Последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего, и вектор ее включающий

 

Изобретение относится к генетической инженерии. Предложена последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего. Предложенная нуклеиновая кислота состоит из последовательности OriP вируса Эпштейна-Барра, включающей остатки 1-495 SEQ ID NO:1, и последовательности EBNA1 вируса Эпштейна-Барра, включающей остатки 627-1718 SEQ ID NO:1, консенсусную последовательность полиаденилирования и вирусный промотор. Предложенная нуклеиновая кислота имеет длину менее 3 т.п.н. Предложен также вектор, включающий вышеуказанную последовательность. Предложенная группа изобретений позволяет улучшить свойства экспрессионных векторов и создать стабильные кассеты, экспрессирующие ген. Изобретение может быть использовано для генной терапии и для создания экспрессионных векторов. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил.

Известный уровень техники

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) представляет собой вирус герпеса человека с латентной фазой, характеризуемой стабильным эписомальным размножением замкнутой в кольцо формы вирусной ДНК. Для латентной фазы репликации необходимы два дискретных элемента ДНК: находящееся в цис-положении начало репликации, OriP, и ядерный антиген 1 Эпштейна-Барра (EBNA1) - единственный кодируемый вирусом белок, необходимый для репликации (Yates et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3806-10, 1984; Yates et al. Nature 313: 812-5, 1985). Большинство векторов EBV очень велики, порядка 10 т.п.о. или больше (без вставки), из-за большого размера сегментов EBNA1 и OriP. Размер существующих сегментов EBNA1 и OriP служит помехой в разработке экспрессионных векторов с улучшенными свойствами и в создании компактных экспрессирующих ген и стабильных кассет, которые могут быть введены в состав других средств доставки, таких как ретровирусы или аденовирусы.

Краткое изложение существа изобретения

В целом отличительной особенностью изобретения служит последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего. Эта нуклеотидная последовательность включает (а) последовательность OriP с делецией и (b) последовательность EBNA1 с делецией, функционально связанную с промотором, и эта нуклеотидная последовательность имеет длину менее 3 т.п.о., предпочтительно менее 2 т.п.о. и наиболее предпочтительно менее 1,8 т.п.о.

В предпочтительных вариантах последовательность OriP включает приблизительно 1-495 остатки SEQ ID NO:1 последовательность EBNA1 включает приблизительно 627-1718 остатки SEQ ID NO:1; последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно включает консенсусную последовательность полиаденилирования (например, близкую к последовательности SEQ ID NO: 2); а промотор представляет собой вирусный промотор.

В сходных вариантах в изобретении характеризуются также векторы и клетки (например, клетки млекопитающих и предпочтительно клетки человека), которые включают такие последовательности нуклеиновых кислот.

Подробное описание

Фиг.1 представляет собой последовательность укороченной EBV OriP и EBNA-1 кассеты.

Фиг.2 представляет собой последовательность компактного синтетического работающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования, которая может быть применена совместно с компактным репликоном EBV.

После большой делеции и мутагенеза оказалось возможным вставить во фрагмент длиной менее 2 т.п.о. цис- и трансдействующие функции, необходимые для эписомальной репликации EBV. В частности, примером является представленный на фиг.1 фрагмент из 1748 пар оснований (SEQ ID NO: 1), который действует как компактный репликон EBV. Этот фрагмент содержит все последовательности, необходимые для эффективной экспрессии белка EBNA-1, за исключением консенсусной последовательности полиаденилирования. Фрагмент является сегментом от сайта Вg12 до сайта BamHl, который содержит OriP элемент между остатками 1 и 495, модифицированный промотор гена тими-динкиназы вируса 1 Неrpes simplex между остатками с 496 до 616 и кодирующую последовательность для укороченного и модифицированного гена EBNA1 между остатками 627 и 1718. Плазмидные векторы, основанные на этой последовательности, реплицируют как эписомы в ядре трансфецированных клеток, происходящих не от грызунов (Yates et al., 1985, смотри выше).

Для сведения к минимуму суммарной длины последовательности указанный выше фрагмент конструировали как вставку вышеработающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования в соответствующем векторе. Пример компактного синтетического работающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования представлен на фиг.2 (SEQ ID NO: 2).

Компактные репликоны EBV находят применение в векторах для генной терапии, например, в средствах доставки генов, таких как экспрессионные векторы.

Другие осуществления представлены в формуле изобретения.

Формула изобретения

1. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего, включающая (а) последовательность OriP вируса Эпштейна-Барра, которая включает приблизительно остатки 1-495 SEQ ID NO:1 и (b) последовательность EBNA1 вируса Эпштейна-Барра, которая включает приблизительно остатки 627-1718 SEQ ID NO:1, функционально связанную с промотором, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину менее 3 т.п.о.

2. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота имеет длину менее 2 т.п.о.

3. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота имеет длину менее 1,8 т.п.о.

4. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно включает консенсусную последовательность полиаденилирования.

5. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.4, отличающаяся тем, что указанная консенсусная последовательность полиаденилирования включает приблизительно SEQ ID NO:2.

6. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что указанный промотор представляет собой вирусный промотор.

7. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, встроенная в клетку.

8. Вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, причем указанный вектор способен к эписомальной репликации в ядре трансфицированной клетки.

РИСУНКИ