8

Трансформация хлоропластов винограда.

Трансгенные растения винограда, содержащие трансформированные хлоропластовые геномы, получают с использованием того же универсального вектора pSBL-CG-CtV2. Ткань винограда выращивают при культивировании в соответствии со схемой Hebert et al., 1993. Все схемы трансформации хлоропласта такие же, как в случае табака, за исключением того, что для бомбардировки используют клетки в экспоненциальной фазе роста примерно через 4 суток после субклонирования. О трансформации хлоропластов винограда ранее никогда не сообщалось.

Фигура 17 показывает трансформацию клеток винограда. Трансформированные клетки культуры становятся зелеными, в то время как нетрансформированные погибают в летальной селективной среде с антибиотиком спектиномицином (500 мкг/мл).

Пример 9

Трансформация других растений.

Трансформация растений с помощью бомбардировки микрочастицами является выгодным методом введения в растения-мишени универсального вектора, несущего нужную нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу, представляющую интерес. Характерные примеры трансгенных растений, полученных посредством бомбардировки микрочастицами, приведены в табл. II.

Трансформация растений с использованием генной пушки описана Daniell, 1997. У каждой культуры, о которой сообщается, что ее можно трансформировать в ядро с помощью бомбардировки микрочастицами, согласно данной таблице, может быть свой хлоропластовый геном, трансформированный с использованием универсального вектора, описанного здесь.

Пример 10

Экспрессия нерастительных продуктов

Приведенные далее примеры иллюстрируют экспрессию разлагаемых микроорганизмами биополимеров на основе белков (РВР) и анализ трансформантов.

Вектор pSBL-CG-EG121.

Вектор pSBL-CG-EG121 (фигура ЗА) содержит ген (GVGVP)121мер (названный EG121), который кодирует разлагаемый микроорганизмами биополимер на основе белка (РВР), имеющий многочисленные медицинские и немедицинские применения.

Конструктирование хлоропластовых экспрессионных векторов. Обычные схемы создания векторов таковы, как описанные Sambrook et al., 1989. Хлоропластовые интеграционные и экспрессионные векторы pSBL-CtV2 (фигура 7А) и pZS197 расщепляют соответственно XbaI (уникальный сайт между геном aadA и областью psbA 3) и SpeI (уникальный сайт через 120 п.о. после гена aadA в регуляторной области psbA 3), липкие концы достраивают с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют. Полимерный ген EG121 вместе с последовательностью Шайна-Дальгарно (GAAGGAG) из вектора pET11d вырезают из плазмиды pET11d-EG121 в виде фрагмента XbaI-BamHI. Липкие концы встроенного фрагмента достраивают с помощью фрагмента Кленова и лигируют с вектором pSBL-CtV2 или pZS197, в результате чего получают хлоропластовые экспрессионные векторы pSBL-CG-EG121 (фигура 3А) и pZS197-EG121 (фигура 3Б), которые обеспечивают интеграцию генов aadA и EG121 в инвертированный повтор (IR) или в спейсерную область между генами rbc1 и orf 512 хлоропластового генома табака. См. фигуру 1, сайты интеграции UV и TV соответственно.

Экспрессия биополимеров в Е. coli и табаке.

Плазмидным вектором pSBL-CG-EG121 (фигура 3А) трансформируют штамм Е. coli XL-1 Blue и выращивают в крепком (terrific) бульоне в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) при 37С в течение 24 ч. SDS-PAGE электрофорез проводят согласно Laemmli, 1970, с использованием 12% разделяющего геля и 5% концентрирующего геля в течение 5 ч при постоянном токе 30 мА. Готовят грубые экстракты неочищенного белка из клеток Е. coli и подвергают их электрофорезу, как описано в Guda et al., 1995. После электрофореза полипептиды визуализируют посредством отрицательного окрашивания CuCl2.

Фигура 18 показывает экспрессию хлоропластовых интеграционных и экспрессионных векторов в штамме Е. coli HMS174 (DE3). Полоса 1 соответствует очищенному полимеру-белку; полоса 2 соответствует контролю нетрансформированной Е. coli; полоса 3 соответствует штамму Е. coli XL-1 Blue, трансформированному универсальным вектором pSBL-CG-EG121 (фигура 3А); полоса 4 соответствует Е. coli, трансформированной табачным вектором, и полоса 5 соответствует штамму Е. coli HMS174 (DЕ3), трансформированному вектором pET11d-EG121, в котором промотор Т7 обеспечивает транскрипцию гена полимера. Уровень экспрессии при использовании промотора Prrn в Е. coli почти эквивалентен уровню, полученному с использованием высокоэффективного промотора Т7, контролирующего ген полимера.

Саузерн-блоттинг.

Тотальную ДНК из листьев трансформированных растений и растений дикого типа экстрагируют СТАВ-методом Rogers and Bendich, 1988.

Фигуры 19 и 20 показывают Саузерн-блоттинг, выполненный независимо с трансформантами, полученными с использованием табачного вектора (фигура 19) и универсального вектора (фигура 20). Тотальную ДНК расщепляют EcoRI и HindIII в случае трансформантов универсального вектора (UV) или EcoRI и EcoRV в случае трансформантов вектора табака (TV). Наличие сайта EcoRI в 3-конце гена полимера позволяет вырезать фрагменты предсказанного размера только в хлоропластовых трансформантах. Для того чтобы подтвердить интеграцию чужеродного гена и гомоплазмию, индивидуальные блоты анализируют с помощью зондов, соответствующих пограничным последовательностям. В случае TV-трансформантов после второго или третьего циклов отбора пограничная последовательность гибридизируется с фрагментами в 4,6 и 1,6 кб (фигура 19А, полосы 2, 3 и 4) и нативным фрагментом в 3,1 кб в диком типе (фигура 19А, полоса 1). С другой стороны, в случае UV-трансформантов после первого цикла отбора пограничная последовательность гибридизируется с фрагментами в 4,0 кб и 1,2 кб (фигура 20А, полосы 1 и 2), в то время как в контроле она гибридизируется с нативным фрагментом в 2,1 кб (фигура 20А, полоса 3). Более того, у TV-трансформантов также обнаруживается нативный фрагмент в 3,1 кб (фигура 19А, полосы 2 и 3) подобно растению дикого типа, что указывает на гетероплазматическое состояние трансформированных хлоропластовых геномов, даже если они прошли несколько циклов отбора. В то же время оба UV-трансформанта демонстрируют гомоплазматическое состояние даже после первого цикла отбора (фигура 20А, полосы 1, 2).

О наличии гетероплазмии уже после второго отбора сообщалось ранее, и предполагается, что отбор необходимо проводить до достижения гомоплазмии (Svab and Maliga, 1993). Это согласуется с наблюдением, что у TV-трансформантов после второго цикла отбора наблюдается высокая степень гетероплазмии (фигура 19А, полосы 2 и 3). В то же время в случае UV-трансформантов никакого гетероплазматического состояния не обнаружено, что возможно может быть обусловлено механизмом коррекции копий между двумя областями IR и/или присутствием хлоропластовой точки начала репликации (ori) в пределах пограничной последовательности, что может повышать число копий введенной плазмиды перед интеграцией.

Блоты ДНК также анализируют или геном aadA (растения с интеграцией UV) или геном EG121 (растения с интеграцией TV), чтобы снова подтвердить интеграцию чужеродных генов в хлоропластовые геномы. В растениях с интегрированным TV зонд полимерного гена гибридизируется с фрагментом в 4,6 кб только в линиях пластидных трансформантов (фигура 19Б, полосы 2, 3 и 4). Также в растениях с интегрированным UV последовательность aadA гибридизируется с предполагаемым фрагментом в 4,0 кб (фигура 20Б), который также гибридизируется с пограничной последовательностью в линиях пластидных трансформантов (фигура 20А, полосы 1 и 2).

Анализ содержания транскриптов в трансгенном табаке и Нозерн-блоттинг.

Содержание транскриптов чужеродного гена анализируют с помощью Нозерн-блоттинга (фигура 21) с использованием тотальной РНК, выделенной из контрольного растения, хлоропластовых трансформантов и трансгенного растения табака, экспрессирующих ген полимера (EG121) с высокими уровнями через ядерный геном (Zhang et al., 1996). Последовательность гена полимера (EG121) гибридизируется с фрагментом в 1,8 кб в хлоропластовых трансформантах (полосы 1-4 и 5-6), а также с более крупными фрагментами в одном из хлоропластовых трансформантов (полоса 6). В случае ядерного трансформанта наблюдают транскрипт примерно в 2,1 кб (полоса 7). Это происходит из-за присутствия последовательности поли-А на 3-конце полимерного транскрипта, обеспеченного nos-терминатором. Фрагменты большего размера, наблюдаемые в полосе 6, могут представлять собой ди-, три- или полицистронные транскрипты, которые процессируются в хлоропластах. Это обычное явление при экспрессии генов в хлоропластах, поскольку многие пластидные гены собираются в полицистронные транскрипционные единицы, что приводит к появлению сложных наборов перекрывающихся мРНК. Количественное определение содержания транскриптов показывает, что хлоропластовые трансформанты продуцируют в 11 раз (полоса 5) или пятьдесят раз (полоса 6) больше полимерных транскриптов, чем ядерный трансформант с высоким уровнем экспрессии (полоса 7, проверяли растение с самой высокой экспрессией среди тридцати пяти TV-ядерных трансгенных растений). Это непосредственно связано с наличием большего числа копий генов в хлоропластах трансформированных растений. Пластидные трансформанты с интегрированным вектором табака (TV) показывает более низкое содержание полимерного транскрипта (полосы 1-4) по сравнению с трансформантами с интегрированным универсальным вектором (полосы 5, 6), поскольку ген полимера существует в виде двух копий на трансформированный пластидный геном в трансформантах универсального вектора против одной копии в TV-трансформантах, и из-за гетероплазматических состояний, наблюдаемых в TV-трансформантах.

Вестерн-блоттинг.

Белок-полимер выделяют в чистом виде из листьев табака дикого типа, хлоропластовых трансформантов и ядерных трансгенных растений в соответствии со способом, описанным недавно Zhang et al., 1995. Очищенный полимер анализируют посредством SDS-PAGE электрофореза согласно Laemmli, 1970, с использованием 12% разделяющего геля и 5% концентрирующего геля в течение 5 час при постоянном токе 30 мА. Полипептиды примерно в 60 кД визуализируют посредством отрицательного окрашивания с 0,3 М CuCl2. Гели обесцвечивают в 0,25 М растворе Na-ЭДТА и 0,25 М трис-Cl, рН 9,0, с тремя заменами буфера с интервалом в 10 мин. Вестерн-иммуноблоттинг и окрашивание (фигура 22) осуществляют так, как описано в Zhang et al., 1996, с использованием моноклональной антисыворотки против полимера AVGVP, который перекрестие взаимодействует с полимером GVGVP, и набора Immuno-Blot Assay Kit (Bio-Rad). Полипептиды с подвижностью, примерно соответствующей 60 кД, обнаружены в пластидных трансформантах интегрированных в IR растений. Экспрессия полимера ядерным трансгенным растением генерации F2 с высоким уровнем экспрессии (проверяли растение с наивысшей экспрессией из числа 35 трансгенных растений) видна на полосе 5 (фигура 22), в то время как в нетрансформированных контрольных растениях никакой полимер не экспрессируется, как видно на полосе 4 (фигура 22). В хлоропластовых трансформантах обнаруживается уровень экспрессии полимерных транскриптов выше в одиннадцать-пятьдесят раз (фигура 21). В случае нативных встречающихся в хлоропластах белков, подобных валину и пролину, пути биосинтеза которых компарментализованы в хлоропластах, можно ожидать более высокий уровень продуцирования белка.

Пример 11

Генная инженерия для толерантности к глифозату через ядерный и хлоропластовый геномы

Хлоропластовые интеграционные и экспрессионные векторы табака, содержащие EPSPS.

Последовательность, кодирующая EPSPS, недавно интегрирована в хлоропластовый геном табака (фигура 1). Хлоропластовый вектор pZS-RD-EPSPS (фигура 2А) содержит промотор 16S rRNA (Prrn), контролирующий гены aadA и EPSPS, с psbA 3-областью из хлоропластового генома табака. Эта конструкция обеспечивает интеграцию генов aadA и EPSPS в спейсерную область между генами rdcL и orf512 хлоролластового генома табака. Фигура 1, стрелка TV.

Проверка устойчивости к глифозату.

Экспрессия генов в Е. coli. Из-за высокой схожести систем транскрипции и трансляции в Е. coli и хлоропластах (Brixey et al., 1997) хлоропластовые экспрессионные векторы стали первыми испытанными в Е. coli на устойчивость, в данном случае к глифозату, перед осуществлением трансформации высших растений. Более высокая скорость роста Е. coli, содержащей вектор табака, по сравнению с контролем, содержащем pZS197 (похожим на pZS-RD-EPSPS, но лишенным гена EPSPS), в присутствии 10 мМ и 40 мМ глифозата (фигура 23А) указывает на толерантность к глифозату Е. coli, экспрессирующей ген EPSPS. Другая кривая роста (фигура 23Б) подтверждает экспрессию EPSPS в E. coli с помощью универсального вектора. Таким образом, устойчивость Е. coli к глифозату является следствием экспрессии гена EPSPS, присутствующего как в табачном, так и в универсальном векторах.

Характеризация трансгенных растений табака

Итеграция гена.

Полностью распустившиеся листья Nicotiana tabaccum, сорт Petit Havana, подвергают бомбардировке табачным и универсальным хлоропластовым векторами. Через два дня после бомбардировки листовые эксплантаты переносят в среду для летального отбора, содержащую спектиномицин (500 мкг/мл). Трансгенные растения получают в пределах 3-5 месяцев после бомбардировки. Как правило, из 16 подвергнутых бомбардировке листьев идентифицируют 10 независимо трансформированных побегов.

Анализ PCR проводят с ДНК, выделенной из побегов первой или второй генерации, а также из зрелых трансгенных растений. Для подтверждения интеграции гена aadA в растительный геном используют праймеры на основе табачного и универсального векторов. Отсутствие продукта может указывать на спонтанные мутанты, способные к росту на спектиномицине без гена aadA. Ожидаемый продукт PCR (887 п.о.) обнаружен в шести линях (фигуры 24А-Б, полосы 1-6), трансформированных табачным вектором. В четырех линиях, трансформированных универсальным вектором, обнаружен продукт PCR длиной 1,57 кб (фигуры 24А-Б, полосы 1-4). В использованных условиях отбора из десяти линий, трансформированных табачным вектором, обнаружено четыре мутанта. С другой стороны, во всех трансгенных линиях, трансформированных универсальным вектором, обнаружена интеграция гена aadA.

PCR для подтверждения интеграции в хлоропласты.

Также были созданы праймеры для специфической идентификации интеграции в пластидный геном. Здесь стратегия состоит в том, чтобы один праймер соответствовал нативному хлоропластовому геному рядом с местом интеграции вектора, в то время как другой соответствовал гену aadA. Был создан праймер, который локализуется непосредственно сразу за геном rbcL табачного вектора (продукт PCR в 2,08 кб). В случае универсального вектора праймер локализуют в нативном хлоропластовом геноме в гене 16S rRNA (продукт PCR в 1,60 кб). Продукты экспрессии были обнаружены в случае трансгенных линий, полученных с использованием табачного вектора (фигуры 24А-Б, полосы 2-7), так же как и с использованием универсального вектора (фигуры 24А-Б, полосы 1-4). В растениях, не подвергавшихся бомбардировке (контроль), как и ожидалось, продукты PCR не обнаружены (фигура 24А, полосы 1 и 9; фигура 24Б, полосы 5 и 11). Таким образом, оказывается, что все проверенные растения являются хлоропластовыми, а не ядерными трансформантами, вероятно, вследствие требования более высокого содержания аминогликозидаденилтрансферазы (AADA) в трансгенных растениях в строгих условиях отбора. Низкие уровни имеющейся AADA в ядерных трансгенных растениях должны привести к удалению ядерных трансформантов. Результаты анализа методом PCR убедительны и доказывают интеграцию чужеродных генов в хлоропласты при использовании как табачного, так и универсального векторов.

Анализ Саузерн-методом.

Интеграцию гена aroA в хлоропласты подтверждают также с помощью анализа Саузерн-методом. Кроме того, наблюдаемый высокий уровень устойчивости к глифозату (фигура 20А) подтвержадают посредством определения числа копий чужеродного гена в трансгенных растениях. Зонд для определения интеграции чужеродного гена в хлоропластовый геном представляет собой фрагмент гена EPSPS длиной 654 п.о., меченный Р32 с помощью метода рассеянной затравки. Тотальную ДНК, включающую как ДНК из органелл, так и из ядра, расщепляют EcoRI. Наличие сайта EcoRI за 200 п.о. перед сайтом интеграции в хлоропластовом геноме используют для подтверждения интеграции гена EPSPS в хлоропластовый геном трансгенных растений. При гибридизации зонда с нативным геном EPSPS, присутствующем в ядерном геноме, обнаруживается фрагмент длиной 4,5 кб. Кроме этого, при гибридизации зонда с расщепленными хлоропластовыми геномами трансгенных растений табака, обнаруживаются фрагменты длиной 3,5 и 4,35 кб, фигура 25А, полосы 2, 3 и 4. Зонд не гибиридируется с расщепленным хлоропластовым геномом нетрансформированного контрольного растения (фигура 25А, полоса 1), так как чужеродный ген не присутствует в хлоропластовом геноме табака. Это четко подтверждает интеграцию гена EPSPS в хлоропластовый геном.

Число копий генов.

Число копий интегрированного гена определяют, устанавливая гомоплазмию трансгенного хлоропластового генома. Хлоропласты табака содержат 5000-10000 копий своего генома на клетку (McBride et al., 1995). Если фактически трансформируется только часть геномов, число копий должно быть менее 10000. Установив, что в трансгенных растениях присутствует только геном, трансформированный EPSPS, можно установить, что число копий составляет 5000-10000 на клетку. Это подтверждают посредством расщепления тотальной ДНК EcoRI и гибридизации с фланкирующими последовательностями, способными к гомологичной рекомбинации в хлоропластовый геном. Зонд представляет собой фрагмент длиной 2,9 кб последовательностей rbcL-orf 512. Хлоропластовый геном, трансформированный геном EPSPS, содержит сайт EcoRI в области rbcL-orf 512 хлоропластового генома, в результате чего при расщеплении этим ферментом образуется дополнительный фрагмент (фигура 25 В). При анализе методом Саузерн-гибридизации в случае нетрансформированного контрольного растения обнаруживается фрагмент в 4,43 кб, фигура 25Б, дорожка 1. В дорожках 2, 3 и 4 образуется два фрагмента (4,35 кб и 3 кб) вследствие включения кассеты гена EPSPS между областями rbcL и orf512 (фигура 25В представляет схему с темными штриховыми линиями, показывающими место интеграции чужеродной ДНК). Фрагмент 4,43 кб, имеющийся в контроле, отсутствует в трансгенных растениях. Это доказывает, что в клетке присутствует только трансгенный хлоропластовый геном и отсутствует нативный нетрансформированный хлоропластовый геном без гена EPSPS. Это указывает на гомоплазматический характер трансформантов, причем одновременно дается оценка числа копий - 5000-10000 копий чужеродного гена EPSPS на молекулу. Это может объяснить высокий уровень толерантности к глифозату, который наблюдается в трансгенных растениях табака (фигура 20А).

Потомство.

Семена, собранные с самоопылившихся трансгенных растений, проращивают в присутствии спектиномицина (500 мкг/мл). Все семена прорастают, остаются зелеными и нормально растут (фигура 26Б). Равномерная устойчивость к спектиномицину показывает, что ген aadA передается всему потомству. Отстутствие разноцветности предполагает гомоплазмию, поскольку гетероплазматическое состояние могло бы привести к разноцветному потомству на спектиномицине (Svab et al., 1990; Svab and Maliga, 1993). Отсутствие в потомстве вариаций в хлорофилловой пигментации также подчеркивает отсутствие позиционного эффекта осуществления трансформации ядра. Все контрольные проростки обесцвечиваются и не растут в присутствии спектиномицина (фигура 26А).

Толерантность в отношении глифозата. Восемнадцатинедельные контрольные и трансгенные растения опрыскивают равными объемами глифозата при разных концентрациях (0,5-5 мМ). Контрольные растения табака весьма чувствительны к глифозату; они погибают в пределах семи дней даже при концентрации глифозата 0,5 мМ (фигура 27Б). С другой стороны, хлоропластовые трансгенные растения выживают при таких высоких концентрациях глифозата, как 5 мМ (фигура 27А). Эти результаты интересны, учитывая тот факт, что ген EPSPS из петунии, используемый в этих хлоропластовых векторах, имеет низкий уровень толерантности к глифозату и также содержит переходный пептид для направления в хлоропласты.

Данное описание является первым сообщением об эукариотной ядерной экспрессии генов в пределах прокариотного хлоропластового компартмента. Хорошо известно, что частота использования кодонов существенно различается между прокариотным хлоропластовым компартментом и эукариотным ядерным компартментом. В идеале мутантный ген aroA (который не связывается с глифозатом) из прокариотной системы должен экспрессироваться в хлоропластовом компартменте. Теперь такие гены доступны и обнаруживают уровень устойчивости к глифозату в тысячи раз выше, чем ген петунии, используемый в данной работе. В свете этих наблюдений возможно, что интеграция прокариотных генов устойчивости к гербицидам в хлоропластовый геном, осуществляемая здесь, может привести к невероятно высокому уровню устойчивости к гербицидам, причем все еще сохраняется эффективность биологического удержания, т.е. удается избежать рассеивания посредством пыльцы.

Пример 12

Толерантность кукурузы к глифозату.

Универсальный хлоропластовый вектор с использованием ДНК хлоропластов кукурузы конструируют следующим образом. Сначала конструируют вектор pSBL-Ct-bor (фигура 5В). На основе бактериальной плазмиды pUC19 создают субклон ДНК хлоропласта кукурузы, содержащий одну из областей инвертированного повтора. Затем из первого субклона создают меньший субклон, содержащий только оперон rRNA, и фрагмент, присутствующий во втором субклоне, содержащий гены trnA и trnI и спейсернные области, представляющие универсальную границу, субклонируют в плазмиду pUC19 по сайту PvuII. Полученную плазмиду назвали pSBL-Ct-bor. В плазмиду pSBL-Ct-bor для создания вектора pSBL-CORN встраивают кассету гена селектируемого маркера, содержащую хлоропластовый промотор 16S rRNA, ген aadA (кодирующий аминогликозид-3-аденилтрансферазу, придающую устойчивость к стрептомицину, спектиномицину) и 3 нетранслируемую область хлоропластового гена psbA. Кассету гена селектируемого маркера встраивают между генами trnI и trnA в спейсерной области в направлении транскрипции рДНК 16S.

Вектор pSBL-CORN-aroA, содержащий мутантный ген aroA из Salmonella typhimurium (Stalker et al., 1985; Comai et al., 1983), который кодирует фермент EPSPS-синтазу, создают посредством встраивания мутантного гена aroA в вектор pSBL-CORN. Трансгенные растения кукурузы, экспрессирующие мутантный ген aroA, являются устойчивыми к обработке глифозатом, подобном Roundup, в то время как нетрансформированные контрольные растения не устойчивы.

Пример 13

Трансформация хлоропластов для толерантности к имидазолинонам или сульфонилмочевинам.

Плазмиду pSBL-CORN модифицируют посредством встраивания фрагмента ДНК, содержащего мутантную форму гена ацетолактатсинтазы Saccharomyces cerevisiae (Faico and Dumas, 1985; Yadav et al., 1986), и получают плазмиду pSBL-CORN-ASLI. Этот ген кодирует ацетолактатсинтазу, которая не ингибируется имидазолинонами или сульфонилмочевинами и которая придает устойчивость к гербицидам, содержащим сульфометурон-метил, и гербицидам, содержащим имазапир. Трансформированные растения табака, в которых экспрессируется мутантный ген ацетолактатсинтазы, устойчивы к гербицидным препаратам для опрыскивания на основе имидазолинонов и сульфонилмочевин.

Вектор pSBL-CORN-ASL2 является производным pSBL-CORN, который содержит мутированные копии генов табака suRA и suRB (Chaleff and Ray, 1984). Эти гены кодируют полипептид ацетолактатсинтазу табака. Плазмиду pSBL-CORN-ASL2 создают посредством лигирования генов suRA и suRB, выделенных из геномной ДНК табака, с вектором pSBL-CORN. Полученный вектор придает устойчивость к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам.

Пример 14

Трансформация хлоропластов для толерантности к ингибиторам фотосистемы II.

Устойчивость фотосистемы (PS) II к гербицидам определяется мутациями в гене psbA, кодирующего белок QВ, и является весьма консервативной во всех растениях. Устойчивые растения обладают мутациями, которые изменяют аминокислоты в определенных специфических позициях белков QB, например остатков 219, 251, 255, 264 и 275 (Hirschberg and McIntosh, 1993; Galloway and Mets, 1994; Gloden and Haselkorn, 1985; Erickson et al., 1984; Johanningmeier et al., 1987). Гены, обладающие такими мутациями, можно, таким образом, использовать для придания устойчивости к гербицидам, действие которых заключается в ингибировании переноса электронов системой PS II.

Примерами таких гербицидов являются дихлорфенилдиметилмочевина (DSMU), атразин, метрибузин, ленацил, фенмедифам, локсинил и диносеб.

Мутантный ген psbA, содержащий замену серина на глицин в остатке 264, выделяют из геномной ДНК Chlamydomonas с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Полученный фрагмент можно лигировать с универсальным хлоропластовым экспрессионным вектором pSBL-ctV2 и трансформировать в XL1Blue E. coli. Очищенную плазмиду из этого штамма E. coli используют для трансформации растений (Daniell, 1997). Введение мутантных генов psbA в хлоропластовый геном и отбор соответствующих трансформантов осуществляют так же, как описано ранее. Трансформированные растения, продуцирующие мутантный psbA белок, содержащий замену серина на глицин, устойчивы к атразину, в то время как контрольные растения неустойчивы.

Мутантный ген psbA, содержащий замену валина на изолейцин в остатке 219, выделяют из геномной ДНК Chlamydomonas с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Универсальный вектор конструируют так же, как описано выше. Ожидается, что трансгенные растения, подобные кукурузе, экспрессирующие psbA, содержащий замену валина на изолейцин в остатке 219, будут устойчивы к опрыскиванию спреями DCMU.

Пример 15

Толерантность к аналогам ауксина, таким как 2,4-Р.

Универсальный хлоропластовый эспрессионный вектор pSBL-ctV2 можно расщепить XbaI и лигировать с фрагментом ДНК, содержащим ген, кодирующий монооксигеназу. Полученную конструкцию можно трансформировать в хлоропласты для генерации трансгенных растений, содержащих множество копий гена монооксигеназы. Ожидается, что полученные растения, экспрессирующие большое количество монооксигеназы, будут толерантны к 2,4-D.

Пример 16

Трансформация хлоропластов для устойчивости к насекомым.

Растения табака можно трансформировать универсальным вектором pSBL-CtVHBt (фигура 8А), который содержит ген cryIIA и экспрессирует протоксин CryIIA, посредством чего придается устойчивость к насекомым-вредителям, подобным семейству Pyralidoe, таким как бражник. Даже насекомые, выработавшие устойчивость или менее чувствительные к токсину Bt, убиваются токсином Bt, экспрессированным геном в хлоропластовом векторе, описанном здесь.

Вектор pSBL-CtVHBt создают путем расщепления pSBL-CtVH SmaI и лигирования продукта с геном cryIIA, кодирующим белок CryIIA. Продукт содержит ген cryIIA в правильной транскрипционной ориентации (фигура 8А).

Интеграция гена cryIIA в хлоропластовый геном табака подтверждается методом PCR. Число копий cryIIA на клетку оценивается в 10000 методом Саузерн-блоттинга. Белок CryIIA, по оценке с помощью Вестерн-блоттинга, составляет от 5 до 10% от общего количества клеточного белка. Это самое высокое содержание белка CryIIA, которое когда-либо приводилось в литературе для Bt-трансгенных растений. Биоанализы иссеченных листьев проводят для нетрансформированного табака Petit Havana и трансформированного cryIIA табака. На каждый лист помещают по пять-десять гусениц и оценивают смертность и повреждение листа через 3-5 дней. При использовании чувствительного Н. virescens (YDK) на трансформированном cryII-A табаке все гусеницы погибают в течение 3 дней, в то время как на нетрансформированном Petit Havana смертность остутствует, и происходит по существу 100% потеря листвы. Подобные результаты получают при использовании устойчивой к CryIAc (YHD2, 40-50000-кратная устойчивость) и устойчивой к CryII-A (СХС, 2000-кратная устойчивость) Н. virescens. Кроме того, наблюдают 100% смертность Helicoverpa zea (совка хлопковая) и Spodoptera exigua (совка малая), ни об одной из которых ранее не сообщалось, что она погибает от белка Cry.

Фигуры 28А и 28Б показывают биоанализ (А) контрольного нетрансформированного растения и (Б) трансгенного растения. Испытываемые насекомые демонстрируют 100% смертность: это совка, чувствительная к CryI, хлопковая совка и совка малая, устойчивые к CryI и CryII.

Фигура 29 показывает общий белок, выделенный методом Вестерн-блоттинга из контрольных (дорожка С) и трансгенных растений (дорожка В). Дорожки D-H показывают различные концентрации очищенного белка CryII (1-20%). Дорожка А соответствует белковым стандартам.

Другие поддающиеся воздействию насекомые описаны в описании изобретения ранее.

Как будет очевидно для специалистов в этой области техники, в свете изложенного выше описания возможны многие модификации, изменения и замены при практическом применении изобретения без отхода от его сущности и объема. Подразумевается, что такие модификации, изменения и замены входят в объем формулы изобретения.

Все цитированные в данном тексте ссылки в обязательном порядке включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Источники информации

Armtzen Ph.D., Charles J. (1997) Public Health Reports 112:190-197.

Brixey, P.J., Guda, H. and Daniell, H. (1997) Biotechnol. Lett. 19, 395-399.

Carlson, P.S. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:598-602.

Chaleff and Ray. (1984) Science 223:1148.

Comai, L., Faciotti, D., Hiatt, W., Thomson, G., Rose, R., and Stalker. D. (1983) Science 221:370.

Daniell, H., Guda, C., McPherson, D.T., Xu, J., Zhang, X. and Urry, D.W. (1997) Meth. Mol. Biol., 63:359-371.

Daniell, H., and Guda, C. (1997) Chemistry and. Industry, pages 555-558.

Daniell, H., Krishnan, M. and McFadden, B.A. (1991) Plant Cell Rep. 9:615-619.

Daniell, H., and McFadden. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 84:6349-6353.

Daniell, H., Vivekananda, J., Neilson, В., Ye, G.N., Tewari, K.K., and Sanford, J.C. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 87:88-92.

Daniell. H. Porobo Dessai, A., Prakash, C.S. and Moar, W.J. (1994) NATO Asi Series. Ed., J.H. Cherry. H86:598-604.

Darkocsik, C., Donovan, W.P. and Jany, C.S. (1990) Mol. Microbiol. 4:2087-2094.

Daniell, H., (1995) Inform. 6:1365-1370.

Daniell, H., Ramanujan, P., Krishnan, M., Gnanam, A. and Rebeiz, C.A. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comun 111:740-749.

Daniell, H. and Rebeiz, С.А. (1982) Biochem. Biophys. Res. Comun. 106:466-471.

Daniell, H. (1993) Methods in Enzymology. 217:536-556.

Daniell, H. (1997a) Meth. Mol. Biol. 62:453-488.

DeBlock, M., Botterman, J., Vandewiele. M., Docky, J., Thuen, C., Gossele, V., Movva, N.R., Thomson, C., Van Montagu, M., and Leemans, J. (1987) EMBO J. 6:2513-2518.

Erickson et al.(1984) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 81:3617.

Falco and Dumas. (1985) Genetics 109:21.

Gabard, J.M., Charest. P.J., Iyer, V.N. and Miki, B.L.(1989) Plant Phys. 91:574-580.

Galloway and Mets. (1984) Plant Physiol. 74:469.

Gloden and Haselkorn. (1985) Science 229:1104.

Guda, С., Zhang, X., McPherson, D.T., Xu. J., Cherry, J., Urry, D.W. and Daniell, H. (1995) Biotechnol. Lett. 17:745-750.

Hirschberg and McIntosh. (1993).Science 222:1346.

Johanningmeier et al. (1987) FEBS Lett 211:221.

Kanyand et al. (1994) Plant Cell Reports 14:1-5.

Kin Ying et al. (1996) The Plant Journal 10:737-743.

King, J. (1996) Science 274:180-181.

Laemmli, U.K. (1970) Nature 227:680-685.

Langevin, S.A., Clay. K. and Grace, J.B. (1990) Evolution 44:1000-1008.

Lewellyn and Fitt (1996) Molecular Breeding 2:157-166.

Lu, Z., Kunnimalaiyaan, M. and Nielsen, B.L. (1996) Plant Mol. Biol. 32:693-706.

Lyons, P.С., May, G.D., Mason, H.S., and Arntzen. C.J., (1996) Pharmaceutical News 3:7-12.

Maier, R.M., Necketman, K., Igloi. G.L. and , H. (1995) J. Mol. Biol. 251:614-628.

May, G.D., Mason, H.S., Lyons, P.C. (1996) American Chemical Society, pp.194-204.

Miele, L. (1997) Elsevier Trends Journals, Vol. 15.

Mikkelson, T.R., Anderson, B. and R.B. (1996) Nature 380:31.

Miki, B.I., Labbe, H., Hatori, J., Ouellet, Т., Gabard, J., Sunohara, G., Charest, P.J. and Iyer, V.N. (1990) Theoretical Applied Genetics 80:449-458.

McBride, K.E., Svab, Z., Schaaf, D.J., Hogan, P.S., Stalker, D.M. and Maliga, P. (1995) Bio/Technology 13:362-365.

Nielsen, B.L., Lu, Z. and Tewari, K.K. (1993) Plasmid 30:197-211.

Oard, J.H., Linscombe, S.D., Braveramn, M.P., Jodari, F., Blouin. D.C., Leech, M., Kohli, A., Vain, P. Cooley, J.C. and Christou, P. (1996) Mol. Breed. 2:259-368.

Penazloza, V., et al. (1995) Plant Cell Reports 14:482-487.

Rudraswamy, V. and Reichert, N.A. (1997) M.S. Thesis. Mississippi State Univ.

Rogers. S.O. and Bendich, A.J. (1988) in Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin. S.B. and Schilperoot, R.A. (Kulwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands) pp.A6:1-10.

Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) in Molecular cloning. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Mew York.

Sanford, J.C. (1988) Trends In Biotech. 6:299-302.

Sankula, S., Braverman, M.P., Jordari, F., Linscombe, S.D. and Oard, J.A. (1996) Weed Technol. 11:70-75.

Schultz, A., Wengenmayer,F. and Goodman, H. (1990) Critical Review in Plant Sciences 9:1-15.

Shaner and Anderson, P.C., (1985), Biotechnology in Plant Science, 287.

Sijmons, P.C., Cekker, B.M.M., Schrammeijer, В., Verwoerd, T.C., van den Elzen, P.J.M., Hoekema, A. (1990) Biotechnology 8:217-221.

Stalker, et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:4724.

Stummann et al. (1988) Physiologia Plantarum 72:139-146.

Svab, Z. and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:913-917.

Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maglia, P. (1990) Proc. Mat. Acad. Sci. (USA) 87:8526-8530.

Umbeck, P.F., et al. (1991) Econ. Entomology 84:1943-1950.

Urry, D.W., Nicol, A., Gowda, D.C., Hoban, L.D., McKee. A., Williams, Т., Olsen, D.B. and Сох, В.А. (1993) in Biotechnological Polymers: Medical. Pharmaceutical and Industrial Applications, ed. Gebelein, C.G. (Technomic Publishing Co., Inc., Atlanta, GA), pp. 82-103.

Widner, W.R. and Whiteley, H.R. (1989) J. Bacteriol. 171:961-974.

Yadav, et al. (1986) Proc. Nat1. Acad. (USA) 83:4418-4422.

Ye, G.N.. Daniell. H. and Sanford, J.C. (1990) Plant Mol. Biol. 15:809-819.

Yeh, H., Ornstein-Goldstein, N; Indik, Z., Sheppard, P., Anderson, N., Rosenbloom, J., Cicilia, G., Yoon, K. and Rosenbloom, J. (1987) Collagen Related Res. 7:235-247.

Zhang, X., Guda, С., Datta,. R., Dute, R., Urry, D.W. and Daniell, H. (1996) Plant Cell Reports 15:381-385.

Zhang, X., Guda., C., Datta, R., Dute, R., Urry, D.W., Danell, H.(1995) Biotechnology Letters 17:1279-1284.

Zhang, X., Urry, D.W. and Daniell, H. (1996) Plant Cell Rep. 16:174-179.

Current Protocols in Molecular Biology. Asubel et al., eds., John Wiley and Sons, Inc. (1997) Vol. I, II and III.

Herbicide Resistance Crops, Acricultural, Environmental, Economic, Regulatory and Technical Aspects, Duke, S.O., edt., CRC Press, Inc. (1996).

Herbicide Resistance in Plants. Biolocry and Biochemistry, Powles. S.B., and Holtum, J.A.M; eds., CRC, Press, Inc. (1994).

Формула изобретения

1. Универсальный интеграционный и экспрессионный вектор, компетентный для стабильной трансформации хлоропластного генома различных видов растений, включающий экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид, функционально связанную на 5'-и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластах растения-мишени, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластного генома мишени, которые обеспечивают стабильную интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластный геном путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластном геноме мишени, причем спейсерная последовательность транскрипционно активна и консервативна в хлоропластном геноме различных видов растений.

2. Вектор по п.1, включающий гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует селектируемый фенотип.

3. Вектор по п.2, в котором каждая фланкирующая последовательность включает часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластного генома, что облегчает двойную гомологичную рекомбинацию с консервативной спейсерной областью 2 в хлоропластном геноме мишени.

4. Вектор по п.3, в котором каждая фланкирующая последовательность включает, кроме части спейсерной области, части или полные гены tRNAIle и tRNAAla соответственно.

5. Вектор по п.4, в котором каждая фланкирующая последовательность включает, кроме части спейсерной области, части или полные последовательности генов 16S и/или 23SrRNA.

6. Вектор по п.3, в котором спейсерная область локализована в инвертированном повторе хлоропластного генома.

7. Вектор по п.3, в котором ДНК фланкирующих последовательностей происходит от иного вида растения, чем растение-мишень.

8. Вектор по п.3, в котором представляющий интерес пептид является биологически активной молекулой.

9. Способ стабильной трансформации растения-мишени, включающий введение интеграционного и экспрессионного универсального вектора в хлоропластный геном растения-мишени и выращивание трансформированного растения, причем вектор является компетентным для стабильной трансформации хлоропласта различных видов растений и включает экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид, функционально связанную на 5'- и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластах растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластного генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластного генома мишени, консервативной в хлоропластном геноме различных видов растений, обеспечивающий стабильную интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластный геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластном геноме мишени.

10. Способ по п.9, в котором трансформируемое растение является однодольным растением.

11. Способ по п.10, в котором трансформируемое растение выбирают из однодольных растений, представляющих собой маис, рис, злаковые травы, рожь, ячмень, овес или пшеницу.

12. Способ по п.9, в котором трансформируемое растение является двудольным растением.

13. Способ по п.12, в котором трансформируемое растение выбирают из двудольных растений, представляющих собой сою, арахис, виноград, сладкий картофель, горох, канолу, табак, томат или хлопчатник.

14. Способ по п.9, в котором представляющий интерес пептид является синтетическим полимером на основе белка.

15. Способ по п.14, в котором синтетический полимер на основе белка содержит повторяющиеся пентамерные последовательности (GVGVP)n, где n - целое число от 1 до 250, G означает глицин, V означает валин, и Р означает пролин.

16. Способ по п.14, в котором экспрессированным представляющим интерес пептидом является инсулин.

17. Способ по п.16, дополнительно включающий выделение инсулина.

18. Способ по п.16, в котором инсулин экспрессируется в форме проинсулина.

19. Способ по п.18, в котором проинсулин слит с синтетическим полимером на основе белка.

20. Способ по п.16, в котором трансформируемое растение представляет собой табак.

21. Способ по п.14, в котором представляющий интерес пептид представляет собой полипептид, являющийся сывороточным альбумином человека.

22. Способ по п.21, в котором трансформируемое растение представляет собой табак.

23. Способ придания устойчивости к гербициду растению-мишени, включающий введение в растение универсального интеграционного и экспрессионного вектора, компетентного для стабильной трансформации хлоропласта различных видов растений, включающего экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, придающий устойчивость к гербициду, функционально связанную на 5'- и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластах растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, иной чем толерантность к указанному гербициду, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластного генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластного генома мишени, консервативной в хлоропластном геноме различных видов растений, обеспечивающие стабильную интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластный геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластном геноме мишени, и выращивание трансформированного растения.

24. Способ по п.23, в котором представляющий интерес белок является ферментом, причем последовательность ДНК, кодирующая этот фермент, кодирует мутантную форму фермента, обладающего меньшим сродством к гербициду, чем у природного фермента.

25. Способ по п.23, в котором фермент представляет собой EPSP-синтазу, а гербицидом является глифозат.

26. Способ по п.23 для стабильной трансформации фенотипа растения-мишени, в котором в выращенном трансформированном растении экспрессируется селектируемый фенотип и другой признак в дополнение к экспрессии указанного фенотипа.

27. Способ по п.26, в котором выбранный фенотип обеспечивается посредством экспрессии гена гидромицин--фосфотрансферазы, а дополнительным признаком является устойчивость к гербициду глифозату.

28. Способ определения трансформации хлоропласта и экспрессии намеченного признака по приобретению растением-мишени устойчивости к выбранному гербициду вследствие трансформации растения, включающий введение в растение универсального интеграционного и экспрессионного вектора, компетентного для стабильной трансформации хлоропласта различных видов растений, включающего экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую нужный намеченный признак, функционально связанную на 5'- и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластах растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластного генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластного генома мишени, консервативной в хлоропластном геноме различных видов растений, обеспечивающие стабильную интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластный геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластном геноме мишени, воздействие на растения, в которые введен вектор, летальной концентрации гербицида, и отбор растений, которые не погибают при таком воздействии, причем посредством этого отбирают трансформированные растения, экспрессирующие намеченный признак.

29. Стабильно трансформированный транскрипционно/трансляционно-активный хлоропластный геном растения-мишени, компетентный для стабильной интеграции гетерологичной последовательности, включающий экспрессионную кассету, которая включает представляющую интерес гетерологичную последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес гетерологичную молекулу, экспрессирующуюся под контролем регуляторных последовательностей в хлоропластах растения-мишени, и последовательно ДНК растения, фланкирующую каждую сторону экспрессионной кассеты, обеспечивающая стабильную интеграцию ДНК в хлоропластный геном мишени путем гомологичной рекомбинации, причем указанная последовательность транскрипционно активна и консервативна в хлоропластном геноме различных видов растений, и указанная ДНК наследуется через репликацию органеллы в дочерних клетках.

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.11.2008

Извещение опубликовано: 10.11.2008        БИ: 31/2008




 

Похожие патенты:

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в селекции растений

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, необходимых для получения трансгенных растений, устойчивых или проявляющих значительную толерантность к гербицидам

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию трансгенных растений, обладающих инсектицидными свойствами

Изобретение относится к биотехнологии, в частности биотехнологии сельскохозяйственных растений

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и медицине
Изобретение относится к области биотехнологии

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выделенной молекуле ДНК, обеспечивающей устойчивость растений к болезням, а также к способу придания растениям устойчивости к болезням

Изобретение относится к биотехнологии, в частности представляет собой способ получения генетически модифицированных растений, имеющих измененный уровень содержания одного из продуктов вторичных процессов обмена веществ

Изобретение относится к области генной инженерии, в частности к способу получения трансгенных растений
Наверх