Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве лечебно-профилактических препаратов, активных в отношении Neisseria meningitidis. В изобретении представлена группа белков нейссерий, проявляющих свойства антигена. Белок со свойствами антигена включает фрагмент белка ORF 40 (аминокислотная последовательность (АП) ORF 40 приведена в формуле), который включает 7 или более расположенных подряд консервативных аминокислот. Белки, входящие в заявленную группу белков, используют в качестве лекарственного средства или для его производства для лечения и профилактики инфекции, вызванной нейссерией, а также для производства диагностического препарата. Изобретение охватывает и нуклеиновую кислоту (Н.К.), кодирующую белок Neisseria. Н.К. используется аналогично белку. Использование изобретения обеспечивает максимальную распознаваемость и реактивность между штаммами нейссерий. 5 н. и 22 з.п. ф-лы, 20 ил., 7 табл.

 

Содержание всех цитируемых в данном тексте документов в полном объеме включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается консервативных антигенов бактерий рода Neisseria.

Предпосылки

Бактерии Neisseria meningitidis (менингококк) и Neisseria gonorrhoeae (гонококк) являются неподвижными грам-отрицательными диплококками, патогенными для человека.

Исходя из параметров полисахаридов, составляющих оболочку менингококка, было идентифицировано 12 серогрупп N. meningitidis. Группа А включает патоген, который в основном связан с эпидемическими формами заболевания в присахарских областях Африки. Серогруппы В и С связаны с подавляющим большинством случаев менингита в США и большинстве развитых стран. Серогруппы W135 и Y связаны с остальными случаями в США и развитых странах.

В настоящее время в качестве менингококковой вакцины применяется тетравалентная полисахаридная вакцина, содержащая серогруппы А, С, Y и W135. Однако данный подход не может быть применен в отношении менингококка - В из-за того, что оболочечный полисахарид men B является полимером α(2-8)-сшитой N-ацетилнейраминовой кислоты, которая также присутствует в тканях млекопитающих. В одном из подходов к созданию вакцин к men B используют смеси белков внешней мембраны (ОМР). Для преодоления антигенной изменчивости были созданы поливалентные вакцины, содержащие вплоть до девяти разных белков [например, Poolman, 1992, "Development of a meningococcal vaccine". Infect. Agents Dis., 4, 13-28]. Дополнительными белками, предназначенными для использования в вакцинах с белками внешней мембраны, являлись белки ора и орс, однако ни один из указанных подходов не смог преодолеть антигенную изменчивость [например, Ala’Aldeen & Borriello, 1996, "The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains", Vaccine, 14 (1), 49-53].

Большое число белковых и нуклеотидных последовательностей нейссерий описано в международных патентных заявках WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 и WO 00/22430. Содержание указанных четырех заявок включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки. Соответствующие данные по последовательностям штамма МС 58 опубликованы у Tettelin et al., 2000, Science, 287, 1809-1815: содержание чего также включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки.

Описание изобретения

Для обеспечения максимальной распознаваемости и реактивности между штаммами могут быть использованы участки белков, которые консервативны у разных видов, серогрупп и штаммов нейссерий. Таким образом, настоящее изобретение представляет белки, включающие участки аминокислотной последовательности, которые являются общими для большинства Neisseria, в частности, для N.meningitidis и N.gonorrhoeae.

Изобретение представляет белок, включающий фрагмент белка нейссерий, причем упомянутый фрагмент состоит из “n” непрерывных консервативных аминокислот, при условии, что изобретение не охватывает своим объемом полноразмерные белки нейссерий. В зависимости от конкретного белка n равно 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или больше). Предпочтительно фрагмент включает антигенный или иммуногенный сегмент белка нейссерий.

“Консервативной” является аминокислота, которая присутствует в конкретном белке нейссерий, по крайней мере, у х% всех Neisseria. Величина х может составлять 50% или больше, например, 66%, 75%, 80%, 90%, 95% или даже 100% (т.е. аминокислота обнаруживается в анализируемом белке у всех Neisseria).

С целью определения того, является ли аминокислота “консервативной” в конкретном белке нейссерий, необходимо сравнить такой аминокислотный остаток в последовательностях анализируемого белка от множества разных Neisseria (“референсная популяция”). Референсная (контрольная) популяция может включать ряд разных видов рода Neisseria (предпочтительно N.meningitidis и N.gonorrhoeae) или может включать единственный вид. Референсная популяция может включать ряд различных серогрупп конкретного вида (таких, как серогруппы А, В, С, W135, X, Y, Z и 29Е менингококка N.meningitidis) или единственную серогруппу. Также референсная популяция может охватывать ряд разных штаммов конкретной серогруппы (таких, как штаммы NG6/88, BZ198, NG3/88, 297-0, BZ147, BZ169, 528, BZ133, NGE31, NGH38, NGH15, BZ232, BZ83 и 44/76 менингококка-В). Предпочтительная референсная популяция состоит из пяти самых обычных штаммов N.meningitidis и/или пяти наиболее обычных штаммов N.gonorrhoeae.

Предпочтительно референсная популяция включает “k” штаммов, происходящих от “k” разных ветвей соответствующего филогенетического древа, такого, как филогенезы, описанные у (a) Ni et al., 1992, Epidemiol. Infect., 109, 227-239; (b) Wolff et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4657; (c) Bygraves & Maiden, 1992, J. Gen. Microbiol., 138, 523-531; (d) Caugant et al., 1987, J. Bacteriol., 69, 2781-2792. Другое филогенетическое древо, которое может быть использовано, показано в данном тексте на фигуре 8, а еще одно - на фигуре 9b.

Должно быть понятно, что конкретные вид, серогруппа или штамм должны быть включены в состав референсной популяции, если только они кодируют белок, в котором имеется анализируемая аминокислота. Например, в случае аминокислот в пределах ORF40, описанного далее, референсная популяция не должна включать N.gonorrhoeae потому, что данный вид лишен ORF40.

Следовательно, для белков, обнаруживаемых и у N.meningitidis, и у N.gonorrhoeae, предпочтительная референсная популяция включает:

- N.meningitidis А, штамм Z2491;

- N.meningitidis В, штаммы NG6/88;

- N.meningitidis W, штаммы А22;

- N.gonorrhoeae, штамм Ng F62.

Указанное описано у (a) A.Seiler et al., 1996, Mol. Microbiol., 19 (4), 841-856; (b) Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3140-3145; (с) Virji et al., 1992, Mol. Microbiol., 6, 1271-1279; (d) Dempsey et al., 1991, J. Bacteriol., 173, 5476-5486.

Для белков, обнаруживаемых только у N.meningitidis, однако, предпочтительная референсная популяция включает:

- N.meningitidis А, штамм Z2491;

- N.meningitidis В, штаммы NG6/88;

- N.meningitidis W, штаммы А22.

Аминокислотные последовательности различных Neisseria легко могут быть подвергнуты сравнению с помощью компьютерных программ. Обычно они должны включать сопоставление ряда последовательностей с использованием такого алгоритма, как CLUSTAL [Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680; Trends Biochem. Sci., 1998, 23, 403-405] или, предпочтительно, PILEUP [элемент пакета программ группы GCG из Висконсинского университета: предпочтительна версия 9.0].

Консервативные аминокислоты легко выявляются при множественном сопоставлении последовательностей: в анализируемом аминокислотном положении в сопоставляемых последовательностях должна находиться конкретная аминокислота. Консервативные аминокислоты могут быть более эффективно выявлены с использованием такой программы, как BOXSHADE [доступна, например, в режиме “on-line” от NIH], PRETTYBOX (GCG Wisconsin, vers. 10] или JALVIEW [доступна от EBI в режиме “on-line”].

Предпочтительно белок включает фрагмент одного из белков, описанных в международных патентных заявках WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 или WO 00/22430, или одной из 2158 кодирующих рамок ORF, описанных у Tettelin et al., 2000, Science, 287, 1809-1815. Более конкретно, предпочтительно он включает фрагмент одного или нескольких из ORF4, ORF40, ORF46, белка 225, белка 235, белка 287, белка 519, белка 726, белка 919 и белка 953, описанных в указанных материалах (см. приведенные в данном тексте примеры). Обычно белок по настоящему изобретению не должен включать белковую последовательность, описанную в качестве примеров в WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 00/22430 или у Tettelin et al.

Также настоящее изобретение представляет белок, включающий одну из последовательностей, показанных на фигурах.

Понятно, что белки по настоящему изобретению могут быть получены различными способами (например, с помощью рекомбинантной экспрессии, нативной экспрессии, очистки из клеточной культуры, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, нативной, в виде химер и т.п.). Предпочтительно их получают в существенно чистой форме (т.е. по существу свободными от других белков нейссерий или белков клетки-хозяина).

В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет антитела, которые связываются с указанными белками. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены с помощью любого подходящего способа.

Согласно следующему аспекту изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую белки по настоящему изобретению. Также должно быть понятно, что изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, комплементарные указанному (например, для антисмысловых конструкций и зондов).

Более того, изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая способна гибридизовать с нуклеиновой кислотой N.meningitidis, описанной в примерах, предпочтительно в условиях “высокой степени жесткости” (например, 65°С в растворе 0,1×SSC, 0,5% ДСН).

Понятно, что нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена различными путями (например, с помощью химического синтеза, из состава геномных или кДНК библиотек, из самих организмов и т.п.) и может принимать различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, векторную, форму зонда и т.п.).

Кроме того, понятие “нуклеиновая кислота” охватывает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие, как молекулы, включающие модифицированный скелет, а также нуклеопротеины (НКП) и т.п.

В соответствии со следующим аспектом изобретение представляет векторы, включающие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению (например, экспрессирующие векторы) и трансформированные ими клетки-хозяева.

В соответствии с другим аспектом изобретение представляет композиции, содержащие белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть пригодными в качестве, например, вакцин или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Также изобретение представляет нуклеиновую кислоту, белок или антитело по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Также оно предусматривает использование нуклеиновой кислоты, белка или антитела по настоящему изобретению в производстве: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для выявления присутствия бактерий Neisseria или антител, сформированных в отношении бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который способен формировать антитела, специфичные в отношении бактерий Neisseria. Указанное использование предпочтительно применимо для всех видов Neisseria.

Когда белок нейссерии включает более чем q% консервативных аминокислот, изобретение представляет использование белка нейссерии или его фрагмента в качестве неспецифичного по конкретному штамму белка, который проявляет перекрестную реактивность между многими видами, серогруппами и штаммами. Величина q может составлять 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.

Также изобретение представляет способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела по настоящему изобретению.

В соответствии со следующим аспектом изобретение представляет различные способы.

Представляется способ выработки белков по настоящему изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, которые индуцируют экспрессию белка.

Представляется способ выработки белка или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, причем белок или нуклеиновая кислота синтезируют отчасти или полностью с применением химических методов.

Представляется способ выявления полинуклеотидов по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование с биологическим образцом нуклеотидного зонда в соответствии с настоящим изобретением в условиях для гибридизации с образованием дуплексов; и (b) выявление упомянутых дуплексов.

Представляется способ выявления белков по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование антитела по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов “антиген-антитело”; и (b) выявление упомянутых комплексов.

Далее обобщаются стандартные методы и процедуры, которые могут быть использованы с целью осуществления настоящего изобретения (например, с целью использования заявленных последовательностей для вакцинации или в диагностических целях). Указанное обобщение не является ограничением для изобретения, но, напротив, дает примеры того, что может быть использовано, не являясь при этом обязательным.

Общие замечания

В практике настоящего изобретения должны быть использованы, если это специально не оговаривается, стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью охарактеризованы в литературе, например, у Sambrook, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d Edition; "DNA Cloning" Volumes 1 and 2 (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); "TRanscription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, 1984, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; периодические выпуски "Methods in Enzymology" (Academic Press Inc.), в частности, тома 154 и 155; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.H. Miller & M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer & Walker eds., 1987, "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, 1987, "Protein Purification: Principles and Practice", 2d Edition (Springer-Verlag, NY) ; и "Handbook of Experimental Immunology", Volumes 1-4 (D. M. Weir & C.C. Blackwell eds., 1986).

В настоящей заявке для нуклеотидов и аминокислот используются стандартные аббревиатуры.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном тексте, в полном объеме включены в качестве оиблиографических ссылок. В частности, содержание международных патентных заявок WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 и WO 00/22430 включено здесь для сведения.

Определения

Композиция, содержащая X, “в существенной степени свободна от Y” тогда, когда, по крайней мере, 85% по массе от суммы X+Y в композиции приходится на долю X. Предпочтительно Х составляет, по крайней мере, примерно 90% по массе от общего количества X+Y в данной композиции, более предпочтительно, - по крайней мере, примерно 95% или даже 99% по массе.

Термин “содержащий” соответствует как понятию “включающий”, так и “состоящий”: например, композиция, “содержащая” X, может состоять только из Х или может включать (содержать) нечто дополнительное к X, например, X+Y.

Термин “гетерологичный” относится к двум биологическим компонентам, которые не встречаются вместе в природе. Такими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные сегменты, такие, как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты в природе вместе не обнаруживаются, они могут обладать совместной функциональностью, например, когда промотор, гетерологичный по отношению к гену, функционально с ним соединен. Другим примером является такая ситуация, в которой последовательность нейссерии гетерологична по отношению к мышиной клетке-хозяину. Дополнительными примерами могут быть два эпитопа из одного и того же или из разных белков, которые были собраны в составе общего белка в таком порядке, который отсутствует в природе.

“Сайт начала репликации” обозначает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких, как экспрессирующий вектор. Сайт начала репликации ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке, обеспечивая способность к репликации под собственным контролем. Присутствие сайта начала репликации может быть необходимым для обеспечения репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. При наличии нескольких сайтов начала репликации экспрессирующий вектор может воспроизводиться в большом числе копий в присутствии подходящих белков внутри клетки. Примерами сайтов начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые эффективны в клетках дрожжей, а также вирусные Т-антигены, эффективные в клетках COS-7.

Термин "мутантная" последовательность определяет ДНК, РНК или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или заявленной последовательности, но имеющую сходство с ней. В зависимости от конкретной последовательности уровень идентичности при сравнении нативной или заявленной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше, что подсчитывают с помощью алгоритма Смита-Уотермана в соответствии с описанным выше). По использованию в данном тексте термин “аллельный вариант” молекулы нуклеиновой кислоты или участка, для которого здесь представляется нуклеотидная последовательность, является молекулой нуклеиновой кислоты или сегментом, который находится в том же самом локусе конкретного генома другого или второго изолята, при том, что, вследствие естественной изменчивости, обусловливаемой, например, мутационным или рекомбинационным процессом, характеризуется сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью. Кодирующий сегмент аллельного варианта обычно кодирует белок, обладающий сходным уровнем активности по сравнению с таковым у белка, кодируемого тем геном, с которым проводится данное сравнение. Аллельный вариант также может включать изменения в 5’- или 3’-нетранслируемых участках конкретного гена, таких, как регуляторные сегменты (см., например, патент США №5753235).

Экспрессионные системы

Нуклеотидные последовательности Neisseria могут быть экспрессированы в ряде различных экспрессионных систем: например, для этой цели используются клетки млекопитающих, бакуловирусы, растения, бактерии и дрожжи.

i. Системы клеток млекопитающих

Экспрессионные системы на основе клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники. Промотором для клеток млекопитающих может служить любая последовательность ДНК, способная связывать РНК - полимеразу млекопитающих, инициируя тем самым транскрипцию нижерасположенной (т.е. в 3’-сторону) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать участок инициации транскрипции, который обычно располагается проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности, а также бокс ТАТА, обычно находящийся в 25-30 парах нуклеотидов (п.н.) выше сайта инициации транскрипции. Считается, что бокс ТАТА обеспечивает контролируемое РНК - полимеразой 2 начало синтеза РНК в правильном сайте. Промотор клеток млекопитающих также должен включать расположенный выше собственно промоторный элемент, обычно находящийся в 100-200 п.н. выше бокса ТАТА. Верхний промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может быть активен в любой ориентации [Sambrook et al., 1989, "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed.].

Гены вирусов млекопитающих обычно характеризуются интенсивной экспрессируемостью и широким кругом хозяев; следовательно, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, являются перспективными для применения в качестве промоторных последовательностей. Примерами являются промотор ранних генов вируса SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, промотор главного позднего гена аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, производные от невирусных генов, таких, как ген металлотионеина мыши, также являются применимыми промоторными последовательностями. Экспрессия может быть как конститутивной, так и регулируемой (индуцибельной), и в зависимости от промотора может быть индуцирована глюкокортикоидами в чувствительных к гормону клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с промоторными элементами, описанными выше, обычно должно усиливать экспрессию. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию до тысячекратного усиления в случае соединения с гомологичными или гетерологичными промоторами, при том, что синтез РНК начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры также активны тогда, когда они помещаются или выше, или ниже сайта инициации транскрипции, как в нормальной, так и в инвертированной ориентации, или на расстоянии даже больше 1000 п.н. от промотора [Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237; Alberts et al., 1989, "Molecular Biology of the Cell", 2d ed.]. В частности, могут быть использованы энхансерные элементы, происходящие от вирусов, поскольку они обычно характеризуются более широким кругом хозяев. Примерами являются энхансер раннего гена вируса SV40 [Dijkema et al., 1985, EMBO J., 4, 761] и система “энхансер + промотор”, производная от участка длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса [German et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 6777] и цитомегаловируса человека [Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого, как гормон или ион металла [Sassone-Corsi & Borelli, 1986, Trends Genet., 2, 215; Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237].

Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток млекопитающих. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая с N-конца аминокислота в составе рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, N-концевая часть может быть отщеплена от белка путем инкубации in vitro с бромцианом.

Альтернативно, чужеродные белки также могут секретироваться из клетки непосредственно в питательную среду в результате создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий лидерный (сигнальный) сегмент, обеспечивающий секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих. Предпочтительным является наличие сайтов процессинга между лидерным сегментом и чужеродным геном, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Лидерная последовательность обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот и обеспечивающий секрецию белка из клетки. Аденовирусный трехраздельный лидерный сегмент является примером лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих.

Обычно последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными сегментами, расположенными с 3’-стороны от стоп - кодона, т.е., наряду с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3’-Конец зрелой мРНК образуется в результате сайт - специфичного посттранскрипционного расщепления и полиаденилирования [Birnstiel et al., 1985, Cell, 41, 349; Proudfoot & Whitelaw, 1988, "Termination and 3’ end processing of eukaryotic RNA", In "Transcription and splicing", ed. B.D. Hames & D.M. Glover; Proudfoot, 1989, Trends Biochem. Sci., 14, 105]. Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый исходной ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции и полиаденилирования являются мотивы, происходящие из SV40 (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"].

Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, встраивают в состав экспрессирующих конструкций одновременно. Энхансеры, интроны, включающие функциональные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если это является желательным. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, т.е. внехромосомного элемента (например, плазмиды), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком, как клетка млекопитающего или бактерия. Репликационные системы для млекопитающих включают системы, происходящие от вирусов животных, для репликации которых необходимо участие транс-регулирующих факторов. Например, плазмиды, включающие репликационные системы паповавирусов, таких, как SV40 [Gluzman, 1981, Cell, 23, 175], или полиомавирусов, реплицируются в исключительно большом числе копий в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительными примерами репликонов для клеток млекопитающих являются репликоны, происходящие от бычьего папилломавируса и вируса Эпштейна - Барр. Кроме того, такой репликон может нести две репликационные системы, что тем самым обеспечивает возможность поддержания их, например, в клетках млекопитающих с целью экспрессии и в прокариотических клетках с целью клонирования и амплификации. Примерами таких бифункциональных векторов для млекопитающих/бактерий являются векторы рМТ2 [Kaufman et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 946] и рНЕВО [Shimizu et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 1074].

Выбор используемых процедур трансформации зависит от вида организма - хозяина, который будет трансформирован. Способы внесения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают опосредуемую декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкпсулирование полинуклеотидов в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра.

Линии клеток млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для целей экспрессии, хорошо известны в данной области техники и включают большое число иммортализованных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но тем самым не ограничиваясь, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa человека, клетки почек новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки зеленой мартышки (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, Hep G2) и множество других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, также может быть встроен в подходящий экспрессирующий вектор для клеток насекомых: его функциональным образом соединяют с регуляторными элементами в составе такого вектора. При конструировании вектора используют методы, хорошо известные в данной области техники. В целом, компонентами экспрессионной системы являются транспортный вектор, обычно являющийся бактериальной плазмидой, который включает фрагмент бакуловирусного генома и подходящий рестрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичного гена или генов, которые будут экспрессироваться; бакуловирус дикого типа, имеющий последовательность, которая гомологична специфичному для бакуловирусов фрагменту транспортного вектора (это обеспечивает гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); и подходящие клетки-хозяева насекомого и культуральная среда.

После внесения в состав транспортного вектора последовательности ДНК, кодирующей белок, данный вектор и вирусный геном дикого типа трансфецируют в клетку-хозяина насекомого, в которой вектор и вирусный геном могут рекомбинировать. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, а рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и методы для конструирования экспрессионных систем “бакуловирус/клетки насекомых” имеются в продаже в виде специальных наборов, помимо прочего, у фирмы Invitrogen, San Diego, СА (набор "Мах-Вас kit"). Названные методы в целом известны специалистам в данной области техники и подробно охарактеризованы в руководстве Саммерса и Смита (Summers & Smith, 1987, Texas Agricult. Exper. Stat. Bull., №1555) (здесь и далее цитируется как "Summers & Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей белок, в состав бакуловирусного генома, описанные выше компоненты, включая промотор, лидерный сегмент (если он желателен), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно компонуют в промежуточную переносящую конструкцию (транспортный вектор). Такая конструкция может включать единственный ген и функционально присоединенные к нему регуляторные элементы; или множественные гены, каждый из которых имеет “собственный” комплект функционально присоединенных регуляторных элементов; или множественные гены, находящиеся под контролем того же набора регуляторных элементов. Промежуточные переносящие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого, как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком, как бактерия. Такой репликон должен включать репликационную систему, что тем самым обеспечит поддержание в подходящем организме-хозяине с целью клонирования и амплифицирования.

В настоящее время наиболее распространенным транспортным вектором для внесения чужеродных генов в AcNPV является рАс 373. Также были сконструированы и многие другие векторы, известные специалистам в данной области техники. Они включают, например, pVL985 (в котором изменяется старт-кодон гена полигедрина с ATG на АТТ и который вносит клонирующий BamHI-сайт в 32 парах нуклеотидов ниже кодона АТТ: см. Luckow & Summers, 1989, Virology, 17, 31).

Обычно плазмида также включает сигнал полиаденилирования гена полигедрина (Miller et al., 1988, Ann. Rev. Microbiol., 42, 177), прокариотический ген резистентности к ампициллину (аmр) и точку начала репликации, необходимые для отбора и воспроизведения в клетках E.coli.

Бакуловирусные транспортные векторы обычно включают бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор - это любая последовательность ДНК, способная связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию нижерасположенной кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлении 5’→3’ с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности. Данный участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК - полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный транспортный вектор также может включать второй домен, определяемый как “энхансер”, который, если присутствует, обычно находится на расстоянии от структурного гена. Экспрессия может быть либо контролируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, интенсивно транскрибируемые на поздних этапах вирусного инфекционного цикла, позволяют выделить конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются последовательности, производные от гена, кодирующего вирусный белок - полигедрин (полиэдрин) (Friesen et al., 1986, "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in "The Molecular Biology of Baculoviruses", ed. W.Doerfler; EP №№127839 и 155476), и гена, кодирующего белок р10 (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol., 69, 765).

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть производной от генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, такие, как ген полигедрина бакуловируса (Carbonell et al., 1988, Gene, 73, 409). Как альтернатива, при том, что сигналы посттрансляционных модификаций в клетках млекопитающих (таких, как отщепление сигнального сегмента, протеолитическое расщепление и фосфорилирование), по-видимому, распознаются и клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и накопления в ядре, также, по-видимому, консервативны в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, для обеспечения секреции у насекомых также можно использовать лидерные сегменты, происходящие не от насекомых, такие, как производные от генов, кодирующих α-интерферон человека (Maeda et al., 1985, Nature, 315, 592), рилизинг - фактор гастрина человека (Lebacq-Verheyden et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 3129), интерлейкин-2 человека (Smith et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404), интерлейкин-3 мыши (Miyajima et al., 1987, Gene, 58, 273); и глюкоцереброзидазу человека (Martin et al., 1988, DNA, 7, 99).

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может быть экспрессирован внутриклеточно или, если он экспрессируется с участием соответствующих регуляторных последовательностей, он может секретироваться. Для эффективной внутриклеточной экспрессии нехимерных чужеродных белков обычно нужны гетерологичные гены, которые в идеале включают короткую лидерную последовательность, включающую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие старт - кодону ATG. Если желательно, остаток метионина с N-конца может быть отщеплен от зрелого белка путeм инкубации in vitro с бромцианом.

Как альтернатива, рекомбинантные полипротеины или белки, которые в естественных условиях не являются секретируемыми, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий лидерный сегмент, обеспечивающий секрецию чужеродного белка у насекомых. Лидерная последовательность обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот и обеспечивающий перемещение белка в эндоплазматический ретикулюм.

После встраивания последовательности ДНК и (или) гена, кодирующего экспрессионный продукт, являющийся предшественником белка, клетку-хозяина насекомого одновременно трансформируют гетерологичной ДНК транспортного вектора и геномной ДНК бакуловируса дикого типа, обычно с применением котрансфекционных методов. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно должны включать сегмент бакуловирусного генома длиной 2-5 т.п.н. Способы внесения гетерологичной ДНК по желаемому сайту в состав бакуловируса известны в данной области техники (см. Summers & Smith, цит. выше; Ju et al., 1987; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; Luckow & Summers, 1989). Например, встраивание может быть произведено внутрь гена, такого, как ген полигедрина, для чего используется двойная перекрестная рекомбинация; также встраивание может быть осуществлено по рестрикционному сайту, сконструированному в пределах желательного бакуловирусного гена (Miller et al., 1989, Bioessays, 4, 91). В случае клонирования в состав экспрессирующего вектора последовательности ДНК вместо гена полигедрина, ее фланкируют с обеих сторон (5’ и 3’) последовательностями, специфичными для гена полигедрина, и помещают ниже полигедринового промотора.

Заново сформированный бакуловирусный экспрессирующий вектор последовательно упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит с низкой частотой (от примерно 1% до примерно 5%), поэтому подавляющее большинство продуцируемых в результате котрансфекции вирусов представляет собой вирусы дикого типа. Следовательно, к идентификации рекомбинантных вирусов необходим специальный подход. Преимуществом данной экспрессионной системы является возможность визуального скрининга, позволяющего выявлять рекомбинантные вирусы. Белок полигедрин, продуцируемый вирусами дикого типа, вырабатывается в очень большом количестве в ядрах инфицированных клеток на поздних этапах после инфицирования вирусом. Накапливаемый полигедрин образует тельца включения, которые также содержат погруженные в них частицы. Такие тельца включения размером до 15 мкм интенсивно преломляют свет: это придает им яркое свечение, которое может быть легко выявлено в обычном световом микроскопе. В клетках, инфицированных рекомбинантными вирусами, тельца включения отсутствуют. Для разграничения рекомбинантных вирусов и вирусов дикого типа трансфекционный надосадочный слой вносят на монослойную культуру клеток насекомых с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. А именно бляшки анализируют под световым микроскопом целью выявления присутствия (как признака вируса дикого типа) или отсутствия (как признака рекомбинантного вируса) телец включения ("Current Protocols in Microbiology", Vol. 2, eds. Ausubel et al., раздел 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers & Smith, цит. выше; Miler et al., 1989).

Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были сконструированы с целью инфицирования различных типов клеток насекомых. Например, помимо прочего, рекомбинантные бакуловирусы были сконструированы для: комара Aedes aegypti, совки Autographa californica, тутового шелкопряда Bombyx mori, дрозофилы Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и совки Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., 1985, J. Virol., 56, 153; Wright, 1986, Nature, 321, 718; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; как обзор см. Fraser et al., 1989, In Vitro Cell. Develop. Biol., 25, 225).

Имеются в продаже клетки и культуральные среды как для прямой, так и химерной экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной/экспрессионной системе; технология культивирования клеток в целом хорошо известна специалистам в данной области техники (см., например. Summers & Smith, цит. выше).

Модифицированные клетки насекомых затем могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая обеспечит стабильное поддержание плазмиды, присутствующей в модифицированном насекомом-хозяине. В случае, когда экспрессируемый ген находится под контролем индуцибельных регуляторов, организм-хозяин может быть выращен при очень высоких плотностях с последующей индукцией экспрессии. Альтернативно, когда экспрессия является конститутивной, искомый продукт будет постоянно экспрессироваться в культуральную среду, а питательная среда при этом должна непрерывно циркулировать, выделяя искомый интересующий продукт и пополняя истощаемую питательную среду. Указанный продукт может быть очищен с помощью таких методов, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.п.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителем; или подобное. Если необходимо, продукт может быть подвергнут дополнительной очистке, чтобы обеспечить удаление по существу любых белков насекомого, которые также секретируются в культуральную среду или появляются после лизиса клеток насекомого, в результате чего обеспечивается получение продукта, который по сути является свободным от клеточного дебриса, например, белков, липидов и полисахаридов.

С целью обеспечения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, производные от полученных трансформантов, инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию последовательности, кодирующей рекомбинантный белок. Такие условия могут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако такие условия легко могут быть подобраны специалистом в данной области техники на основе сведений, известных в данной области техники.

iii Растительные системы

В данной области техники известны многочисленные генетические экспрессионные системы, основанные на культурах растительных клеток и цельных растениях. Примеры таких генетических экспрессионных систем для растительных клеток можно найти в патентах США №№5693506, 5659122 и 5608143. Кроме того, такие примеры генетической экспрессии в культивируемых растительных клетках описаны Ценком (Zenk, 1991, Phytochemistry, 30, 3861-3863). Описания сигнальных пептидов растительных белков можно найти, в дополнение к указанным выше источникам, в работах Vaulcombe et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 209, 33-40; Chandler et al., 1984, Plant Mol. Biol., 3, 407-418; Rogers, 1985, J. Biol. Chem., 260, 3731-3738; Rothstein et al., 1987, Gene, 55, 353-356; Whittier et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15, 2515-2535; Wirsel et al., 1989, Mol. Microbiol., 3, 3-14; Yu et al., 1992, Gene, 122, 247-253. Описание параметров регуляции экспрессии растительных генов с участием фитогормона гибберелловой кислоты - и секретируемых ферментов, индуцируемых гибберелловой кислотой, можно найти у R.L.Jones & J. MacMillin, 1984, "Gibberellins", In "Advanced Plant Physiology", ed. M.B.Wilkins, Pitman Publ. Ltd, London, pp.21-52. Ссылочные материалы, описывающие другие гены, регулируемые с участием метаболических механизмов: Sheen, 1990, Plant Cell, 2, 1027-1038; Maas et al., 1990, EMBO J., 9, 3447-3452; Benkel & Hickey, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 1337-1339.

Обычно с использованием методологий, известных в данной области техники, желательную полинуклеотидную последовательность встраивают в состав экспрессионной кассеты, включающей генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Экспрессионную кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор вместе с последовательностями, расположенными выше и ниже экспрессионной кассеты и пригодными для обеспечения экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности могут иметь плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивать необходимые характеристики вектору, например, способность переносить ДНК из исходного используемого для клонирования организма-хозяина, такого, как бактерия, в желательное растение-хозяин. Базовая бифункциональная (“бактериально-растительная”) векторная конструкция предпочтительно должна включать прокариотическую точку начала репликации, активную в широком круге хозяев, прокариотический селективный маркер и (в случае трансформации бактерий Agrobacterium) последовательности Т-ДНК, что позволит осуществлять перенос генов в геном растений на основе трансформации с помощью Agrobacterium. Когда идентификация гетерологичного гена затруднена, данная конструкция должна предпочтительно также включать ген селективного маркера, пригодного для выявления того, была ли трансформирована растительная клетка. Обзор по селективным маркерам, например, для семейства злаковых, можно найти у Wilmink & Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Rept., 11(2), 165-185.

Также рекомендуется включать последовательности, пригодные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растения. Ими могут быть транспозонные последовательности и подобное, которые связаны с процессами гомологичной рекомбинации, равно как и Ti-последовательности, которые обусловливают случайное встраивание гетерологичной экспрессионной кассеты в геном растения. Подходящими прокариотическими селективными маркерами являются резистентные к антибиотикам, таким, как ампициллин или тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, также могут входить в состав вектора, будучи известными в данной области техники.

Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть включены в состав экспрессионной кассеты, предназначенной для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно используется единственная экспрессионная кассета, хотя возможно использование двух или большего числа таких кассет. Рекомбинантная экспрессионная кассета должна включать в дополнение к последовательности, кодирующей гетерологичный белок, следующие элементы: промоторный сегмент, растительные 5’-нетранслируемые последовательности, инициирующий кодон, присутствие или отсутствие которого зависит от того, имеется ли он в составе анализируемого структурного гена, и последовательности терминации транскрипции и трансляции. Уникальные рестрикционные сайты по 5’- и 3’-концам данной кассеты обеспечивают удобное встраивание в состав исходного вектора.

Гетерологичная кодирующая последовательность может относиться к любому белку по настоящему изобретению. Последовательность, кодирующая интересующий белок, будет кодировать сигнальный пептид, который обеспечит процессинг и перемещение белка, если это необходимо, и, как правило, должна быть лишена любой последовательности, которая бы обусловила связывание желательного белка по настоящему изобретению с мембраной. При том, что в большинстве случаев участок инициации транскрипции будет предназначен для гена, который экспрессируется и переносится в процессе прорастания, путем использования сигнального пептида, обеспечивающего перемещение, также можно обеспечить перемещение желательного белка. В этом случае представляющий интерес белок (белки) будет выводится из клеток, в которых он был экспрессирован: следовательно, он может быть эффективно собран. Обычно секреция в семенах происходит из алейроновой области или щиткового эпителия в эндосперм семени. Хотя нет конкретной необходимости в секреции белка из клеток, в которых он вырабатывался, такой подход облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку окончательная экспрессия желательного генного продукта должна происходить в эукариотической клетке, желательным является определить, не содержит ли какой-либо из участков клонированного гена последовательности, которые могут быть затем утрачены в виде интронов под действием механизма сплайсинга, свойственного организму-хозяину. Если они есть, то с применением метода направленного (сайт-специфичного) мутагенеза указанный “интронный” участок может быть изменен таким образом, чтобы исключить утрату части генетической информации из-за наличия ложно -интронных сигналов (Reed & Maniatis, 1985, Cell, 41, 95-105).

Вектор может быть напрямую микроинъецирован в клетки растений с использованием микропипеток, что обеспечит механический перенос рекомбинантной ДНК (Crossway, 1985, Mol. Gen. Genet., 202, 179-185). Также генетический материал может быть перенесен в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля (Krens et al., 1982, Nature, 296, 72-74). Другим способом внесения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое внедрение мелких шариков или частиц (“микроснарядов”), внутри которых или на поверхности которых находится нуклеиновая кислота (Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73; Knudsen & Muller, 1991, Planta, 185, 330-336 - в этих работах описывается применение метода бомбардировки микрочастицами эндосперма с целью получения трансгенных растений ячменя). Еще одним способом

внесения может быть слияние протопластов с другими компонентами, такими, как миниклетки, клетки, лизосомы или иные способные участвовать в слиянии тельца, имеющие липидную поверхность (Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863).

Вектор также может быть внесен в растительные клетки с применением электропорации (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5824). В указанном способе протопласты растений электропорируют в присутствии плазмид, включающих генную конструкцию. Электрические импульсы, характеризующиеся высоким значением напряженности электрического поля, обратимо “продырявливают” биологические мембраны, обеспечивая тем самым проникновение плазмид внутрь. Электропорированные растительные протопласты возобновляют свою клеточную стенку, делятся и образуют растительные каллюсы.

Все растения, из которых могут быть выделены протопласты с последующим культивированием и получением цельных регенерированных растений, могут быть трансформированы в соответствии с настоящим изобретением таким образом, чтобы затем получить цельные растения, несущие перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, включая, но тем самым не ограничиваясь, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых растений и овощных культур. Некоторыми подходящими растениями, например, являются виды родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Способы регенерации зависят от вида растения, но в целом всегда вначале получают суспензию трансформированных протопластов, несущих копии гетерологичного гена. Потом формируют каллюсные ткани, в которых могут быть индуцированы побеги с последующим формированием корешков на них. Альтернативно, в суспензии протопластов можно индуцировать образование зародышей. Такие зародыши прорастают как обычные зародыши, образуя растения. Культуральные среды обычно должны содержать различные аминокислоты и гормоны, такие, как ауксин и цитокины. Также предпочтительным является добавление в культуральную среду глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корешки в норме развиваются одновременно. Эффективность регенерации будет зависеть от культуральной среды, генотипа растения и от параметров конкретной культуры. Если эти три переменных находятся под контролем, то регенерация оказывается воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культивирования растительных клеток желательный белок по настоящему изобретению может выделяться сам или, альтернативно, такой белок можно экстрагировать из цельного растения. В тех случаях, когда желательный белок по настоящему изобретению секретируется в культуральную среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и беззародышевые “полусемена” или другая растительная ткань могут быть механически разрушены с целью выделения секретируемого белка из клеток и тканей. Полученную смесь можно суспендировать в буферном растворе с целью выделения растворимых белков. Затем для очистки рекомбинантного белка можно использовать стандартные методы выделения и очистки белков. С целью оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка параметры времени, температуры, рН, содержания кислорода и объема могут быть откорректированы с помощью стандартных процедур.

iv Бактериальные системы

Методы экспрессии в бактериальных клетках хорошо известны в данной области техники. Бактериальным промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижерасположенной (в направлении 3') кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. В промоторе должен присутствовать участок инициации транскрипции, обычно находящийся проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности. Данный участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК - полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор также может включать второй домен, называемый “оператором”, который может перекрываться с соседним сайтом связывания РНК - полимеразы, с которого начинается синтез РНК. Оператор обеспечивает негативно регулируемую (т.е. индуцибельную) транскрипцию: репрессорный белок может связываться на операторе, тем самым подавляя транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может иметь место в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких, как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может обеспечиваться последовательностью связывания ген-активирующего фактора: она, если присутствует, находится проксимально (с 5’-стороны) по отношению к последовательности связывания РНК - полимеразы. Примером ген - активирующего белка является катаболический активаторный белок (CAP), который облегчает инициацию транскрипции lac-оперона Escherichia coli (E.coli) [Raibaud et al., 1984, Annu. Rev. Genet., 18, 173]. Таким образом, регуляция экспрессии может быть позитивной или негативной, тем самым усиливая или ослабляя транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, представляют собой особенно полезные промоторные последовательности. Примерами являются промоторные последовательности, происходящие от генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме сахаров, таких, как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al., 1977, Nature, 198, 1056] и мальтоза. Дополнительными примерами являются промоторные последовательности, производные от биосинтетических ферментов, таких, как ферменты биосинтеза триптофана (trp) [Goeddel et al., 1980, Nucl. Acids Res., 8, 4057; Yelverton et al., 1981, Nucl. Acids Res., 9, 731; патент США №4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система β-лактамазы (blа) [Weissmann, 1981, "The cloning of interferon and other mistakes". In "Interferon 3", ed. I.Gresser] и промоторные системы PL λ-фага [Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128] и фага Т5 [патент США №4689406] также применимы в качестве промоторных последовательностей.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут выполнять роль бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного из бактериальных или фаговых промоторов могут быть соединены с оперонными последовательностями другого бактериального или фагового промотора, в результате чего образуется синтетический химерный промотор [патент США №4551433]. Например, промотор tac является химерным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей промотора trp и lac-оперона, которые находятся под контролем lac -peпpeccopa [Amann et al., 1983, Gene, 25, 167; de Boer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 21]. Более того, бактериальный промотор может включать естественно встречающиеся промоторы небактериального происхождения, которые обладают способностью связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Естественно встречающийся промотор небактериального происхождения также можно соединить с совместимой РНК-полимеразой с обеспечением высокого уровня экспрессии некоторых генов в прокариотических клетках. Система “РНК-полимераза/промотор” бактериофага Т7 является примером составной промоторной системы [Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; Tabor et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 1074]. Кроме того, химерный промотор также может состоять из фагового промотора и операторного сегмента генома E.coli (ЕРО-А-0267851).

В дополнение к функциональной промоторной последовательности функциональный сайт связывания на рибосоме также применим для обеспечения экспрессии чужеродных генов у прокариот. У E.coli сайт связывания на рибосоме называют последовательностью Шайна-Дальгарно (SD): она включает старт-кодон (ATG) и последовательность из 3-9 нуклеотидов, расположенную в 3-11 нуклеотидах выше старт-кодона [Shine et al., 1975, Nature, 254, 34]. Последовательность SD, как считается, способствует связыванию мРНК на рибосоме за счeт спаривания оснований последовательности SD и 3’-конца 163-рРНК E.coli [3teitz et al., 1979, "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In "Biological Regulation and Development: Gene Expression", ed. R.F.Goldberger]. Экспрессия эукариотических генов и прокариотических генов со “слабым” сайтом связывания на рибосоме описана у Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in Escherichia coli". In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual".

Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клетки. Промоторную последовательность можно напрямую присоединить к этой молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца всегда должна быть метионином, который кодируется старт - кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца полипептида может быть отщеплен путем инкубации in vitro с бромцианом или путем инкубации in vivo или in vitro с бактериальным ферментом - пептидазой N-концевого метионина (ЕРО-А-0219237).

Химерные белки являются альтернативой прямой экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевой участок эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, соединяют с 5’-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. В результате экспрессии такой конструкции образуется химера (гибрид) двух аминокислотных последовательностей. Например, клеточный ген фага λ может быть соединeн по своему 5’-концу с чужеродным геном с последующей экспрессией в бактерии. Получаемый в результате химерный белок предпочтительно сохраняет в своeм составе сайт для процессинга с участием фермента (фактора Ха), в результате чего происходит отщепление фагового белка от продукта чужеродного гена [Nagai et al., 1984, Nature, 309, 810]. Химерные белки также могут быть сформированы с

использованием последовательностей генов lac Z [Jia et al., 1987, Gene, 60, 197], trp E [Allen et al., 1987, J. Biotechnol., 5, 93; Makoff et al., 1989, J. Gen. Microbiol., 135, 11] и Chey [EP-A-0324647]. Последовательность ДНК в районе соединения двух кодирующих аминокислотных последовательностей может кодировать сайт расщепления, а может и не кодировать его. Другим примером является химерный белок с убихитином. Такой химерный белок конструируют вместе с убихитиновым сегментом, в котором предпочтительно сохранен сайт-мишень для расщепляющего фермента (например, специфичной по процессингу убихитина протеазы), для отщепления убихитина от чужеродного полипептида. С применением такого подхода можно выделять нативный чужеродный белок [Miller et al., 1989, Bio/Technology, 7, 698].

Альтернативно, чужеродные белки также могут быть секретированы клетками за счeт создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий последовательность сигнального пептида, обеспечивающий секрецию чужеродного белка бактериями [патент США №4336336]. Сегмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают секрецию белка из клетки. Такой белок секретируется либо в культуральную среду (для грам - положительных бактерий), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и внешней мембранами клетки (для грам - отрицательных бактерий).

Предпочтительно на участке между сигнальным пептидным сегментом и чужеродным геном присутствуют сайты процессинга, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может происходить от генов, кодирующих секретируемые бактериальные белки, таких, как ген белка внешней мембраны E.coli (ompA) [Masui et al., 1983, in "Experimental Manipulation of Gene Expression"; Ghrayeb et al., 1984, EMBO J., 3, 2437] и сигнальная последовательность гена phoA, кодирующего щелочную фосфатазу E.coli [Oka et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 7212]. В качестве дополнительного примера можно привести сигнальную последовательность гена α-амилазы различных штаммов палочек Bacillus, которая может быть использована для обеспечения секреции гетерологичных белков из клеток B.subtilis [Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, представлены регуляторными сегментами, находящимися с 3’-стороны от стоп - кодона трансляции: соответственно, наряду с промотором они фланкируют кодирующую последовательность. Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый этим участком ДНК. Последовательности терминации транскрипции, как правило, включают последовательности ДНК примерно из 50 нуклеотидов, способные образовывать выпетленные структуры, которые облегчают остановку транскрипции. Примерами являются последовательности терминации транскрипции, производные от генов, имеющих сильные промоторы, таких, как ген trp E.coli, равно как и от других биосинтетических генов.

Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнальную последовательность (если она желательна), интересующую кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, вместе встраивают в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в составе репликона, такого, как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком, как бактерия. Репликон должен включать репликационную систему, которая бы обеспечивала ему способность воспроизводиться в прокариотическом хозяине, предназначенном либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида должна в принципе характеризоваться числом копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Организм-хозяин, несущий высококопийную плазмиду, предпочтительно должен нести, по крайней мере, примерно 10 плазмид, а более предпочтительно, - по крайней мере, примерно 20 плазмид. Высококопийные или низкокопийные векторы могут быть отобраны на основе того влияния, которое вектор и чужеродный белок оказывают на организм-хозяин.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть внесены в бактериальный геном с использованием интегрирующего вектора. Интегрирующие векторы обычно имеют в своем составе, по крайней мере, одну последовательность, гомологичную участку бактериальной хромосомы: это обеспечивает вектору возможность встраиваться. Как считается, такая интеграция обусловливается рекомбинацией между гомологичными участками ДНК в составе вектора и бактериальной хромосомы. Например, интегрирующие векторы, сконструированные на основе ДНК различных штаммов Bacillus, встраиваются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0127328). Интегрирующие векторы также могут включать фаговые или транспозонные последовательности.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут включать селективные маркеры, обеспечивающие отбор бактериальных штаммов, которые были подвергнуты трансформации. Селективные маркеры могут быть экспрессированы в бактериальном организме-хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии резистентными к лекарственным препаратам, таким, как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al., 1978, Annu. Rev. Microbiol., 32, 469]. Селективные маркeры также могут включать биосинтетические гены, такие, как гены ферментов, вовлеченных в биосинтез гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в состав трансформирующих векторов. Трансформирующие векторы обычно включают селективный маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо преобразуется в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы (в виде либо внехромосомных репликонов, либо интегрирующих векторов) были сконструированы для многих видов бактерий. Например, экспрессирующие векторы были созданы, помимо прочего, для следующих видов бактерий: сенная палочка Bacillus subtilis [Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 84/04541], кишечная палочка Escherichia coli [Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128; Amann et al., 1985, Gene, 40, 183; Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; EP-A-0036776, ЕР-А-0136829 и ЕР-А-0136907], стрептококки Streptococcus cremoris [Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655], Streptococcus lividans [Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655], стрептомицет Streptomyces lividans [патент США №4745056].

Способы внесения экзогенной ДНК в бактериальные организмы-хозяева хорошо известны в данной области техники и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных хлористым кальцием или другими агентами, такими, как двухвалентные катионы и диметилсульфоксид. ДНК также может быть внесена в бактериальные клетки методом электропорации. Трансформационные процедуры обычно варьируются в зависимости от вида бактерии, который предстоит трансформировать: см., например, Masson et al., 1989, FEMS Microbiol. Lett., 60, 273; Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 84/04541 (бактерии рода Bacillus), Miller et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 856; Wang et al., 1990, J. Bacteriol., 172, 949 (бактерии рода Campylobacter), Cohen et al., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110; Dower et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 6127; Kushner, 1978, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids". In "Genetic Engineering: Proc. Intern. Symp. Genet. Engineering", eds. H.W.Boyer & S.Nicosia; Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol., 53. 159; Taketo, 1988, Biochim. Biophys. Acta, 949, 318 (Escherichia), Chassy et al., 1987, FEMS Microbiol. Lett., 44, 173 (молочнокислые бактерии рода Lactobacillus), Fiedler et al., 1988, Anal. Biochem., 170, 38 (псевдомонады рода Pseudomonas), Augustin et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 66, 203 (бактерии рода Staphylococcus), Barany et al., 1980, J. Bacteriol., 144, 698; Harlander, 1987, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", in "Streptococcal Genetics", ed. J.Ferretti & R.Curtiss III; Perry et al., 1981, Infect. Immunol., 32, 1295; Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655; Somkuti et al., 1987, Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology, 1, 412 (бактерии рода Streptococcus).

v. Экспрессия в дрожжах

Дрожжевые экспрессионные системы также хорошо известны специалистам в данной области. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижерасположенной (в 3’-направлении) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать участок инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности. Указанный участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы (т.е. “бокс ТАТА”) и собственно сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор также может включать второй домен, называемый “верхней активаторной последовательностью” (UAS), который, когда присутствует, обычно расположен дистально по отношению к структурному гену. Сегмент UAS обеспечивает регулируемую (индуцибельную) экспрессию. Конститутивная экспрессия имеет место при отсутствии сегмента UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, что тем самым либо усиливает, либо ослабляет транскрипцию.

Дрожжи - это организм - ферментeр, характеризующийся активным метаболизмом: поэтому гены, кодирующие ферменты метаболических путей, предоставляют перспективные промоторные последовательности. Примерами являются алкогольдегидрогеназа (ADH) (ЕР-А-0284044), енолаза, глюкокиназа, глюкозо-6-

фосфатизомераза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAP или GAPDH), гексокиназа, фосфофруктокиназа, 3-фосфоглицератмутаза и пируваткиназа (РуК) (ЕРО-А-0329203). Дрожжевой ген РНO5, кодирующий кислую фосфатазу, также предоставляет применимые промоторные последовательности [Myanohara et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут функционировать в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора можно соединить с участком активации транскрипции другого дрожжевого промотора, в результате чего получают синтетический химерный промотор. Примерами таких химерных (гибридных) промоторов являются регуляторная последовательность гена ADH, соединенная с участком активации транскрипции GAP (патенты США №№4876197 и 4880734). Другие примеры химерных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей любого из генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, соединенные с участками активации транскрипции генов, кодирующих гликолитические ферменты, такие, как гены GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать нативные промоторы недрожжевого происхождения, характеризующиеся способностью связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов можно, помимо прочего, найти у Cohen et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1078; Henikoff et al., 1981, Nature, 283, 835; Hollenberg et al., 1981, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96, 119; Hollenberg et al., 1979, "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae". In "Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance", eds. K.N.Timmis & A.Puhler; Mercerau-Puigalon et al., 1980, Gene, 11, 163; Panthier et al., 1980, Curr. Genet., 2, 109.

Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток дрожжей. Промоторная последовательность может быть непосредственно присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт - кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца может быть отщеплeн in vitro путем инкубации с бромцианом.

Химерные белки представляют альтернативный подход для дрожжевых экспрессирующих систем в той же степени, что и в случае с экспрессионными системами для клеток млекопитающих, бакуловирусов и бактерий. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, соединяют с 5’-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. В результате экспрессии такой конструкции образуется химера двух аминокислотных последовательностей. Например, ген дрожжевой или человеческой супероксиддисмутазы (SOD) может быть соединен с 5’-концом чужеродного гена с последующей экспрессией в дрожжах. Последовательность ДНК в районе соединения двух кодирующих аминокислотных последовательностей может кодировать сайт расщепления, а может и не кодировать его: см., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является химерный убихитин-содержащий белок. Такой химерный белок конструируют вместе с убихитиновым сегментом, в котором предпочтительно сохранен сайт - мишень для расщепляющего фермента (например, специфичной по процессингу убихитина протеазы) для отщепления убихитина от чужеродного белка. С применением данного способа, следовательно, могут быть выделены нативные чужеродные белки (см., например, WO 88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки также могут быть секретированы из клетки в питательную среду путем создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий последовательность сигнального сегмента, обеспечивающего секрецию чужеродного белка из дрожжевой клетки. Предпочтительно должны присутствовать кодируемые сайты процессинга, расположенные между сигнальным сегментом и чужеродным геном, которые бы могли быть расщеплены in vivo или in vitro. Последовательность сигнального сегмента обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают секрецию данного белка из клетки.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные сегменты, может происходить от генов, кодирующих секретируемые дрожжевые белки, таких, как ген инвертазы (ЕР–А-0012873; JPO 62096086) и ген А-фактора (патент США №4588684). Альтернативно существуют лидерные сегменты недрожжевого происхождения, такие, как сигнальный сегмент гена интерферона, которые также обеспечивают секрецию из клеток дрожжей (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом обеспечивающих секрецию сигнальных сегментов являются те лидеры, которые используют фрагменты гена α-фактора дрожжей, а составе которого имеется и “пресигнальный”, и “просигнальный” сегменты. Типами фрагментов α-фактора, которые можно использовать, являются полноразмерный препролидер α-фактора (примерно 83 аминокислотных остатка), равно как и укороченные варианты сигнальных сегментов α-фактора (обычно от примерно 25 до примерно 50 аминокислотных остатков) (патенты США №№4546083 и 4870008; ЕР–А-0324274). Дополнительными сигнальными сегментами, основывающимися на лидерном фрагменте α-фактора, которые обеспечивают секрецию, являются химерные α-факторные сигнальные сегменты, сконструированные таким образом, что препоследовательности происходят от первого дрожжевого α-фактора, а пропоследовательности - от второго дрожжевого α-фактора (см., например, WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, представлены регуляторными последовательностями, расположенными с 3’-стороны от стоп - кодона трансляции: т.е. они наряду с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая может быть затем транслирована в полипептид, кодируемый ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами последовательностей терминации являются те элементы, которые входят в состав генов, кодирующих гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, лидер (если он желателен), интересующую кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, вместе вносят в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции обычно поддерживаются в виде репликона, такого, как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно существовать в организме-хозяине, таком, как дрожжи или бактерия. Такой репликон может включать две репликационные системы: это обеспечит поддержание, например, в дрожжах с целью экспрессии и в прокариотической клетке с целью клонирования и амплификации. Примерами таких бифункциональных бактериально-дрожжевых векторов являются плазмиды YEp24 [Botstein et al., 1979, Gene, 8, 17-24], pCl/1 [Brake et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4642-4646] и YRpl7 [Stinchcomb et al., 1982, J. Mol. Biol., 158, 157]. Кроме того, репликон может являться либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида в принципе будет характеризоваться числом копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Клетка-хозяин, несущая высококопийную плазмиду, предпочтительно должна нести, по крайней мере, примерно 10 и более предпочтительно, по крайней мере, примерно 20 копий. Присутствие высококопийного или низкокопийного вектора может быть отобрано, исходя из того влияния, которое оказывает такой вектор и кодируемый им чужеродный белок на организм-хозяин: см., например. Brake et al., цит. выше.

Альтернативно экспрессирующие конструкции могут быть встроены в дрожжевой геном с использованием интегрирующего вектора. Обычно интегрирующие векторы включают, по крайней мере, одну последовательность, гомологичную участку дрожжевой хромосомы, которая и обеспечивает встраивание этого вектора, а предпочтительно включает две гомологичные последовательности, фланкирующие экспрессирующую конструкцию. Считается, что интеграция является следствием рекомбинации между гомологичными участками ДНК вектора и дрожжевой хромосомы [Orr-Weaver et al., 1983, Meth. Enzymol., 101, 228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен в конкретный локус генома дрожжей путем выбора соответствующей гомологичной последовательности, включаемой в состав этого вектора: см. Orr-Weaver et al., цит. выше. Одна или большее число конструкций могут встраиваться так, что, возможно, обусловят изменение уровня выработки рекомбинантного белка [Rine et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6750]. Хромосомные последовательности, включаемые в состав данного вектора, могут находиться в нем либо в виде единственного сегмента, который обусловливает интеграцию всего вектора, либо в виде двух сегментов, которые гомологичны соседним сегментам хромосомы и фланкируют экспрессирующую конструкцию данного вектора - тогда в результате произойдет стабильное встраивание только самой экспрессирующей конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут нести селективные маркеры, обеспечивающие отбор дрожжевых штаммов, прошедших успешную трансформацию. Селективными маркeрами могут являться гены, кодирующие ферменты биосинтетических путей, которые будут.дкспрессироваться в клетках-хозяевах дрожжей, такие, как гены ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 и ALG7, а также ген резистентности к G418, который определяет резистентность клеток дрожжей к туникамицину и G418, соответственно. Кроме того, подходящий селективный маркeр также может придавать дрожжам способность расти в присутствии токсичных веществ, таких, как ионы металлов. Например, присутствие гена CUP1 обеспечивает дрожжам рост в присутствии ионов меди [Butt et al., 1987, Microbiol. Rev., 51, 351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в состав трансформирующих векторов. Трансформирующие векторы обычно включают селективный маркер, который либо поддерживается в виде репликона, либо преобразуется в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы (в виде либо внехромосомных репликонов, либо интегрирующих векторов) были сконструированы для трансформации многих видов дрожжей. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы, помимо прочего, для следующих видов дрожжей: Candida albicans [Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 142], Candida maltosa [Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141], Hansenula polymorpha [Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302], Kluyveromyces fragilis [Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 737; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology, 8, 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141], Pichia pastoris [Cregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; патенты США №№4837148 и 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706] и Yarrowia lipolytica [Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 38047; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49].

Способы внесения экзогенной ДНК в дрожжевые клетки-хозяева хорошо известны в данной области техники и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от вида дрожжей, трансформация которого осуществляется: см., например, Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 142; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141 (дрожжи рода Candida); Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302 (род Hansenula); Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165; De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 1165; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology, 8, 135 (род Kluyveromyces); Cregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141; патенты США №№4837148 и 4929555 (род Pichia); Hinnen et ai., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et ai., 1983, J. Bacteriol., 153, 163 (род Saccharomyces); Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706 (род Schizosaccharomyces); Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 39; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49 (род Yarrowia).

Антитела

По использованию в данном тексте термин “антитело” обозначает полипептид или группу полипептидов, включающих, по крайней мере, один антиген - связывающий сайт (паратоп). Понятие “антиген -связывающий сайт (паратоп)” обозначает пространственную структуру, параметры поверхности и распределение заряда у которой комплементарны параметрам эпитопа антигена: это обеспечивает связывание антитела с соответствующим антигеном. Понятие “антитело” охватывает, например, антитела позвоночных животных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизованные антитела, измененные

антитела, моновалентные антитела, белки Fab и монодоменные антитела.

Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, применимы в аффинной хроматографии, иммунологических тестах и в выявлении и идентификации белков нейссерий.

Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены с применением стандартных методов. В целом, вначале белок используют для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными объектами для получения поликлональных сывороток благодаря получению значительного объема сыворотки крови, а также доступности помеченных антикроличьих и антикозьих антител. Иммунизацию обычно проводят путем перемешивания или эмульгирования конкретного белка в физиологическом растворе, предпочтительно с адъювантом, таким, как полный адъювант Фройнда, с последующим инъецированием полученной смеси или эмульсии парентеральным путем (обычно путем подкожной или внутримышечной инъекции). Обычно достаточными дозами являются по 50-200 мкг за одну инъекцию. Иммунизацию обычно бустируют (т.е. повторяют) через 2-6 недель путем одной или нескольких дополнительных инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно с включением неполного адъюванта Фройнда. Также антитела могут быть получены альтернативным путeм с помощью иммунизации in vitro с применением известных в данной области техники методов, которые, с точки зрения целей настоящего изобретения, эквивалентны иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем отбора крови у иммунизованных животных в стеклянную или пластиковую емкость с последующей инкубацией крови при 25°С в течение 1 часа и затем инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку выделяют центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). У кроликов за один раз можно получить 20-50 мл крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного метода Келера-Мильштейна (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256, 495-496) или его модификаций. Обычно в соответствии с описанным выше иммунизуют мышь или крысу. Однако, в отличие от взятия крови у животных с целью получения сыворотки, в данном методе удаляют селезенку (и, что необязательно, некоторые крупные лимфатические узлы) и мацерируют ткань с целью разделения отдельных клеток. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифических адгезионных клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или в отдельную планшетную лунку, покрытые белком-антигеном. В - лимфоциты, экспрессирующие связанный с мембраной иммуноглобулин, специфичный в отношении тестируемого антигена, связываются на планшете таким образом, что с остатком суспензии не смываются с него. Затем проводят слияние полученных в результате В - лимфоцитов или же всех дифференцированных спленоцитов с миеломными клетками, в результате чего образуются гибридомы: их затем культивируют в селективной среде (например, в среде НАТ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Полученные в результате гибридомы высевают в ограниченном разведении и тестируют на выработку антител, которые специфическим образом связываются с использовавшимся для иммунизации антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Отобранные гибридомы, секретирующие моноклональные антитела (mAb), затем культивируют либо in vitro (например, в ферментeрах в виде пучка полых волокон или стеклянных емкостях для тканевых культур), либо in vivo (в асцитной жидкости у мышей).

Если желательно, антитела (как поликлональные, так и моноклональные) могут быть помечены с применением стандартных методов. Подходящими метками являются флуорофоры, хромофоры, радионуклиды (в частности, ³²Р и ¹²⁵I), электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, для которых известны партнеры по связыванию. Ферменты обычно выявляют по их каталитической активности. Например, пероксидазу хрена обычно выявляют по ее способности превращать 3, 3’, 5, 5’- тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно оцениваемый на спектрофотометре. Термин “специфичный партнeр по связыванию” обозначает белок, способный связывать молекулу - лиганд, проявляя при этом высокий уровень специфичности, как, например, в случае с антигеном и специфичным в отношении него моноклональным антителом. Другими примерами специфичных партнeров по связыванию являются биотин и авидин или стрептавидин, иммуноглобулин-G (IgG) и протеин - А, а также многочисленные пары рецепторов и их лигандов, известные в данной области техники. Должно быть понятно, что приведeнное выше описание не претендует на классификацию маркеров с разделением их на какие-либо классы, поскольку одна и та же метка может быть использована в различных подходах. Например, изотоп ¹²⁵I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электронно-плотного агента. Пероксидаза хрена может являться и ферментом, и антигеном для моноклонального антитела. Кроме тoго, можно для достижения желаемого эффекта сочетать различные метки. Например, mАb и авидин в одинаковой степени нуждаются в мечении в связи с настоящим изобретением: следовательно, можно пометить mAb биотином и выявлять его присутствие с использованием авидина, помеченного, в свою очередь, изотопом ¹²⁵I, или с помощью антиавидинового моноклонального антитела, помеченного пероксидазой хрена. Другие варианты и возможности будут очевидны специалистам в данной области техники и в масштабе настоящего изобретения рассматриваются как эквивалентные.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут включать полипептиды, антитела или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество полипептидов, антител или полинуклеотидов, заявленных настоящим изобретением.

Термин “терапевтически эффективное количество” по использованию в данном тексте обозначает количество терапевтического средства, предназначенное для лечения, облегчения симптомов или профилактики конкретного заболевания или состояния или обеспечения проявления выявляемого лечебного или профилактического эффекта. Такой эффект может быть выявлен, например, по уровням химических маркeров или антигенов. Лечебные эффекты также включают ослабление физических симптомов, например, понижение температуры тела. Точное эффективное количество в отношении конкретного индивидуума будет зависеть от массы тела и состояния здоровья, от природы и степени выраженности болезненного состояния, а также от типов лекарственных средств или их сочетаний, выбранных для применения. Следовательно, отсутствует необходимость в изначальном точном определении эффективного количества. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено с помощью стандартных испытаний: такой подход находится в области компетенции лечащего врача.

Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг конструкций ДНК в приложении к конкретному субъекту, которому она будет назначена.

Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин “фармацевтически приемлемый носитель” обозначает носитель, используемый для введения лекарственного средства, такого, как антитела или полипептид, гены или другие лекарственные средства. Данный термин обозначает любой фармацевтический носитель, который сам по себе не индуцирует выработки антител, опасных для индивидуума, получающего фармацевтическую композицию, и который может быть введен при отсутствии нежелательной токсичности. Подходящими носителями могут быть крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие, как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники.

Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли: например, соли неорганических кислот, такие, как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и подобное, и соли органических кислот, такие, как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и подобное. Детальное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publ. Co., N.J., 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в составе терапевтических композиций могут содержать жидкости, такие, как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт. Кроме того, в таких составах могут присутствовать вспомогательные компоненты, такие, как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные компоненты, используемые для регуляции рН, и подобное. Обычно терапевтические композиции получают в виде составов для инъекций, имеющих форму растворов или суспензий; также могут быть получены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких наполнителях непосредственно перед инъецированием. Также в определение фармацевтически приемлемого носителя включаются липосомы.

Способы доставки

После получения композиции по настоящему изобретению могут быть введены больному напрямую. Пациентами, лечение которых проводится, могут быть животные; в частности, лечение может проводиться в отношении человека.

Прямая доставка композиций в принципе должна осуществляться инъецированием - подкожным, внутрибрюшинным, внутривенным или внутримышечным, или путем доставки в интерстициальное пространство ткани. Также композиции могут быть введены в места повреждения. Другие пути введения включают пероральное и внутрилeгочное, в виде суппозиториев и трансдермальное применение или применение “через кожу” (см., например, WO 98/20734), с помощью игл, “генных ружей” или гипоспрэев. Дозировки могут включать в себя режимы однократных или многократных доз.

Вакцины

Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. для недопущения инфицирования), либо терапевтическими (т.е. лечить заболевание после инфицирования).

Такие вакцины включают иммунизующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в сочетании с “фармацевтически приемлемыми носителями”, включающими любые носители, которые сами по себе не индуцируют выработку антител, опасных для субъекта, получающего данную композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие, как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегаты (такие, как масляные капли или липосомы) и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, указанные носители могут функционировать в качестве иммуностимуляторов (“адъювантов”). Более того, антиген или иммуноген может быть соединен с бактериальным анатоксином, таким, как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, холерный анатоксин, анатоксин Н.pylori и других патогенов.

Предпочтительными адъювантами, предназначенными для усиления эффективности конкретной композиции, являются, тем самым не ограничиваясь: (1) соли алюминия (квасцы), такие, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.; (2) препараты эмульсий “масло в воде” (вместе с другими специфичными иммуностимуляторами, такими, как мурамиловые пептиды [см. ниже], или компоненты бактериальных клеточных стенок, или без них), такие, как, например, (а) препарат

MF59^ТМ (WO 90/14837; глава 10 в "Vaccine design: the subunit and adjuvant approach", eds. Powell & Newman, Plenum Press, 1995), содержащий 5% сквалена, 0,5% Твин-80 и 0,5% Span-85 (необязательно включающий различные количества МТР-РЕ [см. ниже], хотя это и не является необходимым), приготавливаемый в виде субмикронных частиц с использованием микродиспергатора, такого, как микродиспергатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA); (b) препарат SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Твин-80, 5% заблокированного полимера L121 и треонил-MDP (см. ниже) либо микродиспергированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный с получением эмульсии более крупных частиц, и (с) адъювантная система Ribi^ТМ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твин-80 и один или несколько компонентов бактериальных клеточных стенок, представленных группой, включающей монофосфориллипид - А (MPL), димиколаттрегалозу (TDM) и препарат скелета клеточных стенок (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox^ТМ); (3) сапониновые адъюванты, такие, как Stimulon^ТМ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), могут быть использованы, равно как и сформированные на их основе частицы, такие, как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA); (5) цитокины, такие, как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и др.), интерфероны (например, γ-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и др.; и (6) другие вещества и соединения, которые действуют как иммуностимуляторы, усиливающие эффективность данной композиции. Предпочтительными являются квасцы и препарат MF59^ТМ.

Как указывалось выше, мурамиловые пептиды включают, тем самым не исчерпываясь, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (треонил-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1’-2’пальмитоил-sn-глицеро-3-гидрокси-фосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.п.

Иммуногенные композиции (например, иммунизующий антиген или иммуноген, или полипептид, или белок, или нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно должны содержать разбавители, такие, как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.п. Кроме того, в таких наполнителях могут присутствовать вспомогательные компоненты, такие, как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферы для поддержания рН и подобное.

Обычно иммуногенные композиции получают в инъецируемой форме в виде либо жидких растворов, либо суспензий; в твердых формах, пригодных для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препараты также могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы для усиления действия адъюванта, что обсуждалось выше в связи с фармацевтически приемлемыми носителями.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенных или иммуногенных полипептидов, а также любые иные упоминавшиеся выше компоненты, если это необходимо. Понятие “иммунологически эффективного количества” указывает на то, что введение такого количества субъекту в виде либо однократной дозы, либо многократных доз эффективно с точки зрения лечения или профилактики. Данное количество зависит от физического состояния и состояния здоровья индивидуума, к которому оно применяется, от таксономической принадлежности индивидуума (например, принадлежности к нечеловекообразным приматам, вообще к приматам и т.п.), способности иммунной системы индивидуума вырабатывать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, оценки ситуации лечащим врачом и других влияющих факторов. Можно ожидать, что данное количество будет попадать в весьма широкий диапазон, который можно установить с применением стандартных испытаний.

Иммуногенные композиции стандартным образом вводят парентерально, например, с помощью инъекции подкожно, внутримышечно или трансдермально/“через кожу” (например, WO 98/20734). Дополнительными препаратами, пригодными для иных путей введения, являются пероральные и лeгочные готовые формы, суппозитории и препараты для трансдермального применения. Режим доз может включать однократную или многократные дозы. Вакцина может быть введена в сочетании с другими иммунорегуляторными средствами.

В качестве альтернативы вакцине, основанной на белковом компоненте, может быть применена ДНК-вакцинация [см., например, Robinson & Torres, 1997, Seminars in Immunology, 9, 271-283; Donnelly et al., 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 617-648: см. далее в данном тексте].

Приспособления для доставки генов

Генотерапевтические приспособления, предназначенные для доставки конструкций, несущих кодирующую последовательность терапевтического назначения по настоящему изобретению, которая предназначена для введения млекопитающему для экспрессии в его организме, могут быть введены либо местно, либо системно. Указанные конструкции могут быть связаны с подходами, осуществляемыми in vivo или ex vivo и основанными на вирусных или невирусных векторах. Экспрессию такой кодирующей последовательности можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может носить как конститутивный, так и индуцибельный (регулируемый) характер.

Настоящее изобретение включает приспособления для доставки генов, способные экспрессировать нуклеотидные последовательности данного изобретения. Приспособление для доставки генов предпочтительно основывается на вирусном векторе, и, что более предпочтительно, на ретровирусном, аденовирусном, адено-ассоциированном (AAV) вирусном, герпесвирусном и альфавирусном векторе. Вирусный вектор также может быть астровирусным, коронавирусным, ортомиксовирусным, паповавирусным, парамиксовирусным, парвовирусным, пикорнавирусным, поксвирусным или тогавирусным вектором: в качестве обзоров см. Jolly, 1994, Cancer Gene Therapy, 1, 51-64; Kimura, 1994, Human Gene Therapy, 5, 845-852; Connelly, 1995, Human Gene Therapy, 6, 185-193 и Kaplitt, 1994, Nature Genetics, 6, 148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области техники, включая ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы, например, штаммы NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O’Neill, 1985, J. Virol., 53, 160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly, 1983, J. Virol., 45, 291), спумавирусы и лентивирусы; см. "RNA Tumor Viruses", 2d ed.. Cold Spring Harbor Lab., 1985.

Фрагменты ретровирусного генотерапевтического вектора могут происходить от различных ретровирусов. Например, входящие в состав ретровирусного вектора длинные концевые повторы (LTR) могут происходить от вируса саркомы мышей, сайт связывания тРНК - от вируса саркомы Рауса, “упаковочный сигнал” - от вируса лейкоза мыши, а сайт начала репликации второй цепи - от вируса птичьего лейкоза.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для создания компетентных по трансдукции ретровирусных векторных частиц, что достигается путем внесения их в подходящую “упаковочную клеточную линию” (см. патент США №5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы с целью обеспечения сайт-специфичной интеграции в ДНК клетки-хозяина, что достигается включением гена химерного интегразного фермента в состав ретровирусной частицы (см. WO 96/37626). Предпочтительно, чтобы такой рекомбинантный вирусный вектор являлся рекомбинантным вирусом, дефектным по репликации.

“Упаковочные клеточные линии”, пригодные для использования для описанных выше ретровирусных векторов, хорошо известны в данной области техники и могут быть легко созданы (см. WO 95/30763 и WO 92/05266) и использованы для создания продукционных клеточных линий (также называемых “векторными клеточными линиями”, или “VCL”), необходимых для выработки рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно упаковочные клеточные линии формируют на основе родительских клеток человека (например, клеток линии НТ 1080) или на основе родительских клеток норки, которые исключают инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительными ретровирусами, пригодными для конструирования ретровирусных генотерапевтических векторов, являются вирус птичьего лейкоза, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкоза мыши, вирус очаговой индукции в клетках норки, вирус саркомы мыши, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Конкретно предпочтительными вирусами лейкоза мыши являются штаммы 4070А и 1504А (Hartley & Rowe, 1976, J. Virol., 19, 19-25), вирус саркомы Абельсона (АТСС №VR-999), вирус саркомы Фрэнда (АТСС №VR-245), вирусы сарком Грэффи и Гросса (АТСС №VR-590), вирусы сарком Кирстена, Харви и Раушера (АТСС №VR-998) и вирус лейкоза мышей Молони (ДТСС №VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев и коллекций, таких, как Американская коллекция типовых культур (“АТСС”), находящаяся в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных источников с применением стандартных методик.

Примерами известных ретровирусных генотерапевтических векторов, применимых в практике настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в патентных заявках - GB 2200651, ЕР 0415731, ЕР 0345242, ЕР 0334301, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/07994, патентах США №№5219740, 4405712, 4861719, 4980289, 4777127, 5591624, см. также Vile, 1993, Cancer Res., 53, 3860-3864; Vile, 1993, Cancer Res., 53, 962-967; Ram, 1993, Cancer Res., 53, 83-88; Takamiya, 1992, J. Neurosci. Res., 33, 493-503; Baba, 1993, J. Neurosurg, 79, 729-735; Mann, 1983, Cell, 33, 153; Cane, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6349; Miller, 1990, Human Gene Therapy, 1.

Векторы для генотерапии, основанные на аденовирусах человека, также хорошо известны в данной области техники и применимы в связи с настоящим изобретением: см., например, Berkner, 1988, Biotechniques, 6, 616 и Rosenfeld, 1991, Science, 252, 431, а также WO 93/07283, WO 93/06223 и WO 93/07282. Примерами известных аденовирусных генотерапевтических векторов, применимых для целей настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в цитировавшихся выше источниках и в WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06223, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/24299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 и WO 95/09654. Альтернативно, может быть применено внесение ДНК, соединенной с убитым аденовирусом, описанное у Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154. Приспособления для доставки генов по настоящему изобретению также могут основываться на адено-ассоциированных вирусах (AAV). Ведущими и предпочтительными примерами таких векторов в связи с их использованием по настоящему изобретению являются векторы, основанные на штамме AAV-2, заявленные Srivastava в WO 93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы включают два инвертированных концевых повтора из генома AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы путем нуклеотидных замен таким образом, чтобы, по крайней мере, пять нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а предпочтительно, по крайней мере, 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохранялись, а остальные нуклеотиды из состава D-последовательности делетируют или заменяют на ненативные нуклеотиды. Нативные D-последовательности из состава инвертированных концевых повторов AAV являются 20-нуклеотидными мотивами, имеющимися в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. в каждом концевом участке имеется один такой мотив), которые не участвуют в образовании хелперных частиц. Ненативный заменяющий нуклеотид может быть любым нуклеотидом, помимо нуклеотида, имеющегося в составе нативной D-последовательности в том же положении. Другими применимыми примерами векторов на основе вирусов AAV являются pWP-19 и pWN-1: оба они описаны у Nahreini, 1993, Gene, 124, 257-262. Другим примером такого AAV-вектора является вектор psub201 (см. Samulski, 1987, J. Virol., 61, 3096). Другим примером AAV-вектора является вектор Double-D-ITR. Конструирование вектора Double-D-ITR описано в патенте США №5478745. Другими векторами являются векторы, заявленные Carter в патенте США №4797368 и Muzyczka в патенте США №5139941, а также Chartejee в патенте США №5474935 и Kotin WO 94/288157. Еще одним примером AAV-вектора, применимого в связи с настоящим изобретением, является конструкция SSV9AFABTKneo: она включает энхансер AFP и промотор гена альбумина и обеспечивает экспрессию преимущественно в печени. Ее структура и конструирование описаны у Su, 1996, Human Gene Therapy, 7, 463-470. Еще ряд AAV-векторов для генотерапии описан и патентах США №№5354678, 5173414, 5139941 и 5252479.

Генотерапевтические векторы по настоящему изобретению также охватывают векторы на основе герпесвируса. Ведущими и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, включающие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, например, векторы, описанные в патенте США №5288641 и ЕР 0176170 (Roizman). Дополнительными примерами векторов на основе вируса простого герпеса являются HFEM/ICP6-LacZ, заявленный в WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller, 1988, Science, 241, 1667-1669 и в WO 90/09441 и WO 92/07945; вектор HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink, 1992, Human Gene Therapy, 3, 11-19, и векторы HSV 7134, 2-RH-105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield), а также те, которые внесены в коллекцию АТСС под депозитарными №№АТСС VR-977 и АТСС VR-260.

Также представляются генотерапевтические векторы на основе альфавирусов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. К предпочтительным векторам на основе альфавирусов относятся векторы на основе вирусов Синдбис. Тогавирусы, вирус Semliki Forest (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Мидлберга (АТСС VR-370), вирус лихорадки реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532) и те тогавирусы, которые описаны в патентах США №№5091309 и 5217879 и в WO 92/10578. Более конкретно, применимы альфавирусные векторы, которые описаны в заявке на патент США №08/405627, поданной 15 марта 1995 г., в WO 94/21792, WO 92/10578 и WO 95/07994 и в патентах США №№5091309 и 5217879. Такие альфавирусы могут быть доступны из депозитариев или коллекций, таких, как коллекция АТСС в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных естественных источников с применением стандартных методов. Предпочтительно должны использоваться альфавирусные векторы, характеризующиеся пониженной цитотоксичностью (см. заявку на патент США №08/679640).

ДНК - векторные системы, такие, как эукариотические “послойные” экспрессионные системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. В WO 95/07994 имеется подробное описание эукариотических “послойных” экспрессионных систем. Предпочтительно эукариотические “послойные” экспрессионные системы по настоящему изобретению основываются на альфавирусных векторах, а наиболее предпочтительно - на векторах на основе вируса Синдбис.

Другие вирусные векторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают векторы, происходящие от полиовирусов, например, ДТСС VR-58 и тех, которые описаны у Evans, 1989, Nature, 339, 385 и Sabin, 1973, J. Biol. Standardization., 1, 115; от риновирусов, например, АТСС VR-1110 и тех, которые описаны у Arnold, 1990, J. Cell. Biochem., L401; от поксвирусов, таких, как канареечный поксивирус или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010 и тех, которые описаны у Fisher-Hoch, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 317; Flexner, 1989, Ann. N.Y.Acad. Sci., 569, 86; Flexner, 1990, Vaccine, 8, 17; в патентах США №№4603112 и 4769330 и WO 89/01973; от вируса SV40, например, АТСС VR-305 и тех, которые описаны у Mulligan, 1979, Nature, 277, 108 и Madszak, 1992, J. Gen. Virol., 73, 1533; от вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, которые использовались в методиках обратной генетики в соответствии с описанным в патенте США №5166057 и у Enami, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3802-3805; Enami & Palese, 1991. J. Virol., 65, 2711-2713 и Luytjes, 1989, Cell, 59, 110 (см. также McMichael, 1983, New England J. Med., 309, 13 и Yap, 1978, Nature, 273, 238 и Nature, 1979, 277, 108); от вируса иммунодефицита человека в соответствии с описанным в ЕР 0386882 и у Buchschacher, 1992, J. Virol., 66, 2731; от вируса кори, например, АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и тех, которые описаны в ЕР 0440219; от вирусов Аура, например, АТСС VR-368; от вируса Бебару, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; от вируса Кабассу, например, АТСС VR-922; от вируса Чикункунья, например, АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; от вируса Форт-Морган, например, АТСС VR-924; от вируса Гетах, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; от кызылагачского вируса, например, АТСС VR-927; от вируса Майяро, например, АТСС VR-66; от вируса Мукамбо, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; от вируса Ндуму, например, АТСС VR-371; от вируса Пиксуна, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; от вируса Тонат, например, АТСС VR-925; от вируса Тринити, например, АТСС VR-469; от вируса Уна, например, АТСС VR-374; от вируса Ватароа, например, АТСС VR-926; от вируса Y-62-33, например, ATCC VR-375; от вируса лихорадки Ньонг-Ньонг, вируса восточного энцефалита, например, ATCC VR-65 и ATCC VR-1242; от вируса западного энцефалита, например, ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 и ATCC VR-1252; и от коронавирусов, например, ATCC VR-740 и тех, которые описаны у Harare, 1966, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121, 190.

Доставка композиций по настоящему изобретению в клетки не ограничивается использованием описанных выше вирусных векторов. Могут быть также применены и другие доставочные методы и среды, такие, как, например, нуклеотидные экспрессирующие векторы, поликатионно упакованная ДНК, соединенная или не соединенная с убитым аденовирусом: см., например, заявку на патент США №08/366787, поданную 30 декабря 1994 года и Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; ДНК, соединeнная с лигандом: см., например, Wu, 1989, J. Biol. Chem., 264, 16985-16987; доставочные клеточные системы для эукариотических клеток: см., например, патентную заявку США №08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и патентную заявку США №08/404796; внесение светополимеризующегося гидрогелевого материала; применение “ручного генного ружья” в соответствии с описанным в патенте США №5149655; использование ионизирующих излучений в соответствии с описанным в патенте США №5206152 и WO 92/11033; применение “нейтрализации заряда нуклеотида” или прикрепление к клеточной мембране. Другие подобные подходы описаны у Philip, 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 2411-2418 и у Woffendin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1581-1585.

Может быть применен метод доставки генов частицами: см., например, заявку на патент США №60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в состав подходящих векторов, в которых имеются подходящие регуляторные последовательности, обеспечивающие высокоинтенсивную экспрессию; затем проводят инкубацию с синтетическими ген-переносящими молекулами, такими, как полимерные ДНК - связывающие катионы, например, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такими, как асиалооросомукоид, в соответствии с описанным у Wu & Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262, 4429-4432, или инсулин в соответствии с описанным у Hucked, 1990, Biochem. Pharmacol., 40, 253-263, или галактоза в соответствии с описанным у Plank, 1992, Bioconjugate Chem., 3, 533-539, или лактоза, или трансферрин.

Также может быть использована “голая” ДНК. Примерами способов внесения "голой" ДНК являются те способы, которые описаны в WO 90/11092 и в патенте США №5580859. Эффективность поглощения может быть повышена с использованием шариков из латекса, которые разрушаются в биологической среде. ДНК, загруженная на шарики из латекса, эффективно переносится в клетки в результате эндоцитоза, который инициируется этими шариками. Данный способ может быть улучшен путем дополнительной обработки шариков с целью повышения гидрофобности, что тем самым облегчает разрушение эндосомы и

выход данной ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут выполнять роль приспособлений для доставки генов, описаны в патенте США №5422120, в WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445 и ЕР 524968. В соответствии с невирусным способом доставки, описанным в американской патентной заявке №60/023867, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в подходящие векторы, которые включают подходящие регуляторные последовательности, обеспечивающие интенсивную экспрессию, с последующей инкубацией с синтетическими ген-переносящими молекулами, такими, как полимерные ДНК - связывающие катионы, например, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такими, как асиалооросомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. В других доставочных системах липосомы используют с целью инкапсуляции ДНК, включающей ген под контролем различных тканеспецифичных или повсеместно активных промоторов. Другими пригодными для использования невирусными доставочными системами являются механические доставочные системы, такие, как описанные у Woffendin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24), 11581-11585. Более того, кодирующая последовательность и продукт ее экспрессии могут быть доставлены путeм использования светополимеризующихся гидрогелевых материалов. Можно использовать другие подходящие способы доставки генов, включающих кодирующие последовательности, которые, например, основываются на применении “ручного генного ружья” в соответствии с описанным в патенте США №5149655, на применении ионизирующих излучений, обеспечивающих активацию переносимых генов, в соответствии с описанным в патенте США №5206152 и WO 92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных приспособлений для доставки генов являются те, которые описаны в патентах США №№5422120 и 4762915, в WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445, в ЕР 0524968 и у Stryer, 1975, "Biochemistry", ed. W.H.Freeman, San Francisco, pp. 236-240; Szoka, 1980, Biochem. Biophys. Acta, 600, 1; Bayer, 1979, Biochem. Biophys. Acta, 550, 464; Rivnay, 1987, Meth. Enzymol., 149, 119; Wang, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7851; Plant, 1989, Anal. Biochem., 176, 420.

Полинуклеотидная композиция может включать терапевтически эффективное количество генотерапевтической системы в соответствии с термином, определенным выше. Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг ДНК-конструкций в приложении к субъекту, которому они вводятся.

Способы доставки

Приготовленные полинуклеотидные композиции по настоящему изобретению могут быть (1) непосредственно введены субъекту; (2) доставлены ex vivo в клетки, производные от субъекта; или (3) использованы для экспрессии рекомбинантных белков in vitro. Субъектами, которые могут подвергаться лечению, являются млекопитающие или птицы. Также лечение может быть проведено в отношении людей.

Непосредственное введение композиций в принципе должно осуществляться путем инъекций - подкожных, внутрибрюшинных, внутривенных или внутримышечных, - или же они должны вводиться в интерстициальное пространство ткани. Также эти композиции могут быть введены в поврежденные участки. Другими путями введения являются пероральное и внутрилегочное введение, использование суппозиториев, а также трансдермальное введение или введение “через кожу” (см., например, WO 98/20734), или введение с использованием игл, “генных ружей” или гипоспрэев. Дозировки могут быть составлены однократными или многократными дозами.

Способы доставки ex vivo с последующей реимплантацией трансформированных клеток субъекту хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO 93/14778. Примерами клеток, применимых в способах ех vivo, являются, например, стволовые клетки, в частности, кроветворные клетки, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

В целом, доставка нуклеиновых кислот в вариантах применения ех vivo и in vitro может быть осуществлена с помощью, например, таких процедур, как трансфекция, опосредуемая декстраном, осаждение с фосфатом кальция, трансфекция с полибреном, слияние протопластов, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида(ов) в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра - все эти способы хорошо известны в данной области техники.

Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды и полипептиды.

В дополнение к фармацевтически приемлемым носителям и солям, которые были описаны выше, следующие вспомогательные компоненты могут быть использованы для полинуклеотидных и/или полипептидных композиций.

А. Полипептиды

Одним из примеров являются полипептиды, которые, тем самым не ограничиваясь, включают: асиалооросомукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин: интерлейкины; интерфероны; колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колоние-стимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Также могут быть использованы вирусные антигены, такие, как капсидные белки. Также могут быть использованы белки других инвазивных организмов, такие, как 17-аминокислотный пептид кольцевого белка спорозоита малярийного плазмодия Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.п.

Другие группы соединений, которые могут быть включены в состав, включают, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тироидный гормон или витамины, например, фолиевую кислоту.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.п.

Также полиалкиленгликоль может быть включен вместе с желаемыми полинуклеотидами или полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, в состав могут быть включены моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте данного аспекта полисахаридом является декстран или DEAE -декстран. Также могут быть использованы хитозан и сополимер молочной и гликолевой кислот.

D. Липиды и липосомы

Желательные полинуклеотиды или полипептиды могут быть инкапсулированы в липиды или липосомы перед доставкой их субъекту или в производные от него клетки.

Липидную инкапсуляцию обычно осуществляют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать, включать и удерживать нуклеиновую кислоту. Соотношение упакованного полинуклеотида и липидного материала может варьироваться, но в принципе близко к 1:1 (мг ДНК к мкмоль липида), или же количество липида несколько выше. Данные по использованию липосом для целей доставки нуклеиновых кислот обобщены у Hug & Sleight, 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1097, 1-17; Straubinger, 1983, Meth. Enzymol., 101, 512-527.

Липосомные препараты для применения по настоящему изобретению включают катионные (т.е. положительно заряженные), анионные (т.е. отрицательно

заряженные) и нейтральные препараты. Катионные липосомы, как было показано, опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7416), мРНК (Malone, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6077-6081) и очищенных транскрипционных факторов (Debs, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10189-10192), сохраняющих свою функциональность.

Катионные липосомы являются легкодоступными. Например, N-[1,2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмонийные (DOTMA) липосомы доступны под торговой маркой “липофектин” от фирмы Gibco BRL (Grand Island, NY) (см. также Felgner, цит. выше). Другими имеющимися в продаже липосомами являются трансфектаторы (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов с использованием методик, хорошо известных в данной области техники: см., например, Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; а синтез 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропановых (DOTAP) липосом описан в WO 90/11092.

Сходным образом легкодоступными являются анионные и нейтральные липосомы, такие, как получаемые от фирмы Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), или их можно получить с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают, помимо прочего, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Указанные материалы также могут быть смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящих отношениях. Способы приготовления липосом из этих материалов хорошо известны в данной области техники.

Липосомы могут включать многослойные везикулы (MLV), маленькие однослойные везикулы (SUV) или крупные однослойные везикулы (LUV). Различные комплексы липосом и нуклеиновых кислот получают с применением методов, хорошо известных в данной области техники: см., например, Straubinger, 1983, Meth. Immunol., 101, 512-527; Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; Papahadjopoulos, 1975, Biochim. Biophys. Acta, 394, 483; Wilson, 1979, Cell, 17, 77; Deamer & Bangham, 1976, Biochim. Biophys. Acta, 443, 629; Ostro, 1977, Biochem. Biophys. Res. Coinmun., 76, 836; Fraley, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3348; Enoch & Strittmatter, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 145; Fraley, 1980, J. Biol. Chem., 255, 10431; Szoka & Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 145; Schaefer-Ridder, 1982, Science, 215, 166.

Е. Липопротеины

Кроме того, в композицию вместе с полинуклеотидом или полипептидом, предназначенным к доставке, могут быть включены липопротеины. Примерами липопротеинов, которые можно использовать, являются: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Также можно использовать мутанты, фрагменты и химеры названных белков. Также можно использовать модификации природных липопротеинов, такие, как ацетилированные LDL. Эти липопротеины могут обеспечивать доставку полинуклеотидов к конкретным клеткам, экспрессирующим рецепторы липопротеинов. Предпочтительно, чтобы, в случае включения в композицию липопротеинов наряду с предназначенным для доставки полинуклеотидом, другие лиганды, обеспечивающие направленную доставку к мишеням, в состав такой композиции не включались.

Встречающиеся в природе липопротеины включают липидную и белковую части. Белковая часть известна под названием “апопротеин”. В настоящее время выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и Е. По крайней мере, в двух из этих классов имеется по несколько дифференцированных белков, которые обозначаются римскими цифрами: AI, AII, AIV; CI, СII, CIII.

В составе липопротеина может присутствовать более одного апопротеина. Например, встречающиеся в естественных условиях хиломикроны включают апопротеины А, В, С и Е, причем с течением времени они утрачивают апопротеин-А и приобретают апопротеины С и Е. В состав VLDL входят апопротеины А, В, С и Е, в состав LDL - апопротеин-В, а в состав HDL входят апопротеины А, С и Е.

Аминокислотный состав указанных апопротеинов известен и описан, например, у Breslow, 1985, Annu. Rev. Biochem., 54, 699; Law, 1986, Adv. Exp. Med. Biol., 151, 162; Chen, 1986, J. Biol. Chem., 261, 12918; Kane, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77, 2465; Utermann, 1984, Hum. Genet., 65, 232.

В состав липопротеинов входят различные липиды, включая триглицериды, холестерин (свободный или в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов во встречающихся в естественных условиях липопротеинах варьируется. Например, хиломикроны в основном состоят из триглицеридов. Более подробное описание липидного состава встречающихся в естественных условиях липопротеинов можно найти, например, в "Meth. Enzymol." 128 (1986). Состав липидов подбирается таким образом, чтобы соответствовать конформации апопротеина, обеспечивая тем самым активность по связыванию на соответствующем рецепторе. Состав липидов также может быть подобран так, чтобы облегчить гидрофобное взаимодействие и связывание с молекулой, связывающей полинуклеотид.

Встречающиеся в естественных условиях липопротеины могут, например, быть выделены из сыворотки крови путем ультрацентрифугирования. Некоторые способы описаны в "Meth. Enzymol." (цит. выше) и у Pitas, 1980, J.Biochem., 255, 5454-5460 и Mahey, 1979, J. Clin. Invest., 64, 743-750. Липопротеины также могут быть получены in vitro или с помощью рекомбинантных технологий путeм экспрессии генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине: см., например, Atkinson, 1986, Annu. Rev. Biophys. Chem., 15, 403 и Padding, 1958, Biochim. Biophys. Acta, 30, 443. Также липопротеины можно приобрести у коммерческих поставщиков, таких как Biomedicai Technologies Inc. (Stoughton, Massachusetts, США). Дополнительное описание липопротеинов можно найти в WO 98/06437.

F. Поликатионные агенты

В состав композиции для доставки, включающей желательный полинуклеотид или полипептид, могут быть включены поликатионные агенты, как вместе с липопротеинами, так и без них.

Обычно поликатионные компоненты при физиологических значениях рН имеют суммарный положительный заряд и способны нейтрализовывать электрический заряд нуклеиновых кислот, что должно облегчать доставку к желательному месту. Указанные агенты могут применяться как in vitro и ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты можно использовать для доставки нуклеиновых кислот пациентам прижизненно путем внутримышечного, подкожного введения и т.п.

Следующие полипептиды являются примерами применимых поликатионных агентов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другими примерами являются гистоны, протамины, сывороточный альбумин человека, ДНК-связывающие белки, негистоновые хромосомные белки, капсидные белки ДНК-вирусов, таких, как вирус фХ174; транскрипционные факторы также включают участки связывания ДНК, и поэтому они также могут быть использованы в качестве агентов, конденсирующих нуклеиновую кислоту. Вкратце, транскрипционные факторы, такие, как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID срдержат базовые домены и связываются с последовательностью ДНК.

Органическими поликатионными агентами являются спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы исходя из приведенного выше перечня с целью конструирования других поликатионных агентов полипептидной природы или с целью получения синтетических поликатионных агентов.

Применимые синтетические поликатионные агенты, включают, например, DEAE-декстран и полибрен. Липофектин^ТМ и липофектамин^ТМ являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы в случае их комбинирования с полинуклеотидами или полипептидами.

Иммунологические диагностические тесты

Антигены нейссерий по настоящему изобретению могут быть использованы в иммунологических тестах, нацеленных на определение уровней антител (или, напротив, антитела к антигенам нейссерий могут быть использованы для определения уровней антигенов). Иммунологические тесты, базирующиеся на точно определенных рекомбинантных антигенах, могут быть разработаны с целью замены инвазивных диагностических тестов. Антитела к белкам нейссерий могут быть выявлены в составе биологических образцов, таких, как, например, кровь или сыворотка крови. В результате разработки подобных иммунологических тестов появляются их многочисленные модификации, широкий круг которых известен в данной области техники. Прописи таких иммунологических тестов могут быть основаны, например, на конкурентном связывании или прямом взаимодействии, или на принципе “сэндвич”-метода. В указанных протоколах также, например, могут быть использованы твердые подложки или иммунопреципитация. Во многих тестах используются помеченные антитело или полипептид; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемолюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами красителя. Также известны тесты, в которых применяется амплификация сигналов на основе соответствующего зонда: примерами в этом случае являются тесты, в которых используются биотин и авидин, а также иммунологические тесты, основанные на использовании ферментов или мечении ферментами, такие, как ТИФА (твердофазный иммуноферментный анализ).

Наборы, применимые для иммунодиагностики, включающие подходящие помеченные реагенты, конструируют путем упаковки подходящих материалов, включая композиции по настоящему изобретению, в пригодные контейнеры, наряду с другими материалами и реагентами (например, подходящими буферами, растворами солей и т.п.), необходимыми для проведения данного теста, равно как и необходимыми инструкциями.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Термин “гибридизация” обозначает связывание двух нуклеотидных последовательностей друг с другом водородными связями. Обычно одну последовательность фиксируют на твердой подложке, а другая находится в растворе в свободном состоянии. Затем обеспечивают контакт между этими двумя последовательностями в таких условиях, которые благоприятствуют образованию водородных связей. Факторами, которые влияют на образование таких связей, являются: тип и объем растворителя; температура реакции; продолжительность гибридизации; агенты, которые блокируют неспецифическое связывание находящейся в жидкой фазе последовательности с твердой подложкой (раствор Денхардта или реактив BLOTTO); концентрация последовательностей; применение соединений, которые способны увеличивать скорость связывания последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывки после гибридизации (см. Sambrook et al., цит. выше, том 2, глава 9, стр.9.47-9.57).

Под “жесткостью” понимаются условия проведения гибридизации, которые благоприятствуют связыванию очень сходных последовательностей в отличие от различающихся последовательностей. Например, сочетание температуры и концентрации солей должно выбираться таким образом, чтобы оно было на 120-200°С ниже расчетной температуры диссоциации (Т_m) анализируемого гибрида. Параметры температуры и концентрации солей могут быть, как правило, определены эмпирическим путeм в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованной на фильтрах, гибридизуют с анализируемой последовательностью и затем промывают в условиях различной степени жeсткости (см. Sambrook et al., стр.9.50).

Переменные, которые необходимо учитывать при осуществлении, например, Саузерн-блоттинга, таковы: (1) сложность структуры ДНК, которая будет подвергнута блоттингу, и (2) уровень гомологии зонда и выявляемых последовательностей. Общее количество исследуемого фрагмента (фрагментов) может варьироваться на порядок - от 0,1 до 1 мкг для плазмиды или фага или от 10^-9 до 10^-8 г для однокопийного гена из состава сложноорганизованного эукариотического генома. Для менее сложных полинуклеотидов можно использовать существенно менее продолжительные периоды времени блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшие количества исходных полинуклеотидов и меньшие специфические активности зондов. Например, однокопийный дрожжевой ген можно выявить при времени экспозиции всего 1 час при количестве исходной дрожжевой ДНК 1 мкг, блоттинге в течение 2 часов и гибридизации в течение 4-8 часов с зондом, имеющим активность 10⁸ имп./мин на 1 мкг. Для однокопийного гена млекопитающего аналогичный подход будет начинаться с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствие 10% декстрансульфата с использованием зонда со специфической активностью свыше 10⁸ имп./мин на 1 мкг, в результате чего время экспозиции составит примерно 24 часа.

Некоторые факторы могут влиять на температуру диссоциации (Т_m) гибрида ДНК/ДНК, образующегося между зондом и анализируемым фрагментом, а, следовательно, и на подходящие условия проведения гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд гомологичен данному фрагменту на 100%. Другие обычно учитываемые переменные - это общее содержание пары G+C в гибридизующих последовательностях и их длина, а также ионная сила гибридизационного буфера и содержание формамида в нем. Влияние всех этих факторов может быть учтено с помощью общего уравнения: Т_m=81+16,6 ·(log₁₀Сi)+0,4·[%(G+C)]-0,6·(% формамида)-600/n-1,5·(% ошибок), где Ci - концентрация солей (одновалентных ионов), а n - длина данного гибрида, выраженная в числе пар нуклеотидов (формула незначительно модифицирована по сравнению с опубликованным у Meinkoth & Wahl, 1984, Anal. Biochem., 138, 267-284).

При конструировании схемы гибридизационного эксперимента по соображениям удобства могут быть изменены некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот. Наиболее просты, с точки зрения доведения до оптимума, температура гибридизации и промывки и концентрация солей, используемых при промывке. При увеличении температуры проведения реакции гибридизации (т.е. жeсткости) становится менее вероятной гибридизация между цепями, которые негомологичны друг другу - соответственно, снизится фоновый “шум”. Если радиоактивно помеченный зонд не полностью гомологичен иммобилизованному фрагменту (ситуация, обычная в анализе генных семейств и проведении экспериментов по межвидовой гибридизации), то температуру гибридизации нужно снизить - тогда фоновый “шум” возрастет. Температура промывки сходным образом влияет на интенсивность гибридизационного сигнала и уровень фона. Жесткость условий промывки также возрастает при снижении концентраций солей.

В целом, подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, гомологичного фрагменту-мишени на 95-100%, 37°С при гомологии на уровне 90-95% и 32°С при уровне гомологии 85-90%. Для более низких уровней гомологии содержание формамида должно быть снижено с последующей соответствующей корректировкой температуры на основе вышеприведeнного уравнения. Если уровень гомологии между зондом и фрагментом-мишенью неизвестен, то наиболее простым подходом является проведение эксперимента изначально в нежестких условиях гибридизации и промывки. Если после авторадиографического анализа оказываются интенсивными бэнды неспецифического связывания и уровень фонового “шума”, то фильтр может быть промыт при высоком уровне жесткости и проэкспонирован повторно. Если время, необходимое для экспозиции, делает данный подход непрактичным, то несколько вариантов жeсткости гибридизации и (или) промывки можно протестировать одновременно.

Краткое описание чертежей

На фигурах 1-7 показано сопоставление по типу “обведения в закрашенные прямоугольники” ORF40 (1), ORF4 (2), 225 (3), 235 (4), 287 (5), 519 (6), 919 (7). Консервативные аминокислоты показаны на черном фоне.

На фигуре 8 показано филогенетическое древо.

На фигуре 9А отображена изменчивость аминокислотных последовательностей N.meningitidis ORF4, ORF40, 225, 235, 287, 519 и 919. Данные последовательности были использованы для конструирования филогенетического древа, показанного на фигуре 9В.

На фигурах 10-19 показано сопоставление по типу “обведения в закрашенные прямоугольники” ORF4 (10), ORF40 (11), ORF46 (12), 225 (13), 235 (14), 287 (15), 519 (16), 726 (17), 919 (18), 953 (19).

На фигуре 20 показаны Вестерн-блоты для ORF4, 225, 235, 519 и 919.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Пример 1 по WO 99/36544 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерии, обозначенного как “ORF40”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а последовательности полноразмерного белка проявляют 83,7%-ную идентичность на 601-аминокислотном участке.

ORF40 была секвенирована для ссылочной популяции 21 штамма N.meningitidis (см. табл.1).

Таблица 1
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
zn	BZ198	Seiler et al. (1996)
zn	NG3/88	Seiler et al. (1996)
zn	297-0	Seiler et al. (1996)
zn	BZ147	Seiler et al. (1996)
zn	BZ169	Seiler et al. (1996)
zn	528	Seiler et al. (1996)
zn	BZ133	Seiler et al. (1996)
zn	NGE31	Seiler et al. (1996)
zn	NGH38	Seiler et al. (1996)
zn	NGH15	Seiler et al. (1996)
zn	BZ232	Seiler et al. (1996)
zn	BZ83	Seiler et al. (1996)
zn	44/76	Seiler et al. (1996)
zn	MC58	Virji et al. (1992)
Группа А
zn	205900	Chiron SpA
zn	F6124	Chiron SpA
z	Z2491	Maiden et al. (1998)
Группа С
zn	90/18311	Chiron SpA
zn	93/4286	Chiron SpA
Другие
zn	860800 (группа Y)	Maiden et al. (1998)
zn	Е32 (группа Z)	Maiden et al. (1998)

Сопоставление указанной 21 последовательности показано на фигуре 1. Видны мотивы консервативных аминокислот. Первые 17 аминокислот, например, консервативны (MNKIYRIIWNSALNAWV), хотя серин в 11-м положении не присутствует у 100% нейссерий. После этого расположена аминокислота, не являющаяся консервативной, после которой, в свою очередь, находится мотив из 16 консервативных аминокислот (VSELTRNHTKRASATV). С-концевой участок белка состоит из 116 консервативных

аминокислот.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка ORF40 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

ORF40 была повторно секвенирована в целом для 31 штамма, и полученные последовательности подвергли сопоставлению. Полученные результаты показаны на фигуре 11.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MNKIYRIIWNSALNAWV

- VSELTRNHTKRASATV

- TAVLATLL

- TLKAGDNLKIKQ

- FTYSLKKDLTDLTSV

- TEKLSFGANG

- KVNITSDTKGLNFAKETAGTNGD

- TVHLNGIGSTLTDTL

- RAAS(V/I)KDVLNAGWNIKGVK

- NVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGK

- KGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGT

- GTTATVSKDDQGNITV

- YDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSM

- PQFSSVSLGAGADAPTLSVD

- NKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAI GGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW.

Пример 2

Пример 26 по WO 99/24578 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “ORF4”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Идентичность последовательностей на уровне: аминокислот такова:

	N.meningitidis A	N.gonorrhoeae
N.meningitidis В	99,7% по 287 аминокислотам	97,6% по 288 аминокислотам

ORF4 была секвенирована для ссылочной популяции 32 штаммов Neisseria (см. табл.2).

Таблица 2
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
zv	NG6/88	Seiler et al. (1996)
zv	BZ198	Seiler et al. (1996)
zv	NG3/88	Seiler et al. (1996)
zv	297.0	Seiler et al. (1996)
zv	1000	Seiler et al. (1996)
zv	BZ147	Seiler et al. (1996)
zv	BZ169	Seiler et al. (1996)
zv	528	Seiler et al. (1996)
zv	NGP165	Seiler et al. (1996)
zv	BZ133	Seiler et al. (1996)
zv	NGE31	Seiler et al. (1996)
zv	NGF26	Seiler et al. (1996)
zv	NGE28	Seiler et al. (1996)
zv	SWZ107	Seiler et al. (1996)
zv	NGH15	Seiler et al. (1996)
zv	NGH36	Seiler et al. (1996)
zv	BZ232	Seiler et al. (1996)
zv	BZ83	Seiler et al. (1996)
zv	44/76	Seiler et al. (1996)
zv	МС58	Virji et al. (1992)
zv	2996	Chiron SpA
Группа А
zv	205900	Chiron SpA
z	Z2491	Maiden et al. 1998
Группа С
zv	90/18311	Chiron SpA
zv	93/4286	Chiron SpA
Другиe
zv	A22 (группа W)	Maiden et al. (1998)
zv	E26 (группа X)	Maiden et al. (1998)
zv	860800 (группа Y)	Maiden et al. (1998)
zv	E32 (группа Z)	Maiden et al. (1998)
N.gonorrhoeae
zv	NgF62	Maiden et al. (1998)
zv	NgSN4	R.Moxon
fa	FA1090	Dempsey et al. (1991)

Сопоставление последовательностей, проведенное в программе PILEUP, показано на фигуре 2. Видны мотивы консервативных аминокислот. Первые 34 аминокислоты, например, консервативны, хотя серин в 26-м положении не присутствует у 100% нейссерий. С-концевая часть белка состоит из 228 консервативных аминокислот.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка ORF4 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

ORF4 была повторно секвенирована в целом для 35 штаммов, и полученные последовательности подвергли сопоставлению. Полученные результаты показаны на фигуре 10.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MKTFFKTLSAAALALILAACGGQKDSAPAASASAAADNGA

- KKEIVFGTTVGDFGDMVKE

- ELEKKGYTVKLVEFTDYVRPNLALAEGELDINVFQHKPYLDDFKKEHNLDITEVFQVPTAPLGLYPGK LKSLEEVKDGSTVSAPNDPSNFARVLVMLDELGWIKLKDGINPLTASKADIAENLKNIKIVELEAAQL PRSRADVDFAVVNGNYAISSGMKLTEALFQEPSFAYVNWSAVKTADKDSQWLKDVTEAYNSDAFKAYA HKRFEGYKSPAAWNEGAAK

Пример 3

Пример 16 по WO 99/57280 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “225”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Белок 225 был секвенирован для ссылочной популяции 34 штаммов Neisseria (см. табл.3).

Таблица 3
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
zo	NG6/88	Seiler et al., 1996
zo	BZ198	Seiler et al., 1996
zo	NG3/88	Seiler et al., 1996
zo	297-0	Seiler et al., 1996
zo	1000	Seiler et al., 1996
zo	BZ147	Seiler et al., 1996
zo	BZ169	Seiler et al.,1996
zo	528	Seiler et al.,1996
zo	NGP165	Seiler et al., 1996
zo	BZ133	Seiler et al., 1996
zo	NGE31	Seiler et al., 1996
zo	NGF26	Seiler et al., 1996
zo	NGE28	Seiler et al., 1996
zo	NGH38	Seiler et al., 1996
zo	SWZ107	Seiler et al., 1996
zo	NGH15	Seiler et al., 1996
zo	NGH36	Seiler et al., 1996
zo	BZ232	Seiler et al., 1996
zo	BZ83	Seiler et al., 1996
zo	44/76	Seiler et al., 1996
zo	MC58	Chiron SpA
zo	2996	Chiron SpA
Группа А
zo	205900	Chiron SpA
zo	F6124	Chiron SpA
z2491	Z2491	Maiden et al., 1998
Группа С
zo	90/18311	Chiron SpA
zo	93/4286	Chiron SpA
Другие
zo	A22 (группа W)	Maiden et al., 1998
zo	Е26 (группа X)	Maiden et al., 1998
zo	860800 (группа Y)	Maiden et al., 1998
zo	Е32 (группа Z)	Maiden et al., 1998
Gonococcus
zo	NgF62	Maiden et al., 1998
zo	NgSN4	Chiron SpA
fa1090	FA1090	Chiron SpA

Сопоставление последовательностей, проведенное в программе PILEUP, показано на фигуре 3. Видны мотивы консервативных аминокислот. Первые 74 аминокислоты, например, консервативны, хотя изолейцин в 51-м положении не присутствует у 100% нейссерий. С-концевая часть белка состоит из 148 консервативных аминокислот. Сходное сопоставление показано на фигуре 13.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка 225 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Пример 4

Пример 16 по WO 99/57280 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “235”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Белок 235 был секвенирован для ссылочной популяции 31 штамма Neisseria (см. табл.4).

Таблица 4
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
gnmzq01	NG6/88	Seiler et al., 1996
gnmzq02	BZ198	Seiler et al., 1996
gnmzq03	NG3/88	Seiler et al., 1996
gnmzq04	1000	Seiler et al.,1996
gnmzq05	1000	Seiler et al., 1996
gnmzq07	BZ169	Seiler et al., 1996
gnmzq08	528	Seiler et al., 1996
gnmzq09	NGP165	Seiler et al., 1996
gnmzq10	BZ133	Seiler et al., 1996
gnmzq11	NGE31	Seiler et al., 1996
gnmzq13	NGE28	Seiler et al., 1996
gnmzq14	NGH38	Seiler et al., 1996
gnmzq15	SWZ107	Seiler et al., 1996
gnmzq16	NGH15	Seller et al., 1996
gnmzq17	NGH36	Seiler et al., 1996
gnmzq18	BZ232	Seiler et al., 1996
gnmzq19	BZ83	Seiler et al., 1996
gnmzq21	МС58	Virji et al.,1992
Группа А
gnmzq22	205900	Chiron SpA
gnmzq23	F6124	Chiron SpA
z2491	Z2491	Maiden et al., 1998
Группа С
gnmzq24	90/18311	Chiron SpA
gnmzq25	93/4286	Chiron SpA
Другие
gnmzq26	А22 (группа W)	Maiden et al., 1998
gnmzq27	А26 (группа Х)	Maiden et al., 1998
gnmzq28	860800 (группа Y)	Maiden et al., 1998
gnmzq29	E32 (группа Z)	Maiden et al., 1998
gnmzq31	N.lactamica	Chiron SpA
Gonococcus
gnmzq32	NgF62	Maiden et al., 1998
gnmzq33	NgSN4	Chiron SpA
fa1090	PA 1090	Dempsey et al., 1991

Сопоставление последовательностей, проведенное в программе PILEUP, показано на фигуре 4. Видны мотивы консервативных аминокислот. Белок полностью консервативен, хотя серин в 168-м положении проявляет некоторый уровень изменчивости.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка 235 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Белок 235 был повторно секвенирован в целом у 35 штаммов, а полученные последовательности подвергали сопоставлению. Полученные результаты показаны на фигуре 14.

Пример 5

Пример 16 по WO 99/57280 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “287”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Белок 287 был секвенирован для ссылочной популяции 6 штаммов Neisseria (см. табл.5).

Таблица 5
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
	BZ198	Seiler et al. ( 1996)
	NGP165	Seiler et al. (1996)
	NGH38	Seiler et al. (1996)
	МС58	Virji et al. (1992)
Группа А
z2491	Z2491	Maiden et al. ( 1998)
Gonococcus
fa1090	FA1090	Dempsey et al., (1991)

Сопоставление последовательностей, проведeнное в программе PILEUP, показано на фигуре 5. Видны мотивы консервативных аминокислот. Первые 42 аминокислоты, например, отчетливо консервативны, а также длинный консервативный участок можно видеть в С-концевой части белка.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка 287, пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Белок 287 был повторно секвенирован в целом для 35 штаммов (включая штамм С11 серогруппы С N.meningitidis), и полученные последовательности подвергли сопоставлению. Полученные результаты показаны на фигуре 15.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MFKRSVIAMACI

- ALSACGGGGGGSPDVKSADT

- SKPAAPVV

- QDMAAVS

- ENTGNGGAATTD

- QNDMPQ

- DGPSQNITLTHCK

- KSEFE

- RRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKL

- GGSYAL

- VQGLPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFH

- GRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMG

- QKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSG(R/K)FYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKDRD

Пример 6

Пример 16 по WO 99/57280 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “519”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Белок 519 был секвенирован для ссылочной популяции 22 штаммов Neisseria (см. табл.6).

Таблица 6
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
zv	NG6/88	Seiler et al., 1996
zv	BZ198	Seiler et al., 1996
zv	NG3/88	Seiler et al., 1996
zv	297-0	Seiler et al., 1996
zv	1000	Seiler et al., 1996
zv	BZ147	Seiler et al., 1996
zv	BZ169	Seiler et al., 1996
zv	NGE31	Seiler et al., 1996
zv	NGF26	Seiler et al., 1996
zv	BZ232	Seiler et al., 1996
zv	BZ83	Seiler et al., 1996
zv	44/76	Seiler et al., 1996
zv	MC58	Chiron SpA
zv	2996	Chiron SpA
Группа А
zv	205900	Chiron SpA
z	Z2491	Maiden et al., 1998
Другие
zv	А22 (группа W)	Maiden et al., 1998
zv	E26 (группа X)	Maiden et al., 1998
zv	860800 (группа Y)	Maiden et al., 1998
zv	Е32 (группа Z)	Maiden et al., 1998
Gonococcus
zv	NgF62	Maiden et al., 1998
fa	FA1090	Chiron SpA

Сопоставление последовательностей, проведeнное в программе PILEUP, показано на фигуре 6. Видны мотивы консервативных аминокислот, и белок проявляет консерватизм по всей своей длине.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка 519 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Белок 519 был повторно секвенирован в целом для 33 штаммов, и полученные последовательности подвергли сопоставлению. Полученные результаты показаны на фигуре 16.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MEFFIILL

- AVAVFGFKSFVVIPQQEVHVVERLGRFHRALTAGLNILIPFIDRVAYRHSLKEIPLDVPSQVCITRDN TQLTVDGIIYFQVTDPKLASYGSSNYIMAITQLAQTTLRSVIGRMELDKTFEERDEINSTVV

- ALDEAAGAWGVKVLRYEIKDLVPPQEILPSMQAQITAEREKRARIAESEGRKIEQINLASGQREAEIQ QSEGEAQAAVNASNAEKIARINRAKGEAESLRLVAEANAEANRQIAAALQTQSGADAVNLKIAGQYVT AFKNLAKEDNTRIKPAKVAEIGNPNFRRHEKFSPEAKTAK

Пример 7

Пример 16 по WO 99/57280 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “919”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Белок 919 был секвенирован для ссылочной популяции 35 штаммов Neisseria (табл.7).

Таблица 7
Идентификационный номер	Штамм	Ссылка
Группа В
zm01	NG6/88	Seiler et al., 1996
zm02	BZ198	Seiler et al.,1996
zm03	NG3/88	Seiler et al., 1996
zm04	297-0	Seiler et al., 1996
zm05	1000	Seiler et al., 1996
zm06	BZ147	Seiler et al., 1996
zm07	BZ169	Seiler et al., 1996
zm08n	528	Seiler et al., 1996
zm09	NGP165	Seiler et al., 1996
zm10	BZ133	Seiler et al.,, 1996
zm11asbc	NGE31	Seiler et al., 1996
zm12	NGF26	Seiler et al., 1996
zm13	NGE28	Seiler et al., 1996
zm14	NGH38	Seiler et al., 1996
zm15	SWZ107	Seiler et al.,1996
zm16	NGH15	Seiler et al., 1996
zm17	NGH36	Seiler et al.,1996
zm18	BZ232	Seiler et al., 1996
zm19	BZ83	Seiler et al., 1996
zm20	44/76	Seiler et al., 1996
zm21	МС58	Chiron SpA
zm96	2996	Chiron SpA
Группа А
zm22	205900	Chiron SpA
zm23asbc	F6124	Chiron SpA
z2491	Z249l	Maiden et al.,1998
Группа С
zm24	90/18311	Chiron SpA
zm25	93/4286	Chiron SpA
Другиe
zm26	A22 (группа W)	Maiden et al., 1998
zm27bc	E26 (группа X)	Maiden et al., 1998
zm28	860800 (группа Y)	Maiden et al.,1998
zm29asbc	E32 (группа Z)	Maiden et al., 1998
zm31asbc	N.lactamica	Chiron SpA
Gonococcus
zm32asbc	NgF62	Maiden et al., 1998
zm33asbc	NgSN4	Chiron SpA
fa1090	FA1090	Chiron SpA

Сопоставление последовательностей, проведенное в программе PILEUP, показано на фигуре 7. Другое сопоставление показано на фигуре 18. Видны мотивы консервативных аминокислот. Белок проявляет практически полный консерватизм.

Консервативные участки, идентифицированные в данном примере, подтверждают, что фрагменты полноразмерного белка 919 пригодны для полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MKKYLFRAAL

- GIAAAILAACQSKSIQTFPQPDTSVINGPDRPVGIPDPAGTTV(G/A)GGGAVYTVVPHLSLPHWAAQ DFAKSLQSFRLGCANLKNRQGWQDVCAQAFQTPVHSFQAKQFFERYFTPWQVAGNGSLAGTVTGYYEP VLKGDDRRTAQARFPIYGIPDDFISVPLPAGLRSGKALVRIRQTGKNSGTIDN

- GGTHTADLS

- FPITARTTAIKGRFEGSRFLPYHTRNQINGGALDGKAPILGYAEDPVELFFMHIQGSGRLKTPSGKYI RIGYADKNEHPYVSIG(R/K)YMADKGYLKLGQTSMQGIK

- YMRQNPQRLAEVLGQNPSYIFFREL

-NDGPVGALGTPLMGEYAGAVDRHYITLGAPLFVATAHPVTRKALNRLIMAQDTGSAIKGAVRVDYFWG YGDEAGELAGKQKTTGYVWQLLPNGMKPEYRP

Пример 8

Пример 55 по WO 99/23578 описывает клонирование и экспрессию белка нейссерий, обозначенного как “ORF46”. Представлены последовательности белка и ДНК серогрупп А и В N.meningitidis, а также последовательности N.gonorrhoeae.

Полноразмерный ORF46 был секвенирован для ссылочной популяции 6 штаммов серогруппы В. Сопоставление указанных последовательностей показано на фигуре 12, из которой видны мотивы консервативных аминокислот.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- RKISLILSILAVCLPMHAHASDLANDSFIRQVLDRQHFEPDGKYHLFGSRGELAERSGHIGLG

- IQSHQLGNLMIQQAAIKGNIGYIVRFSDHGHEVHSPFDNHASHSDSDEAGSPVDGFSLYRIHWDGYEH HPADGYDGPOGGGYPAPKGARDIYSYDIKGVAQNIRLNLTDNRSTGQRLADRFHNAG

- MLTQGVGDGFKRATRYSPELDRSGNAAEAFNGTADIVKNIIGAAGEIVGAGDAVQGISEGSNIAVMHG LGLLSTENKMARINDLADMAQLKDYAAAAIRDWAVQNPNAAQGIEAVSNIF

- IPIKGIGAVRGKYGLGGITAHP(V/I)KRSQMGEIALPKGKSAVS

- NFADAAYAKYPSPYHSRNIRSNLEQRYGKENITSSTVPPSNGKNVKLANKRHPKTKVPFDGKGFPNFE KDVKY

Консервативные участки в ORF46 подтверждают, что фрагменты данного белка пригодны в качестве полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Пример 9

В WO 99/57280 описаны клонирование и экспрессия белка нейссерий, обозначенного как “726”. Представлены последовательности белка и ДНК описаны для серогрупп А и В N.meningitidis.

Белок 726 был секвенирован для ссылочной популяции 7 штаммов N.meningitidis серогрупп А, В и С. Сопоставление указанных последовательностей показано на фигуре 17, из которой видны мотивы консервативных аминокислот.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- IYFKNGFYDDTLG

- IPEGAVAVRAEEYAALLAGQAQGGQIAADSDGRPVLTPPRPS(D/E)YHEWDGKKW

- AAAAARFAEQKTATAFRLA

- KADELKNSLLAGYPQVEIDSFYRQEKEALARQADNNAPTPMLAQIAAARGVELDVLIEKV(I/V) EKS ARLAVAAGAIIGKRQQLEDKLN

- IETAPGLDALEKEIEEWT

Консервативные участки в 726 подтверждают, что фрагменты данного белка пригодны в качестве полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Пример 10

В WO 99/57280 описаны клонирование и экспрессия белка нейссерий, обозначенного как “953”. Представлены последовательности белка и ДНК для серогрупп А и В N.meningitidis наряду с последовательностями N.gonorrhoeae.

Белок 953 был секвенирован для ссылочной популяции 8 штаммов N.meningitidis серогрупп А, В и С. Сопоставление указанных последовательностей показано на фигуре 19, из которой видны мотивы консервативных аминокислот. Указанный белок высококонсервативен.

Консервативные участки, представляющие конкретный интерес, таковы:

- MKKIIFAALAAAAVGTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT IP(I/V)ANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLK AEKFNCYQSPM

- ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP(I/V)ANLQSGSOHFTD HLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPM

- KTEVCGGDFSTTIDRTKWG(M/V)DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ

Консервативные участки в 953 подтверждают, что фрагменты данного белка пригодны в качестве полиспецифичных вакцин или диагностических реагентов.

Филогенетическое древо

На фигуре 8 приведена дендрограмма, отражающая генетические отношения между 107 штаммами N.meningitidis, определенные путем анализа шести генных фрагментов в программе MLST [адаптировано по Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3140]. Дендрограмму можно использовать для отбора штаммов, представленных в серогруппе В менингококка (стрелки). Пять дополнительных штаммов, для которых генетическое соответствие гипервирулентным эволюционным линиям было подтверждено независимо у Wang et al., 1993, J. Infect. Dis., 167, 1320; Seiler et al., 1996, Mol. Microbiol., 19, 841 и Virji et al., 1992, Mol. Microbiol., 6, 1271, наложены на дендрограмму и отмечены звездочками. Дополнительно к 22 штаммам МеnВ использовали три штамма МеnА, два штамма МеnС и по одному штамму Men Y, X, Z и W135. Это отмечено перед названием буквами, набранными жирным шрифтом. При недоступности филогенетических данных штаммы приведены за пределами древа. Отмечены гипервирулентные штаммы ЕТ-5, ЕТ-37 и IV-1.

Изменчивость последовательностей

На фигуре 9а схематически отображена изменчивость аминокислотных последовательностей белков 225, 235, 287, 519, 919, ORF4 и ORF40 у N.meningitidis. Горизонтальная ось представляет последовательность МС58. Различия аминокислот в

пределах штаммов МеnВ отмечены вертикальными линиями поверх горизонтальной оси; различия в пределах серогрупп А, С, Y, X, Z и W135 показаны линиями ниже оси. Высота вертикальных линий соответствует числу штаммов с различиями по аминокислотам. Следовательно, пики показывают изменчивые участки. Отметки под графиками белков 225 и 287 указывают на сегменты последовательностей, которые в некоторых штаммах пропущены.

На фигуре 9b приведена дендрограмма штаммов N.meningitidis, выстроенная по параметрам тех же 7 белков. В результате филогенетического анализа указанных генов была получена дендрограмма, на которой кластеры гипервирулентных штаммов соответствуют отмеченному на фигуре 8. Линии указывают на штаммы, кластер которых в своем исходном основании на 100% соответствует данным MLST-анализа. Цифры в основании каждого узла соответствуют величинам начального сходства (приведены только те величины, которые превышают 80%). Генные последовательности разных штаммов были сопоставлены в программе PILEUP пакета GCG. Филогенетический анализ был проведeн с использованием алгоритма “соседних связей” [Saitou & Nei, 1987, Mol. Biol. Evol., 4, 406] в соответствии с программой NEIGHBOR из пакета PHYLIP. Попарные расстояния подсчитывали с использованием парного параметра Кимуры [Kimura, 1980, J. Mol. Evol., 16, 111] no 31 штамму N.meningitidis. Из анализа были исключены N-концевой участок ORF40, белок 287 целиком и тандемные повторы из состава 225. Для оценки величины основания использовали всего 1000 начальных реплик. Кластеризация гипервирулентных штаммов была подтверждена с помощью анализа методом наибольшей экономии.

Вестерн-блоты

Антигены ORF4, 225, 235, 519 и 919 анализировали методом Вестерн-блоттинга у различных штаммов. Полученные результаты показаны на фигуре 20. В случае с белком 225 блоты показывают наличие фрагментов разного размера у различных штаммов: стрелки указывают на бэнд точного размера. Белок 225 включает участки делеции и вставки определенного повтора, а размер фрагментов на блотах соответствует данным по генной изменчивости.

Использованные на фигуре 20 штаммы таковы.

N.meningitidis серогруппы В:

1=NG6/88	2=BZ198	3=NG3/88	4=297-0	5=1000
6=BZ147	7=BZ169	8=528	9=NGP165	10=BZ133
11=NGE31	12=NGF26	13=NGE28	14=NGH38	15=SWZ107
16=NGH15	17=NGH36	18=BZ232	19=BZ83	20=44/76
21=МС58	96=2996

N.meningitidis серогруппы А:

22=205900 23=F6124

N.meningitidis серогруппы С:

24=90/18311 25=93/4286

Другие N.meningitidis:

26=А22 (серогруппа W)

27=Е26 (серогруппа X)

28=860800 (серогруппа Y)

29=Е32 (серогруппа Z)

Другие Neisseria

30=N.cinerea

L17=N.lactamica

L19=N.lactamica

31=N.gonorrhoeae F62

32=N.gonorrhoeae SN4

Должно быть понятно, что настоящее изобретение было описано только в виде примеров и что могут быть внесены модификации, которые останутся соответствующими сути и объему настоящего изобретения.

1. Белок, полученный из Neisseria meningitidis и проявляющий свойства антигена, включающий фрагмент белка ORF 40, причем (а) указанный фрагмент состоит из 7 или более расположенных подряд консервативных аминокислот, которые обнаружены в ORF 40 у по крайней мере 50% контрольной популяции Neisseria, (b) ORF 40 имеет аминокислотную последовательность:

MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNS

DKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNK

VNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGV

KPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTТVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEG

EGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTТANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDAL

NVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGA

DAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQ

AYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW

в штамме МС58 серогруппы В N.meningitidis, и (с) указанный белок не имеет аминокислотной последовательности указанного штамма МС58 ORF40.

2. Белок по п.1, отличающийся тем, что контрольная популяция состоит из штаммов BZ198, NG3/88, 297-0, BZ147, ВZ169, 528, ВZ133, NGЕ31, NGН38, NGН15, ВZ232, ВZ83, 44/76, МС58, 205900, F6124, Z2491, 90/18311, 93/4286, 860800 и E32.

3. Белок по п.1, отличающийся тем, что указанный фрагмент состоит из 20 или более расположенных подряд консервативных аминокислот.

4. Белок по любому из пп.1-3 для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

5. Белок по любому из пп.1-3 для использования в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

6. Белок по любому из пп.1-3 для использования в производстве диагностического реагента для выявления инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

7. Белок, полученный из Neisseria meningitidis и проявляющий свойства антигена, включающий фрагмент из 7 или более расположенных подряд консервативных аминокислот, причем указанный фрагмент присутствует по крайней мере в 2 аминокислотных последовательностях, показанных на фиг.1 и 11.

8. Белок по п.7, отличающийся тем, что указанный фрагмент присутствует по крайней мере в 10 аминокислотных последовательностях, показанных на фиг.1.

9. Белок по п.8, отличающийся тем, что указанный фрагмент присутствует во всех аминокислотных последовательностях, показанных на фиг.1.

10. Белок по п.7, отличающийся тем, что указанный фрагмент присутствует по крайней мере в 10 аминокислотных последовательностях, показанных на фиг.11.

11. Белок по п.10, отличающийся тем, что указанный фрагмент присутствует во всех аминокислотных последовательностях, показанных на фиг.11.

12. Белок по п.7, отличающийся тем, что указанный фрагмент состоит из 20 или более расположенных подряд консервативных аминокислот.

13. Белок по любому из пп.7-12 для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

14. Белок по любому из пп.7-12 для использования в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

15. Белок по любому из пп.7-12 для использования в производстве диагностического реагента для выявления инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

16. Белок, полученный из Neisseria meningitidis, включающий одну или более из следующих аминокислотных последовательностей:

MNKIYRIIWNSALNAWV;

VSELTRNHTKRASATV;

TAVLATLL;

TLKAGDNLKIKQ;

FTYSLKKDLTDLTSV;

TEKLSFGANG;

KVNITSDTKGLNFAKETAGTNGD;

TVHLNGIGSTLTDTL;

RAASVKDVLNAGWNIKGVK;

RAASIKDVLNAGWNIKGVK;

NVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGK;

KGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGT;

GTTATVSKDDQGNITV;

YDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSM;

PQFSSVSLGAGADAPTLSVD;

NKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGG

GTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW.

17. Белок по п.16 для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

18. Белок по п.16 для использования в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

19. Белок по п.16 для использования в производстве диагностического реагента для выявления инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

20. Белок, полученный из Neisseria meningitidis, включающий одну из аминокислотных последовательностей, показанных на Фиг.1 или 11.

21. Белок по п.20 для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

22. Белок по п.20 для использования в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

23. Белок по п.20 для использования в производстве диагностического реагента для выявления инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

24. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-3, 7-12, 16 и 20.

25. Нуклеиновая кислота по п.24 для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

26. Нуклеиновая кислота по п.24 для использования в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной бактерией Neisseria.

27. Нуклеиновая кислота по п.24 для использования в производстве диагностического реагента для выявления инфекции, вызванной бактерией Neisseria.