Конъюгат окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения окситетрациклина

Авторы патента:

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

C07K14/765 - сывороточный альбумин, например HSA

Изобретение относится к области органической химии. Объект изобретения - конъюгат окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) для иммунохимического метода определения тетрациклина в физиологических жидкостях и тканях животных. Конъюгат получают реакцией окситетрациклина и формальдегида с БСА в водной среде или в смеси воды с метанолом. Конъюгат и полученную на его основе специфическую кроличью сыворотку применяют для иммунохимического определения содержания окситетрациклина. 2 табл.

Изобретение относится к области органической химии, в частности к конъюгату окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) для иммунохимического способа определения окситетрациклина. Иммунохимический способ определения окситетрациклина в тканях и физиологических жидкостях животных не разработан. Предпочтительным для иммунохимического способа определения окситетрациклина в тканях и физиологичеких жидкостях животных явился бы его конъюгат с БСА, но источников информации по данному вопросу не обнаружено.

Цель изобретения - конъюгат окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) общей формулы

где п=2-10,

предназначенный для определения окситетрациклина в тканях и физиологичеких жидкостях животных иммунохимическим способом, полученный путем реакции окситетрациклина и формальдегида с БСА в водной среде или в смеси воды с метанолом.

Конъюгат получен методом, основанным на реакции Манниха [1]. Для этого окситетрациклин (1) конденсируют с бычьим сывороточным альбумином (БСА) с помощью формальдегида при 20°С в водной среде.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К раствору, содержащему 150 мг БСА в 8 см³ воды, прибавляют 2 см 3 н раствора ацетата натрия и доводят рН до 6,7 с помощью 5%-ного едкого натра.

К полученному раствору прибавляют последовательно раствор 50 мг окситетрациклина гидрохлорида (1) в 12 см³ воды и 2 см³ 7,5%-ного раствора формальдегида, рН раствора вновь доводят до 6,7. Реакционную смесь перемешивают 2 ч в закрытом сосуде на магнитной мешалке при комнатной температуре, после чего диализуют в проточной водопроводной воде в течение 3 суток и центрифугируют 30 мин при 15 000 об/мин.

В надосадочной жидкости определяют количество белка методом Лоури и количество связанного окситетрациклина (1) спектрофотометрическим методом, после чего раствор конъюгата лиофилизируют.

Получают 125 мг конъюгата (2).

[] ²⁵_D-40,8° (25 мг в 5 см³ трис-буфера при рН 8,0).

_макс 340 нм (ацетатный буфер рН 7,4).

Конъюгат содержит в среднем 7,8 молекул окситетрациклина (1) на 1 моль БСА.

В ИК-спектре конъюгата (2) найдены полосы, характерные для гаптена (1).

ИК-спектр (КВг), см^-1: 3379, 3311, 3108, 1672, 1616, 1584, 1535, 1359, 1233,1004,950 и 676.

Пример 2.

Конденсацию окситетрациклина (1) с БСА осуществляют, как описано в примере 1, в водной среде, а также в смеси воды с диоксаном и воды с метанолом при иных условиях реакции и составе реакционных смесей.

В молярном отношении окситетрациклин и формальдегид применяют в большом избытке относительно БСА.

Условия получения конъюгата окситетрациклина с БСА и его характеристика представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 следует, что увеличение количества формальдегида в реакционной смеси несущественно, однако повышение концентрации окситетрациклина в ней полезно. Использование диоксана ухудшает результаты реакции, а метанола, напротив, дает положительный эффект.

Положительное влияние оказывает разбавление реакционной массы водой. Изменение рН от 6,5 до 8,0 и времени реакции с 0,5 до 24 ч незначительно влияет на результаты реакции.

Максимальная концентрация белка в конъюгате, достигнутая в опытах, составляет 6 мг/см³, а наибольшее количество молекул окситетрациклина, связанных с одним молем БСА, равно 10.

Пример 3.

Получают кроличью антисыворотку, специфичную к окситетрациклину (1), путем иммунизации трех кроликов-самцов массой 2-3 кг конъюгатом окситетрациклина с БСА (2), полученного по примеру 1, в количестве 0,1 мг на животное. 0,1 мг конъюгата перед введением разводят в 1,5 см³ стерильного изотонического раствора и эмульгируют в 1,5 см³ полного адъюванта Фрейнда. Антиген вводят подкожно в 30-40 точек в область спины. Через 4 недели после иммунизации проводят реиммунизацию животных водным раствором антигена без адъюванта. Через 1 неделю после реиммунизации у кроликов отбирают кровь из краевой вены уха и получают сыворотку.

Полученную сыворотку смешивают с глицерином в равных соотношениях, расфасовывают по 1 см³ в пробирки типа эппендорфов и хранят при минус 20°С в течение 2 лет.

Титр антисыворотки к конъюгату окситетрациклина с БСА (2), полученного по примеру 1, в непрямом твердофазном ИФА равен 12 800.

Пример 4.

Полученную по примеру 3 иммунную кроличью сыворотку в разведении 1:12 800 используют для определения количества окситетрациклина (1) в его растворах с известными концентрациями (1,0; 10,0 и 100 нг/см ³).

Для этого иммунологический полистероловый планшет сенсибилизируют раствором конъюгата окситетрациклина с БСА, полученного по примеру 1. После чего в лунки дозируют растворы специфических кроличьих антител и растворы окситетрациклина с известными концентрациями (1,0; 10,0 и 100 нг/см³ ), которые конкурируют за участки связывания антител с твердофазным антигеном в ИФА. Не связавшиеся антитела удаляют промыванием. Количество связавшихся специфических антител определяют с помощью вторичных (антивидовых) антител, меченных пероксидазой хрена и выявляемых раствором субстрата, содержащего хромоген - ортофенилендиамин и перекись водорода. В результате реакции перекиси водорода с пероксидазой хрена в молекулах связавшегося пероксидазного конъюгата хромоген окрашивает раствор в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окрашивания измеряют на вертикальном спектрофотометре при 492 нм (ОП₄₉₂). Интенсивность окраски (ОП) обратно пропорциональна концентрации окситетрациклина в исследуемых образцах.

Рассчитывают показатель процента связывания антител как отношение средних величин ОП контроля (сыворотка) и опыта (сыворотка+раствор окситетрациклина):

Результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, полученная сыворотка обладает высокой специфичностью и активностью по отношению к окситетрациклину (1). Предел обнаружения содержания окситетрациклина в растворе составляет 0,001 мкг/см ³. Конъюгат (2) может быть использован для иммунохимического способа определения окситетрациклина (1) в физиологических жидкостях и тканях животных.

Формула изобретения

Конъюгат антибиотика окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) для иммунохимического метода определения окситетрациклина общей формулы

где n=2-10,

полученный путем реакции окситетрациклина и формальдегида с бычьим сывороточным альбумином в присутствии воды или смеси воды с метанолом.

Изобретение относится к области медицины

Способ определения окислительно-восстановительного потенциала стенки желудка и двенадцатиперстной кишки // 2241997

Изобретение относится к области медицины

Способ количественного определения азитромицина дигидрата методом инверсионной вольтамперометрии // 2241985

Изобретение относится к области аналитической химии и касается количественного определения антибиотика группы макролидов азитромицина дигидрата (азитромицин)

Способ выбора фармпрепарата для лечения печеночной энцефалопатии // 2241224

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии, гепатологии и общей терапии, и может быть использовано для выбора фармпрепарата для лечения печеночной энцефалопатии

Способ экспресс-диагностики субклинических маститов у коров // 2240557

Изобретение относится к ветеринарному акушерству

Способ диагностики заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта у детей раннего возраста // 2239196

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии

Способ выявления степени риска акушерских осложнений // 2239189

Изобретение относится к акушерству и иммунологии и предназначено для выявления степени риска акушерских осложнений

Способ диагностики степени тяжести периода обострения бронхиальной астмы у детей // 2239188

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии

Способ интраоперационной экспресс-диагностики эффективности антипаразитарной обработки при эхинококкэктомии // 2238562

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к хирургии и паразитологии

Способ подбора антибиотиков для лечения больных ортопедо- травмотологического профиля // 2237896

Изобретение относится к области медицины

Конъюгат 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)-бутен-1-ил] феноксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения диэтилстильбестрола // 2218352

Изобретение относится к коньюгату 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)бутен-1-ил] феноксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином общей формулы (I), полученному путем превращения 4-[1-этил-2(4-гидроксифенил)бутен-1-ил] феноксиуксусной кислоты в активированный эфир с помощью карбодиимида или в смешанный ангидрид с изобутилхлоркарбонатом, с последующим амидированием указанными промежуточными соединениями бычьего сывороточного альбумина

Конъюгат [19-нор-17-этинил-17-гидрокси-прегна-1,3,5(10) триен-3-ил]оксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином для иммунохимического способа определения этинилэстрадиола // 2218351

Изобретение относится к коньюгату [19-нор-17-этинил-17-гидрокси-прегна-1,3,5(10)триен-3-ил] оксиуксусной кислоты с бычьим сывороточным альбумином общей формулы (I), полученному путем обработки этинилэстрадиола этиловым эфиром бромуксусной кислоты в присутствии щелочи и превращения [19-нор-17-этинил-17-гидрокси-прегна-1,3,5(10)триен-3-ил] оксиуксусной кислоты в смешанный ангидрид, используя изобутилхлоркарбонат, с последующим амидированием бычьего сывороточного альбумина указанным ангидридом

Способ получения раствора альбумина // 2205020

Изобретение относится к медицинской промышленности

Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии // 2274471

Изобретение относится к препаративной биохимии, фармакологии, медицине

Способ получения ветеринарного альбумина // 2286350

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в научно-исследовательских биохимических лабораториях при получении альбумина по промышленной технологии

Штамм дрожжей pichia pastoris х-33/2albumin для секреции человеческого альбумина // 2306333

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к штамму дрожжей, модифицированному введением чужеродного генетического материала

Препарат рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина и способ его получения // 2337966

Изобретение относится к области биотехнологии и препаративной биохимии и может быть использовано в биофамакологии и медицине

Слитые белки альбумина // 2369404

Изобретение относится к слитым белкам альбумина

Способ получения конъюгата нона- -(1 3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом // 2476444

Изобретение относится к области биохимии

Полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3, конъюгированные с вариантом челевеческого сывороточного альбумина (hsa), и их фармацевтические применения // 2547592

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, и может быть использовано в медицине. Получают полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, конъюгированной на N-конце посредством линкерной аминокислотной последовательности, содержащей комбинацию аминокислот глицина и серина, с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA) с SEQ ID NO:4. Изобретение позволяет повысить эффективность терапии заболеваний, связанных с интегрином αvβ3. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 7 пр.

Варианты альбумина // 2607374

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вариантов альбумина, у которых изменен период полужизни в плазме по сравнению с исходным альбумином, и может быть использовано в медицине. Получают вариант альбумина, содержащий одну или несколько замен относительно SEQ ID NO: 2, выбранных из следующих: 1) E492A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R; 2) K500I, R; 3) N503H; 4) E505Q; 5) H510D; 6) D550E, H, I, M, N, R, S, W; 7) K573A, C, D, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, V, W, Y; 8) K574D, F, G, H, I, L, M, P, R, S, T, V, W, Y; 9) A578F; 10) S579C; 11) Q580I, K, M, R, V; или 12) G584D. Изобретение позволяет получить вариант альбумина или его фрагмент, обладающий способностью связываться с FcRn, или химерный полипептид, включающий указанный вариант альбумина или его фрагмент, имеющий увеличенный период полужизни в плазме или увеличенную аффинность связывания с FcRn по сравнению с исходным альбумином, его фрагментом или химерным полипептидом. 6 н. и 4 з.п. ф-лы., 32 ил., 22 табл., 22 пр.