Штамм бактериофага helicobacter pylori, обладающий литической активностью в отношении бактерий helicobacter pylori, и способ получения противогастритного и противоязвенного средства на его основе

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии. Предложен новый штамм бактериофага Helicobacter pylori №МЦКМ F-07. Штамм, обладающий литической активностью в отношении бактерий Helicobacter pylori. Предложен также способ получения противогастритного и противоязвенного средства на основе нового штамма бактериофага. Способ предусматривает получение очищенной суспензии бактериофага Helicobacter pylori №МЦКМ F-07 с литической активностью 10⁹ БОЕ/мл и добавление в нее раствора 1% хинозола. Кроме того, в данное средство можно дополнительно вводить сорбит и желатозу, а полученную смесь замораживают и лиофилизируют. Предложенное изобретение позволяет получать высокоэффективное противоязвенное и противогастритное средство, которое может быть использовано в медицине. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового специфического штамма бактериофага для получения противогастритного и противоязвенного средства.

Известна роль бактерий Helicobacter pylori в патогенезе поражений желудка и двенадцатиперсной кишки. При исследованиях, проведенных у пациентов с острыми гастритами или обострениями хронической патологии, выявлено большое число бактерий, локализующихся в участках воспаления, обычно в антральной части. Проникая через слой слизи, Helicobacter pylori прикрепляются к эпителиальным клеткам (чаще в области межклеточных ходов), проникают в крипты и железы слизистой оболочки. Активность бактерий приводит к разрушению слизистого слоя и обусловливает контакт желудочного сока со стенкой органа. Антигены микроорганизмов стимулируют миграцию нейтрофилов и способствуют развитию острого воспаления. Локализация Helicobacter pylori в области межклеточных ходов обусловлена хемотаксисом к местам выхода мочевины и гемина, образующихся из разрушающегося гемоглобина эритроцитов в микроциркуляторном русле. Под действием бактериальной уреазы мочевина превращается в аммиак, повреждающий слизистую оболочку желудка и двенадцатиперсной кишки.

Известны штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae, обладающий противосальмонелезной активностью (Патент РФ №2080384, МПК С 12 N 7/00, опубл. 27.05.97); штамм бактериофага Enterobacter aerogenes для диагностики, профилактики и лечения инфекции, вызываемой Enterobacter aerogenes (Авторское свидетельство СССР №1685998, МПК С 12 N 7/00, опубл. 23.10.91); штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ГНЦ ПМ №02, используемый при изготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки (Патент РФ №2113476, МПК С 12 N 7/ 00, опубл. 20.06.98).

Однако вышеуказанные штаммы бактериофагов не обладают литической активностью в отношении бактерий Helicobacter pylori.

Штаммов бактериофагов Helicobacter pylori, используемых для получения противогастритного и противоязвенного средства, в настоящее время не известно (объект изобретения на штамм прототипа не имеет).

Известно, что для лечения гастритов или язвенных болезней, обусловленных деятельностью Helicobacter pylori, используют такие антибиотики, как метронидазол и фуразолидон, или амоксиклав, цефокситин и эритромицин. или тетрациклин (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1987, часть 2, - с.157, 183, 246, 293).

Однако применение препаратов-антибиотиков сопряжено с различными побочными эффектами (Белобородова Н.В., Богданов М.Б. и Черненькая Т.В. Алгоритмы антибиотикотерапии. Руководство для врачей. - М., 1999, с.17):

- появление резистентных (антибиотикоустойчивых) бактерий Helicobacter pylori при длительном применении антибиотиков;

- развитие дисбактериозов, усугубляющих гастрит и язвенную болезнь желудка и двенадцатиперсной кишки.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения жидкой и сухой препаративной формы "Стрептофагин" на основе бактериофага, включающий получение очищенной суспензии фага Streptococcus bovis путем стерилизующей фильтрации с последующей фасовкой жидкого препарата и его герметизацией. Для получения сухой формы к суспензии добавляют сульфат аммония и пищевые сорбенты с последующей лиофильной сушкой препарата (Патент РФ №2059723, МПК С 12 N 7/00, опубл. 10.05.96).

Однако вышеуказанные препараты на основе бактериофага Streptococcus bovis не обладают литической активностью в отношении бактерий Helicobacter pylori.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является штамм бактериофага Helicobacter pylori, обладающий литической активностью в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, а также способ получения противогастритной и противоязвенной препаративной жидкой и сухой формы на его основе, обеспечивающей лечение гастрита и язвы желудка без применения антибиотикотерапии.

Указанный технический результат достигается получением штамма бактериофага Helicobacter pylori (авторское название НР-7Ф-Х).

Указанный технический результат достигается также разработкой способа получения противогастритного и противоязвенного средства, включающего получение очищенной суспензии бактериофага и введение в него дополнительных компонентов, согласно изобретению в качестве очищенной суспензии бактериофага используют суспензию бактериофага Helicobacter pylori (НР-7Ф-Х) №МЦКМ F-07 с литической активностью не менее 10⁹ БОЕ/мл, а в качестве дополнительных компонентов используют раствор хинозола при следующем конечном содержании ингредиентов полученного средства, мас.%:

очищенная суспензия бактериофага Helicobacter

pylori с литической активностью 10⁹ БОЕ/мл 10,0-20,0

1%-ный раствор хинозола 0,5-1,0

вода ocтальное до 100%

Кроме того, в средство дополнительно вводят сорбит и желатозу, полученную смесь замораживают со скоростью 0,1-3,0°С в минуту до температуры ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда, а процесс сушки средства производят лиофилизацией при следующем конечном содержании компонентов в сухом средстве, мас.%:

сорбит 20,0-25,0

желатоза 20,0-25,0

хинозол 0,03-0-06

сухая масса бактерифага остальное до 100%

Желатоза - частично гидролизованная желатина (белок), обладающая амфотерными свойствами, которая является стабилизатором для биологически активных компонентов биопрепарата. Желатоза разрешена к использованию в пищевой и фармацевтической промышленности.

Сорбит обладают стабилизирующими и защитными свойствами в процессе сушки и хранения биологически активных веществ.

Хинозол - мелкокристаллический порошок лимонно-желтого цвета является антибиотиком, обладающим антибактериальной и противогрибковой активностью, малотоксичен.

Штамм бактериофага Helicobacter pylori (авторское название НР-7Ф-X) выделен из спонтанно лизировавшейся культуры Helicobacter pylori в процессе наработки ее биомассы на Колумбиа агаре при ее биохимических исследованиях. Штамм фага НР-7Ф-Х депонирован в Коллекции Межрегионального центра коррекции микроценоза человека (г.Новосибирск) под номером №МЦКМ F-07.

Проведена селекция штамма в течение 27 пассажей в присутствии 1,0 мг/мл хинозола, который можно использовать в качестве бактериостатика при получении препаративной формы.

Химический состав фага НР-7Ф-Х. Для оценки типа нуклеиновой кислоты очищенную суспензию фага окрашивают акридиновым оранжевым. Характер флуоресценции образцов при ультрафиолетовом облучении свидетельствовал о том, что фаг НР-7Ф-Х содержит ДНК. Белковый состав вириона исследован на основе электрофореза в 10%-ном полиакриламидиом геле. Выявлено 7 белков с молекулярными массами (в килодальтонах): 70; 67; 59; 47; 38; 27 и 34.

Физико-химические свойства фага. Суспензия фата НР-7Ф-Х не инактивируется при температуре 60°С в течение 40 минут. Литическая активность фага не изменяется в пределах рН 5-9. Фаг устойчив к антибиотику хинозолу.

Морфология негативных колоний. Фаг НР-7Ф-Х на газоне индикаторного штамма Helicobacter pylori образует округлые с четким краем негативные колонии от 0,5 до 1,5 мм в диаметре.

Вирулентность. Из 147 исследованных культур Helicobacter pylori, полученных из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперсной кишки больных хроническим гастритом и язвенной болезнью, все они оказались чувствительны к данному фагу.

Скорость и степень адсорбции. При множественности инфекции, равной 0,5, и инкубации адсорбционной смеси при 39°С за 5 минут адсорбируется 97% фага.

Латентный период и урожай фага. Латентный период более 25 минут и менее 30 минут. Средний урожай фага составляет 70 фаговых частиц на одну клетку. Титр фага в нативном фаголизате варьирует в пределах 10¹⁰ БОЕ/мл.

Способ размножения. Размножается на бактериальных клетках Helicobacter pylori на твердой питательной среде Колумбиа агаре и на жидкой питательной среде.

Способ хранения. Суспензия фага (НР-7Ф-Х) хранится в жидком виде 1 год и лиофильном (сухом) виде при температуре +(2-10)°С в течение 2-х лет.

Для практического использования на базе фага (НР-7Ф-Х) созданы жидкая и сухая препаративные формы.

Пример 1. Приготовление жидкой формы препарата на основе штамма бактериофага Helicobacter pylori (НР-7Ф-Х)

Вначале берут культуру Helicobacter pylori, полученную из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперсной кишки больных хроническим гастритом и язвенной болезнью и производят ее посев на поверхность питательной среды, содержащей Колумбиа агар с 10%-ной сывороткой лошадиной крови и ингибиторами роста посторонней микрофлоры. Оптимальный состав газовой смеси: N₂ 85-87%; О₂ 5%; СО₂ 8-10% (микроаэрофильные условия). Культивирование производят в течение 4-х суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С. В результате культивирования в течение 2-х суток появляются мелкие колонии размером менее 0,5 мм, гладкие, блестящие, выпуклые, прозрачные. На третьи сутки рост бактериальных клеток максимальный, колонии имеют размер 1 мм. По истечении 4-х суток колонии пересевают на новые (свежие) питательные среды или используют в качестве посевного материала для наработки бактерий Helicobacter pylori в суспензии на жидкой среде следующего состава. В 1 литре дистиллированной воды растворяют, (г): триптический гидролизат кормовых дрожжей 30,0; натрия пируват 0,2; натрия метабисульфит 0,2; железо сернокислое закисное 0,2; натрия глютамат 1,3; натрий хлористый 4,0; агар 10,0; натрий углекислый 0,15; до рН 7,2. Раствор кипятят 2-3 минуты, отфильтровывают через ватный фильтр, стерилизуют при 1 атм (121°С) в течение 20 минут и охлаждают до +37°С. В культуральную среду вносят посевную дозу Helicobacter pylori до конечной концентрации 5·10⁷ КОЕ/мл и выращивают в микроаэрофильных условиях (состав газовой смеси: N₂ 85-87%; О₂ 5%; СО₂ 8-10%) при температуре 37°С до концентрации не менее 10⁹ КОЕ/мл. После этого в биомассу бактерий вводят суспензию бактериофага Helicobacter pylori (НР-7Ф) с концентрацией фага 10⁶ БОЕ мл и культивируют в том же режиме в течение 24 часов до полного лизиса бактериальной популяции. Суспензию центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация фага составляет 10¹⁰ БОЕ/мл. Перед фасовкой в препарат вводят 1%-ный раствор хинозола при следующем конечном содержании ингредиентов полученного средства, мас.%:

очищенная суспензия бактериофага Нelicobacter

pylori с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/мл 10,0-20,0

1%-ный раствор хинозола 0,5-1,0

вода остальное до 100%

Далее жидкую форму бактериофага фасуют в стерильных условиях и хранят при температуре +(2-10)°С.

Пример 2. Получение сухой формы препарата на основе жидкой формы бактериофага Helicobacter pylori (НР-7Ф-Х)

Стерильную вируссодержащую жидкость получают, как в примере 1. К стерильной вируссодержащей жидкости и со специфической активностью не менее 10¹⁰ БОЕ/мл при непрерывном перемешивании одновременно вводят сорбит (5,0 мас.%), стерильные водные растворы 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) до конечной концентрации (5,0 мас.%). Полученный жидкий полуфабрикат препарата разливают в ампулы по 0,5 мл в каждую и замораживают при температуре -60°С в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях при следующем конечном содержании компонентов в сухом средстве, мас.%:

сорбит 20,0-25,0

желатоза 20,0-25,0

хинозол 0,03-0,06

сухая масса бактерифагa ocтальное до 100%

После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают.

Ниже в таблице приведены данные по хранению жидкой и сухой препаративных форм фага Helicobacter pylori (НР-7Ф-Х) №МЦКМ F-07.

Таблица
Данные по хранению заявляемых препаративных форм фага Н. Pylori
Показатель	Температура хранения, °С	Препаративная форма фага
Жидкая, БОЕ/мл	Сухая, БОЕ/г
Лигич. активность фагов после приготовления препарата	+(4-7)	4,5·109	2,5·109
Литич. активность фагов после 1 года хранения	+(4-7)	1,0·109	2,0·109
Литич. активность фагов после 2-х летнего хранения	-(4-7)	0	8,5·108

Из таблицы видно, что жидкая препаративная форма фага сохраняет литическую активность в течение 1 года, а сухая - в течение 2-х лет.

Исследование препарата фага на животных. В эксперименте на животных (свиньях) воспроизведен гастрит путем введения микроорганизмов Helicobacter pylori в желудок указанным животным. Лечение животных осуществлялось путем смешивания с кормом (отруби) препаративной формы фага Helicobacter pylori (НР-7Ф-Х) в дозе 1 г препарата на 1 кг корма и скармливания его животным в течение 1 недели. Вскрытие одной группы животных до лечения и другой группы после лечения показало высокую эффективность действия как жидкой, так и сухой формы заявляемого препарата.

1. Штамм бактериофага Helicobacter pylori, депонированный в коллекции Межрегионального центра коррекции микроценоза человека (МЦКМЧ) под регистрационным номером МЦКМ F-07, обладающий литической активностью в отношении бактерий Helicobacter pylori.

2. Способ получения противогастритного и противоязвенного средства, включающий получение очищенной суспензии бактериофага и введение в него дополнительных компонентов, отличающийся тем, что в качестве очищенной суспензии бактериофага используют суспензию бактериофага Helicobacter pylori №МЦКМ F-07 по п.1 с литической активностью не менее 10⁹ БОЕ/мл, а в качестве дополнительных компонентов используют раствор хинозола при следующем конечном содержании ингредиентов полученного средства, мас.%:

Очищенная суспензия бактериофага Helicobacter

pylori с литической активностью 10⁹ БОЕ/мл 10,0-20,0

1%-ный Раствор хинозола 0,5-1,0

Вода Остальное

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в средство дополнительно вводят сорбит и желатозу, полученную смесь замораживают со скоростью 0,1-3,0°С/мин до температуры ниже температуры стеклования аморфной фазы, оставшейся после кристаллизации льда, а процесс сушки средства производят лиофилизацией при следующем конечном содержании компонентов в сухом средстве, мас.%:

Сорбит 20,0-25,0

Желатоза 20,0-25,0

Хинозол 0,03-0,06

Сухая масса бактериофага Остальное