Усовершенствованный способ получения нуклеината натрия

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения нуклеината натрия из хлебопекарных дрожжей. Нуклеиновые кислоты извлекают из биомассы в присутствии сохраняющего вещества - пероксида водорода при низкой концентрации. Полученный экстракт обрабатывают протеолитическим ферментом, осаждают РНК кислотой в присутствии соли кальция. Очистку продукта проводят водными растворами ацетона и хлоридов кальция и натрия. Затем очистку нуклеината натрия осуществляют водно-ацетоновым раствором в присутствии активированного угля. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта и улучшить его качество.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения медицинских препаратов.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, включающий обработку дрожжей в водной среде при 100-110°С, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты (РНК) от дрожжевого шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением едкого натра и осаждение из раствора рибонуклеината натрия этиловым спиртом (см. Пояснительную записку к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11).

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, использование вредных веществ при очистке (диэтиловый эфир) и невысокое качество продукта, имеющего серовато-желтый цвет и высокое содержание белков.

Известен также способ получения нуклеината натрия, включающий экстракцию РНК из дрожжей 10-12%-ным раствором хлористого натрия при 100-110°С, отделение раствора РНК от дрожжевого шлама, осаждение РНК соляной кислотой, промывку выпавшей в осадок РНК этиловым спиртом, ее сушку, очистку от пигментов и белков при растворении РНК в воде и доведении рН до 8,0-8,2 добавлением едкого натра, добавление к раствору панкреатина и выдерживание около часа при 37-40°С. Осаждение нуклеиновой кислоты проводят охлажденным и подкисленным соляной кислотой до рН 1-2 этиловым спиртом, после чего проводят фильтрацию осадка, промывку этиловым спиртом, растворение в воде с добавлением гидроокиси натрия, осаждение нуклеината натрия из полученного раствора этиловым спиртом с последующей фильтрацией осадка, промывкой этиловым спиртом и сушкой (Земсков В.М. и др., Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. Рига, Зинатне, 1985, с.7-8).

Недостатком этого способа является сложность его осуществления и невысокое качество конечного продукта.

Наиболее близким к заявляемому по своей технической сущности является способ получения рибонуклеината натрия, включающий экстракцию рибонуклеиновой кислоты (РНК) из биомассы дрожжей водным щелочным раствором при рН 7,0-9,5 при температуре 60-110°С, отделение биомассы, обработку экстракта протеолитическим ферментом, отделение скоагулированных примесей, осаждение РНК в виде кальциевой соли, отделение от раствора, перевод кальциевой соли в свободную рибонуклеиновую кислоту действием минеральной кислоты, переведение в натриевую соль щелочью, осаждение натриевой соли этиловым спиртом. (Патент RU №2081915, С 12 Р 19/34, 20.06.97).

Недостатком данного способа является низкий выход и недостаточная чистота нуклеината натрия.

Задачей изобретения является увеличение выхода и повышения качества нуклеината натрия.

Сущность изобретения заключается в следующем:

Способ получения нуклеината натрия включает экстракцию РНК из биомассы дрожжей щелочным водным раствором, обработку экстракта протеолитическим ферментом, коагуляцию и отделение скоагулированных примесей, осаждение РНК минеральной кислотой, доочистку от водорастворимых биокомпонентов клеток, переведение РНК в растворимую натриевую соль, окончательную доочистку с последующим выделением целевого продукта из водноорганической среды и отличается от известных ранее способов тем, что:

- биомассу дрожжей предварительно обрабатывают водным раствором пероксида водорода с концентрацией 0,01-0,1% при температуре 10-40°С;

- осаждение рибонуклеиновой кислоты проводят минеральной кислотой в присутствии шестиводного хлорида кальция в количестве 20-45 г/л;

- доочистку от водорастворимых биокомпонентов клеток осуществляют очищенной водой в присутствии хлорида натрия в количестве 20-40 г/л и хлорида кальция в количестве 1,5 г/л (в пересчете на безводную соль);

- осажденную рибонуклеиновую кислоту обрабатывают водно-ацетоновой смесью в соотношении вода: ацетон от 1:1 до 1:4;

- окончательную доочистку проводят из водно-ацетоновой среды при концентрации органического растворителя от 20 до 50% объемных при температуре 45±5°С в присутствии активированного угля в количестве 0,5-2,0%.

Согласно изобретению для подавления активности клеточных ферментов, разрушающих РНК в растворе, биомассу дрожжей обрабатывают разбавленным раствором пероксида водорода, для достижения полноты осаждения рибонуклеиновой кислоты неорганической кислотой и отделения основной массы белковых примесей процесс проводят в присутствии хлорида кальция, для предотвращения процесса “плавления” рибонуклеиновой кислоты отмывку ее от водорастворимых биокомпонентов клеток осуществляют в присутствии хлорида натрия, хлорида кальция и ацетона, для окончательной очистки продукта примеси осаждают из водно-органической среды в присутствии активированного угля, количество органического растворителя в водно-органической среде и количество угля зависят от качества дрожжей.

Изобретение позволяет увеличить выход нуклеината натрия от 10 до 100%. Полученный продукт полностью соответствует требованиям ФС 42-1781-97, цвет продукта белый без явного оттенка, имеет улучшенные показатели по прозрачности водного раствора.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1.

200 г исходного сырья, в качестве которого используют обязательно свежие хлебопекарные дрожжи, суспендируют в одинаковом по массе количестве очищенной воды до получения однородного раствора, медленно при перемешивании вносят концентрированный раствор пероксида водорода до получения концентрации 0,1% в расчете на добавленную воду, 6,8 г хлорида натрия, устанавливают температуру 40-45°С, перемешивают в течение 15-20 минут, устанавливают рН 8,5-9,0 добавлением натриевой щелочи, нагревают до температуры 85-90°С, перемешивают 30 минут, охлаждают и отделяют биомассу. Затем рН фугата доводят до 6,9-7,2, прибавляют протосубтилин из расчета 0,05% и перемешивают 1 час при 50°С. После этого рН снижают до 4,0±0,05 и выдерживают 10 минут при 80-95°С. Скоагулированный осадок отделяют. Фугат охлаждают до температуры 18-25°С, при перемешивании добавляют хлорид кальция шестиводного из расчета 45 г/л и перемешивают 80 минут. После этого рН раствора снижают до значения 1,5 соляной кислотой. При этом наблюдается коагуляция и быстрое осаждение РНК. Раствор максимально декантируют, а к осадку приливают предварительно охлажденную до температуры 2±2°С очищенную воду, содержащую 3,0 г/л шестиводного хлорида кальция и 40 г/л хлорида натрия и имеющую рН 1,8-2,0 из расчета 3 объема на объем суспензии. Полученную смесь перемешивают 3-5 минут, осадку дают полностью осесть, затем раствор с осадка декантируют. Процесс промывки осадка повторяют, но не вводят в промывной раствор соль кальция. К суспензии после декантации приливают ацетон, равный объему суспензии, перемешивают 5-10 минут и отделяют осадок доступным методом.

Влажную пасту суспендируют в 100 мл очищенной воды, добавляют 2,2 г хлорида натрия, доводят рН до 4,9-5,1 раствором гидроксида натрия, перемешивают при комнатной температуре 10-20 минут, доводят температуру до 40-45°С и устанавливают рН 6,0-6,2, перемешивание продолжают до полного растворения осадка, раствор на 3-5 минут нагревают до 78-80°С и охлаждают до 36-40°С. К раствору при перемешивании приливают ацетон до образования хлопьевидного осадка (20-50% объемных), добавляют активированный уголь марки CXV в количестве 0,5% от объема водной части раствора, перемешивают 20 минут и фильтруют. Получают бесцветный прозрачный раствор нуклеината натрия. Раствор охлаждают до 2-5°С и при перемешивании добавляю ацетон, охлажденный до такой же температуры, в количестве, равном объему раствора. Не ранее, чем через 30 минут образовавшийся осадок отделяют от раствора, последовательно промывают спиртом и ацетоном и сушат при температуре 20-25°С до удаления паров ацетона и затем в сушильном шкафу при температуре 36-40°С до уровня влажности не более 14%. Получают белый сыпучий порошок.

- Выход целевого продукта, полученного по патенту №2081915, - 0,61 г. Цвет соли - белый с серым оттенком, водный раствор опалесцирует.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1 - 1,30 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но концентрация пероксида водорода 0,01% при температуре 10°С - 0,70 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях предыдущего опыта, но при температуре 40°С - 0,80 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но на стадии осаждения РНК концентрация хлорида кальция шестиводного 20 г/л - 0,90 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но доочистку проводят при концентрации хлорида натрия 20 г/л - 1,00 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но осажденную РНК обрабатывают водно-ацетоновой смесью 1:4 - 1,31 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но осажденную РНК обрабатывают водно-ацетоновой смесью 1:0,5 - 1,15 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

- Выход целевого продукта в условиях Примера 1, но окончательную очистку РНК проводят в присутствии 2% активированного угля - 1,20 г. Цвет соли белый, водный раствор прозрачный, бесцветный.

Способ получения нуклеината натрия, включающий экстракцию РНК из биомассы дрожжей щелочным водным раствором, обработку экстракта протеолитическим ферментом, отделение скоагулированных примесей, осаждение РНК, доочистку от водорастворимых биокомпонентов клеток, перевод РНК в растворимую натриевую соль, окончательную очистку с последующим выделением целевого продукта органическим растворителем, отличающийся тем, что биомассу дрожжей предварительно обрабатывают водным раствором пероксида водорода, осаждение РНК проводят минеральной кислотой в присутствии соли кальция, доочистку от водорастворимых биокомпонентов клеток проводят водными растворами ацетона и хлоридов кальция и натрия, а окончательную очистку осуществляют водно-ацетоновым раствором в присутствии активированного угля.