Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биохимических, иммунологических и биологических исследованиях, а также при производстве препаратов инсулинов для терапевтических целей. Полусинтетический инсулин человека получают путем транспептидации свиного инсулина в присутствии трипсина при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, и при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде. Ингибирование реакции проводят путем снижения рН и разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза. Очистку полученного эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ. Способ обеспечивает увеличение выхода эфира инсулина человека до 98% и уменьшение содержания сопутствующих родственных примесей в конечном продукте до 0,9%.

Изобретение относится к области биохимии и фармации и может быть использовано в биохимических, иммунологических и биологических исследованиях, а также при производстве препаратов инсулинов для терапевтических целей.

Известны способы получения полусинтетической субстанции инсулина человека из свиного инсулина и из свиного инсулина с сопутствующими родственньми примесями путем обработки исходного сырья избытком эфира треонина в присутствии трипсина в водной среде при рН ниже изоэлектрической точки (патент №4 601 852, США, 1986 год) или из того же исходного сырья с использованием комбинации двух типов ферментов: карбоксипептидазы А и с последующим присоединением ди-трет-бутилового эфира треонина, который катализируется трипсином в свободном или иммобилизованном состоянии (Норре Seylers, Z. Physiol, Chem. 356, 1631).

Недостатками этих способов является образование промежуточного продукта типа Des-(Asp.sup.A21)-инсулин, который имеет низкую биологическую активность и довольно низкий выход конечного продукта за счет расщепления связи Arg.sup.B22-Gly.syp.B23 трипсином в водной среде.

Наиболее близким к данному изобретению по технической сущности и результату, который достигается, является способ получения полусинтетической субстанции инсулина человека, который включает получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями избытком трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина и органической кислоты. Эта реакция транспептидации проводится при молярном избытке трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину более 5 и при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина от 1 до 1-200. Ингибирование реакции осуществляется созданием кислой среды с рН 3, очистка полученного эфира инсулина человека производится анионной и/или катионной хроматографией, снятие защитных групп осуществляется известным способом трифторуксусной кислотой, после чего производится кристаллизация сырого инсулина человека. Условия проведения реакции: количество воды в реакционной смеси - более 10% и менее 50% объемных, температура реакции - менее 50°С (патент №4 343 898, США, С 12 Р 021/04).

Данный способ позволяет получить выход эфира инсулина человека, который определяет выход конечного продукта, более 60%-90%, но и ему присущ тот же недостаток - при использовании фермент-субстратного отношения, равного 1:1-200, в условиях проведения реакции транспептидации образуются примеси (до 7%), которые невозможно удалить на последующих стадиях получения инсулина человека известными способами, в результате чего получается конечный продукт, загрязненный этими примесями. Кроме того, данный способ является трудоемким и многостадийным.

Задачей изобретения является создание способа получения полусинтетического инсулина человека, который гарантирует повышение выхода эфира инсулина человека в результате реакции транспептидации, уменьшение количества трудноудалимых примесей в конечном продукте, обеспечение, таким образом, получения применимого для терапевтических целей биохимически активного, иммунологически безопасного инсулина человека и упрощение уже существующего способа за счет сокращения количества операций.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения полусинтетического инсулина человека, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацей свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которую проводят в присутствии трипсина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде, ингибирование реакции снижением рН, очистку эфира инсулина человека, снятие защитных групп и кристаллизацию инсулина человека, согласно изобретению транспептидацию проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ.

В качестве исходного сырья в заявляемом способе используют свиной инсулин с сопутствующими родственными примесями, такими как свиной проинсулин (до 2%) и продукты модификации и деградации свиного инсулина. Такой инсулин еще называют сырым инсулином.

Водно-органическая среда, которая представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид, диметилсульфоксид) и протонных (наример, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.

Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим с активностью 40-60 U/мг.

В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.

Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка. Необходимость выполнения этих операций после снятия защитных групп также устраняется благодаря прямой кристаллизации.

Кроме того, использование системы ВЭЖХ позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.

Заключительная очистка уже конечного продукта - инсулина человека, который получается после снятия защитных групп известным способом трифторуксусной кислотой и прямой кристаллизации сырого инсулина человека, также производится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.

Условия реакции транспептидации, в частности заявляемое фермент-субстратное соотношение, которое отличает заявляемое решение, позволяют увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка конечного продукта системой ВЭЖХ - до 0,9%.

Для постадийного контроля способа получения полусинтетического инсулина человека, оценки конечного продукта и его идентификации были использованы различные методики ВЭЖХ, пептидного картирования и иммуноферментного анализа.

Решение поставленных задач иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1

100 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,4 мл воды, добавили 0,05 мл уксусной кислоты, 3 мл 0,63 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,25 мг трипсина с активностью 50 U/мг в 0,2 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в два раза по отношению к объему реакционной смеси, и рН смеси довели до 2,5 10% НСl. Анализ реакционной смеси показал, что выход эфирной производной инсулина составил 98%. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS-AP (С-18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 120 Å. Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-НСl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Фракцию эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 82 мг полученного эфира инсулина человека растворили в 1,0 мл трифторуксусной кислоты, выдержали смесь в течение 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.

Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов отфильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 75 мг. Методом пептидного картирования было доказано, что этот продукт действительно является инсулином человека. Затем методом иммуноферментного анализа было установлено, что остаток свиного проинсулина в конечном продукте составлял менее 1 мкг/г, что отвечает фармакопейным требованиям, согласно которым содержание свиного проинсулина в инсулине человека не должно превышать 10 мкг/г. Что касается других сопутствующих примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - не более 0,85%.

Пример 2

50 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,2 мл воды, добавили 0,025 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,858 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,5 пентадиола, 0,165 мг трипсина с активностью 40 U/мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 23 часов при температуре 18°С. Дальше поступали, как в примере 1, но реакционную смесь разбавляли водой в три раза по отношению к объему реакционной смеси. Выход эфира инсулина человека составил 40,5 мг, содержание сопутствующих примесей 0,8%.

Пример 3

75 мг сырого свиного инсулина суспендировалии в 0,3 мл воды, добавили 0,04 мл уксусной кислоты, 2,25 мл 1,14 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилсульфоксида и 1,2 этандиола, 0,08 мг трипсина с активностью 60 U/мг в 0,15 мл 0,05 М кальция ацетата. Дальше поступали, как в примере 1. Выход эфира инсулина человека по данным аналитической ВЭЖХ составил 97%. Анализ конечного продукта показал, что содержание в нем сопутствующих родственных примесей составляет 0,84%.

Пример 4

Реакционная смесь и условия реакции, как в примере 2, за исключением количества трипсина - трипсина добавили 0,25 мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. По данным ВЭЖХ выход эфира инсулина человека составил 75%, количество трудно устранимых примесей составляло 5%.

Пример 5

Реакционная смесь, как в примере 4, за исключением количества трипсина. Для реакции использовали 0,04 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход эфира инсулина человека составил 70%, а количество свиного инсулина, который не прореагировал, равнялось 10%.

Пример 6

50 мг свиного проинсулина суспендировали в 0,25 мл воды, добавили 0,022 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,17 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Условия проведения реакции были, как в примере 4. Реакционную смесь осадили 10 объемами ацетона и высушили. Анализ осадка по данным ВЭЖХ показал 85% выход эфирной производной инсулина человека.

Таким образом, как показывают примеры конкретного выполнения, использование заявляемого способа обеспечивает увеличение выхода эфира инсулина человека до 98% и уменьшение содержания сопутствующих родственных примесей в конечном продукте до 0,9% (примеры 1-3). В то же время, как показывают примеры 4 и 5, в которых ферментсубстратное соотношение трипсина и свиного инсулина находятся за заявляемыми пределами, поставленные задачи в отношении качества и количества выходного продукта решить не удается. Пример 6 доказывает, что при оптимальных условиях проведения реакции транспептидации свиной проинсулин, который является примесью в исходном сырье, на 85% конвертируется в эфир инсулина человека, что, как понятно, также способствует увеличению выхода конечного продукта.

Способ получения полусинтетического инсулина человека, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которую проводят в присутствии трипсина при молярном избытке ди-третбутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде, ингибирование реакции снижением рН, очистку эфира инсулина человека, снятие защитных групп и кристаллизацию инсулина человека, отличающийся тем, что транспептидацию проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ.

Изобретение относится к области радиационной биохимии. .

Способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей форм хронического лимфолейкоза // 2242004

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии. .

Способ оценки результатов лечения больных хроническим остеомиелитом // 2228526

Изобретение относится к медицине, в частности к ортопедии, и может быть использовано для лечения больных хроническим остеомиелитом Способ включает анализ результатов биохимических, радионуклидных и рентгенологических исследований, при этом при биохимическом исследовании определяют фосфатазный индекс, системный индекс электролитов и системный индекс гликолиза, сопоставляют их с показателем степени накопления в костной ткани радиофармпрепарата и данными рентгенологических исследований и при значениях на момент завершения курса лечения: фосфатазного индекса более 13, системного индекса электролитов от 160 до 200, системного индекса гликолиза менее 50, степени накопления радиофармпрепарата от 160 до 180%, отсутствии у больного остаточных костных полостей, явлений остеосклероза и/или остеопороза судят о стойком купировании остеомиелитического процесса, при значениях: фосфатазного индекса менее 8, системного индекса электролитов более 200, системного индекса гликолиза более 70, степени накопления радиофармпрепарата от 180 до 200% на фоне явлений остеопороза и/или остеосклероза делают вывод о необходимости проведения дополнительного курса консервативного лечения, а при значениях: фосфатазного индекса от 8 до 13, системного индекса электролитов менее 160, системного индекса гликолиза от 50 до 70, степени накопления радиофармпрепарата более 220% на фоне остаточных костных полостей в сочетании с явлениями остеопороза и/или остеосклероза делают вывод о неудовлетворительном результате.

Способ оценки восстановления слуховой функции в остром периоде сенсоневральной тугоухости // 2224256

Изобретение относится к медицине, в частности к оториноларингологии. .

Высокоафинные мутеины интерлейкина-4 // 2202364

Изобретение относится к области медицины. .

Способ радиоиммунохимического анализа // 2154831

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам количественного анализа биологически (физиологически) активных веществ в пробах различной природы, а именно к способам радиоиммунохимического анализа с использованием тритиевой метки.

Способ радиоиммунохимического анализа // 2149405

Изобретение относится к способам количественного анализа биологически активных веществ в пробах различной природы ,а именно к способам радиоиммунохимического анализа с использованием метки йод-125.

Радиоактивный иммунореагент направленного действия, композиция для получения изображения злокачественного новообразования в организме, способ получения изображения и комплексообразующий агент // 2122431

Изобретение относится к радиоактивному иммунореагенту направленного действия, который представляет собой конъюгат комплексообразующего агента и иммунореактивной группы, меченый ионом радиоактивного металла.

Модифицирующая удельный вес маркерная частица и способ анализа биологической жидкости // 2116068

Изобретение относится к медицине и касается модифицирующей удельный вес маркерной частицы и способа анализа биологической жидкости. .

Способ подготовки крови к радиоиммунологическому анализу // 2080602

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для иммунохимического анализа, в частности радиоиммунологического, малых количеств периферической крови.

Химерный белок, обеспечивающий образование биоактивной конформации, способ получения белка с инсулиновой активностью, способ идентификации пептидильного фрагмента // 2238951

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения правильно скрученного, содержащего предшественник инсулина химерного белка. .

Способ сушки кристаллов протеинов // 2235730

Агрегаты производных инсулина человека // 2218349

Изобретение относится к водорастворимому агрегату производных инсулина, в котором остатки В24-В30 В-цепи производного инсулина являются последовательностью Phe-Х-Х-Х-Х-Х-Х, где каждый Х независимо представляет любую аминокислоту или делецию, по меньшей мере один Х является N-замещенным остатком лизина, в котором заместителем является 5--литохолевая кислота или 5--литохолевая кислота, связанная через -глутамил, -глутамил или - или -аспартил в качестве линкера, где агрегат имеет размер, определенный в гель-фильтрационной системе, больше, чем у альдолазы, и агрегат включает по меньшей мере 2 иона цинка на 6 молекул производного инсулина.

Производное инсулина или его физиологически приемлемая соль, предшественник производного инсулина, днк-последовательность, кодирующая предшественник, вектор экспрессии, содержащий упомянутую днк-последовательность, субстрат, трансформированный упомянутым вектором экспрессии, фармацевтическая композиция с понижающей, соответственно регулирующей уровень глюкозы в крови эффективностью // 2207874

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производного инсулина или его физиологически приемлемой соли с ускоренным по сравнению с человеческим инсулином наступлением действия, в котором аспарагин (Asn) в положении В3 цепи В заменен на природный основной аминокислотный остаток и по меньшей мере один аминокислотный остаток в положениях В27, В28 или В29 цепи В замещен на другой природный нейтральный или кислый аминокислотный остаток, причем аспарагин (Asn) в положении А21 цепи А может быть заменен на Asp, Gly, Ser, Thr или Ala, а фенилаланин (Phe) в положении В1 цепи В и аминокислотный остаток в положении В30 цепи В могут отсутствовать.

Фрагмент с-пептида человеческого проинсулина // 2206336

Изобретение относится к области медицины и касается фрагментов С-пептида человеческого проинсулина. .

Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками // 2205836

Изобретение относится к способу получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом: (а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника, (б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при значении рН 8 - 11,5 и температуре 15 - 55oС, выдерживание полученной смеси в течение 10-60 мин при этой температуре и (в) внесение смеси при значении рН 8 - 11,5 и температуре 5 - 30oС в количество воды, которое дает разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М.

Затравочные кристаллы для получения пептидов или протеинов // 2205188

Изобретение относится к способу получения затравочных микрокристаллов для производства пептида или протеина, отличающемуся тем, что он включает в себя получение суспензии пептида или протеина без затравки и по меньшей мере двухкратную гомогенизацию указанной суспензии под давлением 50000-150000 кПа для получения микрокристаллов пептида или протеина, имеющих размер 0,5-4 мкм, пригодных для использования в качестве затравочных микрокристаллов в процессе производства указанного пептида или протеина.

Не содержащие цинк кристаллы инсулина для применения в легочных композициях // 2198181

Изобретение относится к не содержащим цинк кристаллам инсулина, имеющим диаметр меньше 10 мкм, пригодным для введения через легкие. .

Инсулин и его производные с повышенной способностью связывать цинк // 2176646

Изобретение относится к инсулину и его производным с повышенной способностью связывать цинк. .

Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета // 2164520

Предшественник инсулина, способ его получения и применение // 2283846

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности