Антигенные менингококковые пептиды (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, обусловленных Neisseria meningitidis. Белок по изобретению включает один или более фрагментов белков N. meningitidis с известными аминокислотными последовательностями, при этом данный фрагмент включает одну или более антигенных детерминант и имеет не более 1977 аминокислот SEQ ID NO:1 и/или не более 1531 аминокислот SEQ ID NO:2, которые приведены в тексте описания, при условии, что аминокислотная последовательность белка в целом не характеризуется аминокислотными последовательностями, представленными в NO:1 и NO:2. Каждый из белков по изобретению кодируется нуклеиновой кислотой (НК) с нуклеотидной последовательностью, в соответствии с генетическим кодом определяющей аминокислотную последовательность белка. Белки и нуклеиновые кислоты по изобретению используются для производства лекарственного средства для лечения и профилактики инфекции, вызываемой нейссериями, а также для производства диагностического реагента для обнаружения нейссерий или специфических антител. Описывается фармакологическая композиция на основе белка или НК в эффективном количестве с приемлемым носителем. Данная композиция предназначена для лечения инфекции, вызываемой N. meningitidis. В целях профилактики композицию используют в качестве вакцины. Использование изобретения позволяет в определенной степени преодолеть разнообразие антигенных свойств нейссерий, следствием чего является улучшение профилактики лечения и профилактики инфекции. 6 с. и 18 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки во всей полноте. В частности, в данное описание включено в качестве ссылки содержимое международной заявки на патент W099/36544.

Область изобретения

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis.

На основе капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто причастным к эпидемическому заболеванию расположенной южнее Сахары части Африки. Серологические группы В и С являются ответственными за обширное большинство случаев в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Менингококковая вакцина, используемая в настоящее время, является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси белков наружной мембраны (ОМР). Для преодоления разнообразия антигенных свойств были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками для применения в вакцинах наружной мембраны были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не смог преодолеть разнообразие антигенных свойств [например, Ala'Aldeen and Borriello (1996) Vaccine 14(1):49-53].

Изобретение

Данное изобретение относится к фрагментам белков, описанным в международной патентной заявке WO99/36544, причем данные фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту.

Таким образом, если длина любой конкретной последовательности белка, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам (см. таблицу II), то данное изобретение относится к фрагментам самое большее х-1 аминокислот данного белка. Фрагмент может быть более коротким, чем эта длина (например, х-2, х-3, х-4,...) и содержит предпочтительно 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Данный фрагмент может быть таким коротким, как 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, приведенные в таблице I, или их субпоследовательности. Данные фрагменты могут быть более длинными, чем фрагменты, представленные в таблице I, например, если фрагмент в таблице I простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, то данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

Данное изобретение также относится к полипептидам, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) данным фрагментам. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности является предпочтительно более высокой, чем 50% (например, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты данных фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществленного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), использующего поиск аффинного пропуска с параметрами штраф за открытие пропуска = 12 и штраф за удлинение пропуска = 1.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим один или более описанных выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в его объем белки, содержащие какую-либо из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544 (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,..., 86, 88, 90 WO99/36544).

Белки данного изобретения могут быть, конечно, получены различными способами (например рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные, С-концевые и/или N-концевые слитые белки и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащие других белков Neisseria или белков клетки-хозяина). Короткие белки предпочтительно получают с использованием химического пептидного синтеза.

Согласно другому аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме антитела, которые узнают одну из 45 полных белковых последовательностей в WO99/36544. Данные антитела могут быть поликлональными или, предпочтительно, моноклональными и могут быть получены любыми подходящими способами.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим пептидные последовательности, распознаваемые данными антителами. Данные пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в WO99/36544, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов при связывании с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме нуклеиновую кислоту, кодирующую одну из 45 белковых последовательностей в WO99/36544.

Кроме того, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) данным последовательностям. Далее, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, при 65°С в растворе 0,1xSSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондирования).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную форму, двухцепочечную форму, форму векторов, зондов и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные каркасные структуры, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту данного изобретения. Данные композиции могут быть применимы, например, в качестве вакцин, или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно также относится к применению нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (например, N. gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела в соответствии с данным изобретением.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение относится к различным способам.

Относится к способу получения белков данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, обеспечивающих экспрессию белка.

Относится к способу получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют отчасти или полностью химическими средствами.

Относится к способу обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации для образования дуплексов и (b) детектирования указанных дуплексов.

Относится к способу обнаружения белков данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования антитела данного изобретения с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) детектирования указанных комплексов.

Краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или диагностических целей), следует далее. Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет предусматривать, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning. Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification; Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds 1986).

В данном описании используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента, цитируемые здесь, включены в данное описание во всей полноте в качестве ссылки.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общей суммы Х+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере приблизительно 90% по весу общего Х+Y в данной композиции, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или даже 99% по весу.

Термин “содержащий” обозначает “включающий в себя”, а также “составляющий”, например, композиция, “содержащая” Х может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин “антигенная детерминанта” включает в себя В-клеточные и Т-клеточные эпитопы.

Термин “гетерологичные” относится к двум биологическим компонентам, которые не обнаруживаются вместе в природе. Данные компоненты могут быть клетками-хозяевами, генами или регуляторными областями, такими как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, например, когда промотор, гетерологичный гену, функционально связан с данным геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной мышиной клетке-хозяина. Следующим примером могли бы быть два эпитопа из одного и того же или из различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, неприродного происхождения.

“Сайт инициации репликации” является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способная к репликации под ее собственным контролем. Сайт инициации репликации может нуждаться в векторе для репликации в конкретной клетке-хозяине. В случае некоторых сайтов инициации репликации экспрессирующий вектор может высокопродуктивно воспроизводиться в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами сайтов инициации репликации являются автономно реплицирующие последовательности, эффективные в дрожжах, и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Экспрессирующие системы

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут экспрессироваться во многих различных экспрессирующих системах; например в системах, используемых с клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Экспрессирующие системы млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно помещена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) левее от сайта инициации транскрипции. Считают, что ТАТА-бокс управляет РНК-полимеразой II для начала синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих будет содержать также левый элемент промотора, обычно расположенный на 100-200 п.н. левее от ТАТА-бокса. Левый элемент промотора определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.].

Гены вирусов млекопитающих часто высокопродуктивно экспрессируются и имеют широкий круг хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей, большой поздний промотор аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, полученные не из вирусных генов, такие как мышиный ген металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может индуцироваться глюкокортикоидом в гормон-чувствительных клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную последовательность ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичными или гетерологичными промоторами, причем синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены левее или правее от сайта инициации транскрипции, в нормальной или обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие из вирусов, могут быть особенно применимы, так как они обычно имеют более широкий круг хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al (1985 EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, полученные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al.(1989b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть связана непосредственно с данной молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, N-конец может быть отщеплен от данного белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные промоторы могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством образования химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из клетки. Состоящий из трех частей лидер аденовируса является примером лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой молекулы мРНК образуется сайт-специфическим посттранскриционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D.Hames and D.M.Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Такие последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может транслироваться в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, полученные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным свитами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если желательно. Экспрессирующие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как в нехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Реплицирующие системы млекопитающих включают системы, произведенные из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазммды, содержащие реплицирующие системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175], или полиомавирусов, реплицируются чрезвычайно высокопродуктивно в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, полученные из папилломавируса крупнорогатого скота и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающих-бактерий включают pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Клеточные линии млекопитающих, доступные для экспрессии, известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, Нер G2), и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомых и функционально связан с регуляторными элементами в данном векторе. Конструирование вектора использует способы, которые известны в данной области. Обычно компоненты данной экспрессирующей системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, которая содержит как фрагмент генома бакуловируса, так и подходящий сайт рестрикции для инсерции гетерологичного гена или генов, которые должны экспрессироваться; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это делает возможной гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомых и среду для выращивания.

После встраивания последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, данный вектор и вирусный геном дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где данному вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Экспрессируется упакованный рекомбинантный вирус и рекомбинантные стерильные пятна идентифицируют и очищают. Материалы и способы для экспрессирующих систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме наборов из, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и во всей полноте описаны у Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (далее называемой "Summers and Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в геном бакуловируса, описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно помещают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик, трансдуцирующий вектор). Такая конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый с его собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне (автономной единице репликации), таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время наиболее часто используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Были также сконструированы многие другие векторы, известные специалистам в данной области. Они включают, например, pVL985 (который изменяет стартовый кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI 32 п.н. правее от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Данная плазмида обычно также содержит сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (аmр) и сайт инициации репликации для отбора и размножения в Е. coii.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 5'→3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Обычно эта область инициации транскрипции включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который в случае его присутствия обычно расположен дистально относительно структурного гена. Экспрессия может быть регулируемой или конститутивной.

Структурные гены, обильно транскрибируемые в последние периоды вирусного инфекционного цикла, обеспечивают особенно подходящие промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, полученные из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрин, Friesin et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression, " в: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и ген, кодирующий белок р10, Vlak et al. (1988), J.Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модификаций клеток млекопитающих (такие как сигнал расщепления пептидов, протеолитического расщепления и фосфорилирования), по-видимому, узнаются клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, сохраняются между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидерные последовательности (лидеры), не происходящие из насекомых, такие как лидеры, происходящие из генов, кодирующих α-интерферон человека, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Labaeq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может секретироваться. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие стартовому сигналу ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут секретироваться из клетки насекомого посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в насекомых. Данный фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией данного белка в эндоплазматический ретикулум.

После инсерции ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего продукт экспрессии, являющийся предшественником данного белка, клетку-хозяин насекомого котрансформируют гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно котрансфекцией. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно будут содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусном вирусе являются известными в данной области (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может происходить в ген, например, ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может происходить также в сайт рестрикционного фермента, сконструированного в желательном бакуловирусном гене. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в данном экспрессирующем векторе фланкирована как 5', так и 3'полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена правее от промотора полиэдрина.

Новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают затем в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между приблизительно 1% и приблизительно 5%); таким образом, большая часть данного вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, требуется способ для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом данной экспрессирующей системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется чрезвычайно высокопродуктивно в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусной инфекции. Накопленный белок полиэдрин образует внутриклеточные тельца включения, которые содержат заключенные в них частицы. Тельца включения размером до 15 мкм сильно преломляют свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализировать под световом микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом, не содержат телец включения. Чтобы отличить рекомбинантный вирус от вируса дикого типа, супернатант после трансфекции помещают для образования бляшек на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие телец включения (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие телец включения (являющееся признаком рекомбинантного вируса). "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al. eds) d 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).

Были разработаны рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы для инфицирования нескольких клеточных линий насекомых. Например, были сконструированы рекомбинантные бакуловирусы для, inter alia: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156 и см. в общем, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культивирования клеток являются комимерчески доступными как для прямой, так и для слитой экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток обычно известна среднему специалисту в данной области. См., например. Summers and Smith supra.

Затем модифицированные клетки насекомых могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая делает возможной стабильное сохранение плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может быть выращен до высокой плотности и экспрессия может быть индуцирована. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна непрерывно циркулировать при удалении представляющего интерес продукта и увеличении истощаемых питательных веществ. Данный продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. Соответствующим образом продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, для удаления по существу любых белков насекомых, которые также секретируются в среду или возникают вследствие лизиса клеток насекомых, чтобы обеспечить продукт, который является по меньшей мере по существу не содержащим дебриса хозяина, например белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые делают возможной экспрессию кодирующей последовательности рекомбинантного белка. Условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако данные условия могут быть легко определены средним специалистом в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существуют многочисленные системы экспрессии генов, использующие культуры растительных клеток и целые растения. Примеры систем экспрессии генов растительными клетками включают системы, описанные в таких патентах, как патент США 5693506; патент США 5659122 и патент США 5608143. Дополнительные примеры экспрессии генов в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме описанных выше ссылок, у Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al.. Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al.. Gene 55:353-356 (1087); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, может быть найдено у R.L.Jones and J.MacMiilin, Gibberellins: в: Advanced Plant Physiology, Malcolm B.Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессируюшую кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Данную экспрессирующую кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор с сопутствующими последовательностями левее и правее от экспрессирующей кассеты, подходящими для экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые свойства для вектора, чтобы данные векторы перемещали ДНК из первоначального клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательного хозяина-растение. Конструкция исходного бактериального/растительного вектора предпочтительно будет предусматривать прокариотический сайт инициации репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и для трансформации с использованием Agrobacterium Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается простому определению, данная конструкция будет предпочтительно содержать также ген селектируемого маркера, подходящий для установления трансформации клетки растения. Общий обзор подходящих маркеров, например, для видов семейства злаковых, может быть найден у Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Также рекомендуются последовательности, полезные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут включать транспозонные последовательности и тому подобные последовательности для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессирующей кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, могут также присутствовать в данном векторе, как известно в данной области.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессирующую кассету для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно это будет только одна экспрессирующая кассета, хотя возможны и две или большее количество экспрессирующих кассет. Рекомбинантная экспрессирующая кассета будет содержать кроме кодирующей последовательности гетерологичного белка следующие элементы: промоторную область, 5'-нетранслируемые последовательности растений, инициирующий кодон при наличии такового в данном структурном гене и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты ферментативной рестрикции на 5'- и 3'-концах данной кассеты делают возможным легкое встраивание в исходный вектор.

Гетерологичная последовательность может кодировать любой белок, относящийся к данному изобретению. Последовательность, кодирующая представляющий интерес белок, будет кодировать сигнальный пептид, который делает возможными процессинг и транслокацию данного белка при необходимости и обычно не будет содержать какой-либо последовательности, которая может приводить к связыванию желательного белка данного изобретения с мембраной. Поскольку в большинстве случаев область инициации транскрипции будет областью для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания, посредством использования сигнального пептида, который относится к транслокации, можно также обеспечить транслокацию представляющего интерес белка. Таким путем представляющий интерес белок (белки) будут перемещаться из клеток, в которых они экспрессируются, и могут быть эффективно собраны. Обычно секреция в семенах происходит через алейроновый или щитковый слой в эндосперм семени. Хотя и не является обязательным, чтобы белок секретировался из клеток, в которых данный белок продуцируется, что облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку конечная экспрессия желательного генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут процессированы из последовательности в виде интронов аппаратом сплайсингосом хозяина. Если это так, может быть проведен сайт-направленный мутагенез “интронной” области для предотвращения потери части генетической матрицы в виде ложного интронного кода. Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.

Данный вектор может быть введен микроинъекцией непосредственно в клетки растений с использованием микропипеток для механического переноса рекомбинантной ДНК, Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в клетку растения с использованием полиэтиленгликоля, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим способом введения сегментов нуклеиновых кислот является баллистическое введение малых частиц с нуклеиновой кислотой на высокой скорости либо в матриксе небольших гранул или частиц, либо на их поверхности, Klein, et al.. Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, описывающие бомбардировку частицами эндоспрема ячменя для получения трансгенного ячменя. Еще одним способом введения является слияние протопластов с другими организмами или с мицеллами, клетками, лизосомами или другими сливаемыми имеющими липидную поверхность тельцами, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

Вектор может быть также введен в клетки растений электропорацией (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). В этом способе протопласты растений подвергают электропорации в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля высокой напряженности обратимо делают мембрану проницаемой, делая возможным введение плазмид. Электропорированные растительные протопласты повторно образуют клеточную стенку, делятся и образуют растительный каллус.

Все растения, протопласты из которых могут быть выделены и культивированы с образованием целых регенерированных растений, могут быть трансформированы посредством данного изобретения таким образом, что получают целые растения, которые содержат перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, в том числе, но не только, основных видов сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощей. Некоторые подходящие растения включают, например, виды из родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Thifolium,

Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Средства для регенерации варьируются от вида к виду растений, но обычно получают сначала суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичного гена. Образуют каллусную ткань и побеги могут быть индуцированы из каллуса и затем укоренены. Альтернативно, из суспензии протопластов может быть индуцировано образование зародышей. Эти зародыши прорастают, как природные зародыши, с образованием растений. Культуральные среды обычно содержат различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокинины. Предпочтительно также добавлять к среде глутаминовую кислоту и пролин, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация будет зависеть от среды, генотипа и истории культуры. Если данные три переменных контролируются, то регенерация является вполне воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культуры клеток растений желаемый белок данного изобретения может экскретироваться, или альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. Если желаемый белок данного изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и не содержащие зародышей половинки семян или другая ткань растения может быть механически измельчена для высвобождения любого секретируемого белка между клетками и тканями. Данная смесь может быть суспендирована в буферном растворе для извлечения растворимых белков. Затем могут быть использованы общепринятые способы выделения и очистки, применяемые для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, кислорода и объемов должны корректироваться посредством рутинных способов для оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.

iv. Бактериальные системы

Бактериальные способы экспрессии известны в данной области. Бактериальный промотор является любой последовательностью ДНК, способной связывать бактериальную РНК-полимераэу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться с сайтом связывания РНК-полимеразы, в котором начинается синтез РНК. Оператор делает возможной негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, когда репрессорный белок гена может связывать оператор, и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута связывающей активаторный белок последовательностью гена, которая, если она присутствует, находится обычно проксимально (5') к последовательности, связывающей РНК-полимеразу. Примером активаторного белка гена является катаболитный активаторный белок (CAP), который помогает инициировать транскрипцию lac оперона у Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают промоторные последовательности, происходящие из ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают промоторные последовательности, происходящие из биосинтетических ферментов, таких как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Патент США 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-лаотамазы (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes," In Interferon 3 (ed. I.Gresser)], промоторные системы бактериофага лямбда PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] и Т5 [Патент США 4689406] также обеспечивают применимые промоторные последовательности.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть соединены с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [Патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей как промотора trp, так и оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать природные промоторы небактериального происхождения, которые способны связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Природный промотор небактериального происхождения может быть также сопряжен с совместимой РНК-полимеразой для продуцирования высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК-полимераза бактериофага Т7/промотор является примером сопряженной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может также состоять из промотора бактериофага и операторной области Е. coli (ЕР-А-0267851). Кроме функционирующей промоторной последовательности эффективный сайт связывания рибосом также применим для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е. coli сайт связывания рибосом называется последовательностью Шайна-Далгарно (3D) и он включает в себя инициирующий кодон (ATG) и последовательность длиной 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотида левее от инициирующего кодона [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Считают, что последовательность 3D стимулирует связывание мРНК с рибосомой посредством спаривания оснований между последовательностью 3D и 3'-концом рРНК 163 Е. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and. Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)] для экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания рибосом [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом или инкубированием in vivo или in vitro с бактериальной метионин-N-концевой пептидазой (ЕРО-А-0 219237).

Слитые белки обеспечивают альтернативу прямой экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. Например, ген клетки бактериофага лямбда может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в бактериях. Полученный слитый белок предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (фактора X) для отщепления белка бактериофага от чужеродного гена [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Слитые белки могут быть также получены с последовательностями из генов lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Micribiol. 135:11] и Chey [EP-A-0 324 647]. Данная последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой слитый белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента последовательности сигнального пептида, который относится к секреции чужеродного белка в бактериях [Патент США 4336336]. Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки. Данный белок может секретироваться либо в среду для выращивания (грамположительные бактерии), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембранами клетки (грамотрицательные бактерии). Предпочтительно, имеются сайты процессинга, которые могут расщепляться либо in vivo, либо in vitro, кодируемые между фрагментом сигнального пептида и чужеродным геном.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых бактериальных белков, таких как ген белка наружной мембраны Е. coli (ompA) [Masui et al. (1982), в: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] и ген сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. В качестве дополнительного примера, сигнальная последовательность гена альфа-амилазы из различных штаммов Bacillus может быть использована для секреции гетерологичных белков из В. subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК.

Последовательности терминации транскрипции часто включают последовательности ДНК из приблизительно 50 нуклеотидов, способные образовывать структуры петли со стеблем, которые способствуют терминации транскрипции. Примеры включают последовательности терминации транскрипции из генов с сильными промоторами, таких как ген trp в Е. coii, а также другие биосинтетические гены.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнальную последовательность (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерии. Репликон имеет систему репликации, позволяющую ему сохраняться в прокариотическом хозяине для экспрессии или клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и бактериальной хромосоме. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0 127 328). Интегрирующие векторы могут состоять также из последовательности бактериофага или транспозона.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии устойчивыми к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующих векторах. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие бактерии. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 94/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0036776, EP-A-0136829 и ЕР-А-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Патент США 4745056].

Способы введения экзогенной ДНК в бактериальных хозяев хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных СаСl₂ или другими агентами, такими как двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК может быть также введена в бактериальные клетки электропорацией. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемого вида. См., например, [Masson et ai. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036 259 и EP-A-0063953; WO 94/04551, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:940, Campylobacter], [Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An imprived method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. В Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et ai. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173, Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, в: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et ai. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4^th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Дрожжевые экспрессирующие системы также хорошо известны среднему специалисту в данной области. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы ("ТАТА-бокс") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый расположенной левее активаторной последовательностью (UAS), который, если он присутствует, обычно находится дистально относительно структурного гена. UAS делает возможной регулируемую (индуцируемую) экспрессию. Конститутивная экспрессия происходит в отсутствие UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Дрожжи представляют собой организм с активным метаболическим путем, таким образом, последовательности, кодирующие ферменты в данном метаболическом пути, обеспечивают особенно ценные промоторные последовательности. Примеры включают алкогольдегидрогеназу (ADH) (ЕР-А-0284044), глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), енолазу, глюкокиназу, гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (ЕР-А-0329203). Ген РНO5, кодирующий кислую фосфатазу, также относится к ценным промоторным последовательностям [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с областью активации транскрипции другого дрожжевого промотора с образованием синтетического гибридного промотора.. Примеры таких гибридных промоторов включают регуляторную последовательность ADH, присоединенную к области активации транскрипции GAP (Патенты США №4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, объединенных с областью активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать природные промоторы недрожжевого происхождения, которые способны связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов включают, inter alia, промоторы, описанные [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," в: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом.

Слитые белки обеспечивают альтернативу экспрессирующимся системам дрожжей, а также системам млекопитающих, бакуловирусным и бактериальным экспрессирующимся системам. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии эта конструкция будет обеспечивать слияние данных двух аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в дрожжах. Последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок (например, WO88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который относится к секреции чужеродного белка в дрожжах. Предпочтительно имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых дрожжевых белков, таких как ген дрожжевой инвертазы (ЕР-А-0012873; JPO, 62096086) и ген А-фактора (Патент США 4588684). Альтернативно, существуют лидеры недрожжевого происхождения, такие как лидер интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом лидеров секреции являются лидеры, которые используют ген альфа-фактора дрожжей, который содержит как “пре”-сигнальную последовательность, так и “про”-область. Типы фрагментов альфа-фактора, которые могут быть применены, включают полноразмерный пре-про-альфа-фактор (приблизительно 83 аминокислотных остатка), а также укороченные (процессированные) лидеры альфа-фактора (обычно приблизительно 25 - приблизительно 50 аминокислотных остатков) (Патенты США 4546083 и 4870008, ЕР-А-0324274). Дополнительные лидеры, использующие лидерный фрагмент альфа-фактора, который относится к секреции, включают гибридные лидеры альфа-фактора, изготовленные из пре-последовательности первых дрожжей, но про-области из альфа-фактора вторых дрожжей (например, см. WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами последовательностей терминации являются последовательности, кодирующие гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как дрожжи или бактерии. Репликон может иметь две системы репликации, позволяющие ему сохраняться, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов дрожжи-бактерии включают YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646] и YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина. См., например. Brake et al., supra.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную дрожжевой хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться, и предпочтительно содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие данную экспрессирующую конструкцию. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и дрожжевой хромосоме [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен в специфический локус в дрожжах посредством выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в данный вектор. См. Orr-Weaver et al., supra. Одна или несколько экспрессирующих конструкций могут интегрироваться, возможно, влияя на уровни продуцируемого рекомбинантного белка [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в данный вектор, могут встречаться либо в виде единственного сегмента в векторе, что приводит к интеграции целого вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных соседним сегментам в хромосоме и фланкирующим экспрессирующую конструкцию в векторе, что может приводить к стабильной интеграции только экспрессирующей конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут включать биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевом хозяине, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, и ALG7 и ген устойчивости G418, который придает устойчивость в дрожжевых клетках к туникамицину и G418 соответственно. Кроме того, подходящий селектируемый маркер может также обеспечивать дрожжи способностью расти в присутствии токсичных соединений, таких как металл. Например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессируюшие и трансформирующие векторы либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие дрожжи. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих дрожжей: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Патент США No.4837148 и 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J.Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706], и Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:38047] Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Способы введения экзогенной ДНК в дрожжевые хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемых видов дрожжей. См., например, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Blol. 6:142; Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) No2. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 754:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Патент США Nos. 4837148 and 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153-163 Saccharomyces]; [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Антитела

В применении здесь термин “антитело” относится к полипептиду или группе полипептидов, состоящих из по меньшей мере одного антигенсвязывающего (активного) центра. “Антигенсвязывающий сайт” представляет собой трехмерное связывающее пространство с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарными свойствам эпитопа антигена, что позволяет связывание данного антитела с данным антигеном. “Антитело” включает в себя, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, измененные антитела, одновалентные антитела, Fab-белки и антитела с единственным доменом.

Антитела против белков данного изобретения применимы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и различения / идентификации менингококковых белков.

Антитела к белкам данного изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены общепринятыми способами. Обычно белок используют сначала для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными для получения поликлональных сывороток вследствие получаемого объема сыворотки и доступности меченых антител против иммуноглобулинов кролика и козы. Иммунизацию обычно выполняют смешиванием или эмульгированием белка в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фройнда, и инъекцией данной смеси или эмульсии парентерально (обычно подкожно или внутримышечно). Доза 50-200 мкг/инъекция является обычно достаточной. Иммунизацию обычно повторяют (бустер-иммунизация) спустя 2-6 недель посредством одной или нескольких инъекций данного белка в солевом растворе, предпочтительно с использованием неполного адъюванта Фройнда. Альтернативно можно генерировать антитела иммунизацией in vitro с использованием известных в данной области способов, что для целей данного изобретения считается эквивалентным иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают отбором крови у иммунизированного животного в стеклянный или пластиковый резервуар, инкубированием крови при 25°С в течение одного часа с последующим инкубированием при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку извлекают центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). Из кроликов может быть получено 20-50 мл за один отбор крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного способа Kohler and Milstein [Nature (1975) 256:495-96] или его модификации. Обычно мышь или кролика иммунизируют, как описано выше. Однако другим, отличным от отбора крови у животного для экстракции сыворотки, является извлечение селезенки (и необязательно несколько больших лимфатических узлов) и диссоциирование ее на отдельные клетки. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически прилипших клеток) нанесением клеточной суспензии в чашку или лунку, покрытую белковым антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфический для данного антигена, связываются с данной чашкой и не вымываются с остатком суспензии. Затем полученные В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки индуцируют для слияния с миеломными клетками с получением гибридом и культивируют в селективной среде (например, среде с гипоксантином, аминоптерином, тимидином, “HAT”). Полученные гибридомы высевают с использованием лимитирующего разведения и анализируют на продуцирование антител, которые связываются специфически с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем отобранные mAb-секретирующие гибридомы культивируют либо in vitro (например, во флаконах для культуры ткани или в реакторах с полыми волокнами) или in vivo (в виде асцитов мышей).

Если желательно, антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²P и ¹²⁵I), электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров специфического связывания. Ферменты обычно детектируют по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно детектируют по ее способности превращать 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно определяемый при помощи спектрофотометра. Термин "партнер специфического связывания" относится к белку, способному связывать молекулу лиганда с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и специфического для него моноклонального антитела. Другие партнеры специфического связывания включают биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не предназначено для распределения различных меток по категориям на отличающиеся классы, так как одна и та же метка может служить меткой в нескольких различных режимах. Например, ¹²⁵I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электроноплотного реагента. HRP может служить в качестве фермента или в качестве антигена для mAb. Далее, можно комбинировать различные метки для желаемого эффекта. Например, mAb и авидин также необходим для метки при практическом использовании данного изобретения: таким образом, один может метить mAb биотином и детектировать его присутствие авидином, меченным ¹²⁵I, или использовать mAb анти-авидином, меченным HRP. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными для среднего специалиста в данной области и рассматриваться как эквивалентные объему данного изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, антитела, либо нуклеиновые кислоты данного изобретения. Фармацевтические композиции будут содержать терапевтически эффективное количество либо полипептидов, антител, либо полинуклеотидов заявляемого изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество" в применении здесь относится к количеству терапевтического агента, достаточного для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния или для выявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического действия. Это действие может быть обнаружено, например, с использованием химических маркеров или уровней антигена. Терапевтические эффекты включают также ослабление физических симптомов, например понижение температуры тела. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и состояния здоровья субъекта, природы и степени тяжести состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, не имеет смысла указывать заранее точное эффективное количество. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено в ходе рутинных экспериментов и определяется лечащим врачом.

Для целей данного изобретения эффективная доза будет составлять от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или от 0,05 до приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкции для индивидуума, которому ее вводят.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены и другие терапевтические агенты. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, получающего данную композицию, и который может вводиться без чрезмерной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области.

Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, буферные вещества и т.п. Обычно терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемый носитель включены также липосомы.

Способы доставки

После приготовления, композиции данного изобретения могут быть непосредственно введены субъекту. Данными субъектами, подвергающимися лечению, могут быть животные; в частности человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в очаг. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальное, или чрескожное, введение (например, см. WO98/20734), иглы и генные пушки или гипоспреи. Схема введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Вакцины

Рассматриваемые в данном изобретении вакцины могут быть либо профилактическими (т.е. для предупрежедния инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Такие вакцины содержат иммунизирующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с “фармацевтически приемлемыми носителями”, которые включают любой носитель, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, принимающего данную композицию. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Далее, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид из дифтерийного, столбнячного, холерного, Н. pylori и др. патогенов.

Предпочтительные адъюванты для стимуляции эффективности композиции включают, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) композиции эмульсии типа масло-в-воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например, (a) MF59™ (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell and Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Span 85 (иногда содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя и необязательно), приготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Твин 80, 5% блокированный плуроником полимер L121 и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вортексе для генерирования эмульсии частиц большего размера, и (с) система адъюванта Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 3% сквален, 0,2% Твин 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), трегалозодимиколата (ТDМ) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™); (3) могут быть использованы сапониновые адъюванты, такие как Стимулов™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), или генерируемые из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.д.; и (6) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для усиления эффективности композиции. Предпочтительными являются квасцы и MF59™.

Указанные выше мурамилпептиды включают, но не ограничиваются ими, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1’-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно содержат разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, рН-буферящие вещества и т.п.

Обычно, терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомы для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше при рассмотрении приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, применяемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенного или иммуногенного полипептидов, а также любой другой из вышеуказанных компонентов по необходимости. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества индивидууму в одноразовой дозе или в виде части дозы несколько раз является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьируется в зависимости от здоровья и физического состояния проходящего лечение индивидуума (например, примата не человека, примата и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки лечащего врача медицинской ситуации и других имеющих отношение факторов. Ожидается, что это количество будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен рутинными испытаниями.

Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, например, инъекцией, либо подкожно, внутримышечно, либо трансдермально/чрескожно (например, WO98/20734). Другие композиции, пригодные для других способов введения, включают пероральные и легочные композиции, суппозитории и трансдермальные применения. Схема введения лекарственного средства может быть схемой введения с одноразовой дозой или схемой введения со множественными дозами. Вакцина может вводиться в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам на основе белков, может быть использована ДНК-вакцинация [Robinson and Torres (1977) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; см. здесь ниже].

Векторы доставки генов

Векторы генной терапии для доставки конструкций, включающих в себя кодирующую последовательность терапевтического агента данного изобретения, подлежащих доставке млекопитающему для экспрессии в данном млекопитающем, могут вводиться локально (местно) или системно. Эти конструкции могут использовать вирусные или невирусные подходы в схемах введения in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована при помощи эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Данное изобретение включает в себя векторы доставки генов, способные экспрессировать рассматриваемые последовательности нуклеиновых кислот. Вектор доставки генов является предпочтительно вирусным вектором и, более предпочтительно, ретровирусным, аденовирусным вектором, вектором на основе аденоассоциированного вируса (AAV), вируса герпеса или на основе альфа-вируса. Вирусный вектор может быть выступающим в качестве вектора астровирусом, коронавирусом, ортомиксовирусом, паповавирусом, парамиксовирусом, парвовирусом, пикорнавирусом, поксвирусом или тогавирусом. См., в общем. Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области, и ожидается, что любой ретровирусный вектор генной терапии является применимым в данном изобретении, в том числе ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O'Neiil (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части ретровирусного вектора для генной терапии могут происходить из различных ретровирусов. Например, LTR ретровектора могут происходить из вируса мышиной саркомы, сайт связывания тРНК из вируса саркомы Рауса, сигнал упаковки из вируса мышиного лейкоза и сайт инициации синтеза второй цепи из вируса птичьего лейкоза.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования компетентных в трансдукции частиц ретровирусного вектора посредством введения их в подходящие пакующие клеточные линии (см. патент США 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции в ДНК клетки-хозяина посредством включения химерного фермента интегразы в ретровирусную частицу (см. WO96/37626). Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является дефектным по репликации рекомбинантным вирусом.

Пакующие клеточные линии, пригодные для применения с описанными выше ретровирусными векторами, хорошо известны в данной области, их легко получить (см. WO95/30763 и WO92/05266), и они могут быть использованы для создания клеточных линий-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или "VCL") для получения рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно, пакующие клеточные линии получают из исходных клеток человека (например, клеток НТ1080) или исходных клеток норки, что исключает инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительные ретровирусы для конструирования ретровирусных векторов для генной терапии включают вирус птичьего лейкоза, вирус бычьего лейкоза, вирус мышиного лейкоза, индуцирующий клеточный центр (фокус) инфекции вирус норки, вирус мышиной саркомы, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы мышиного лейкоза включают 4070А и 1504 (Hartley and Rowe (1976) J. Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten,

Harvey вирус саркомы и Rauscher (ATCC No. VR-998) и вирус мышиного лейкоза Молони (ATCC No. VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция Типовых культур ("ATCC") в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов.

Примеры известных ретровирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, описанные в патентных заявках GB2200651, ЕР0415731, ЕР0345242, ЕР0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5219740, US 4405712, US 4861719, US 4980289, US 4777127, US 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg - 79:729-735; Mann (1983) Cel-Z 33:153; Cane (1984) Proc Naki Acad Sci 81:6349; и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Аденовирусные векторы генной терапии человека также известны в данной области и применимы в данном изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeid (1991) Science 252:431 и WO93/07283, WO93/06223 и WO93/07282. Примеры известных аденовирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, которые описаны в цитируемых выше ссылках и в WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO94/28938, WO95/11984, WO/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 и WO95/09654. Альтернативно, может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано у Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Векторы доставки генов данного изобретения включают также векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Основными и предпочтительными примерами таких векторов для применения в данном изобретении являются векторы на основе AAV-2, описанные у Srivastava, WO93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы заменой нуклеотидов, так что по меньшей мере 5 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохраняются, а остальные нуклеотиды D-последовательности делегированы или заменены ненативными нуклеотидами. Нативные D-последовательности инвертированных концевых повторов AAV являются последовательностями из 20 последовательных нуклеотидов в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. имеется одна последовательность на каждом конце), которые не участвуют в образовании HP. Ненативный замененный нуклеотид может быть любым нуклеотидом, иным, чем нуклеотид, обнаруживаемый в нативной D-последовательности в том же положении. Другими примерами используемых векторов AAV являются pWP-19, pWN-1, оба из которых описаны у Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого вектора AAV является psub201 (см. Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Следующим примером вектора AAV является двойной-D ITR-вектор. Конструирование двойного-D ITR-вектора описано в патенте США 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные Carter в Патенте США 4797368 и Muzyczka в Патенте США 5139941, Chartejee в Патенте США 5474935 и Kotin WO94/288157. Еще одним примером вектора AAV, применимого в данном изобретении, является SSV9AFABTKneo, который содержит энхансер AFP и промотор альбумина и управляет экспрессией преимущественно в печени. Его структура и конструкция описаны у Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Дополнительные векторы AAV генной терапии описаны в патенте США 5354678, патенте США 5173414, патенте США 5139941 и патенте США 5252479.

Векторы генной терапии данного изобретения включают также герпес-векторы. Основными и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такой как полипептиды, описанные в патенте США 5288641 и в патенте ЕР0176170 (Roizman). Следующие примеры векторов на основе вируса простого герпеса включают HFEM/ICP6-LacZ, описанный в WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller (1988) Science 241:1667-1669 и в WO90/09441 и WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 и HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield.), и векторы, депонированные АТСС в виде номеров доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260. Рассматриваются также векторы генной терапии на основе альфа-вируса, которые могут быть применены в данном изобретении. Предпочтительными векторами на основе альфа-вируса являются векторы, являющиеся вирусами Синдбиса (возбудителями лихорадки Синдбис), тогавирусы, вирусы лесов Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддельбурга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус Венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС VR923); АТСС VR-1250; АТСС VR1249; АТСС VR-532) и вирусы, описанные в патентах США 5091309, 5217879 и WO92/10578. Более конкретно, применимыми являются векторы на основе альфа-вирусов, описанные в заявке США с регистрационным номером 08/405627, поданной 15 марта 1995 года, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, патенте США 5091309 и патенте США 5217879. Такие альфа-вирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как АТСС в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов. Предпочтительно используют альфа-вирусы с пониженной токсичностью (см. USSN 08/679640).

Системы ДНК-векторов, такие как эукариотические слоистые экспрессирующие системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот данного изобретения. См. WO95/07994 в отношении подробного описания эукариотических слоистых экспрессирующих систем. Предпочтительно эукариотические слоистые экспрессирующие системы данного изобретения произведены из векторов на основе альфа-вируса и наиболее предпочтительно из векторов на основе вируса Синдбис.

Другие вирусные векторы для применения в данном изобретении включают векторы, произведенные из полиовируса, например, АТСС VR-58 и вирусов, описанных у Evans, Nature 339 (1989) 385 и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновируса, например, АТСС VR-1110 и вирусов, описанных у Arnold (1990) J. Ceil Biochem L401; поксвирусов, таких как поксвирус канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010 и вирусов, описанных у Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патенте США 4603112 и патенте США 4769330 и WO89/01973; вируса SV40, например, АТСС VR-305 и вирусов, описанных у Mulligan (1979) Nature 277:109 и Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, полученных с использованием способов обратной генетики, как описано в патенте США 5166057 и у Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami and Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110, (см. также McMichael (1963) NEJ Med 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вируса иммунодефицита человека, как описано в ЕР-0386882 и у Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вируса кори, например, АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и вирусов, описанных в ЕР-0440219; вируса Aura, например, АТСС VR-368; вируса Bebaru, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; вируса Cabassou, например, например, АТСС VR-922; вируса Chikungunya, например АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; вируса форта Morgan, например, АТСС VR-924; вируса Getah, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вируса Kyzylagach, например, АТСС VR-927; вируса Мауаго, например, АТСС VR-66; вируса Mucambo, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вируса Ndumu, например, АТСС VR-371; вируса Pixuna, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вируса Tonate, например, АТСС VR-925; вируса Triniti, например, АТСС VR-469; вируса Una, например, АТСС VR-374; вируса Whataroa, например, АТСС VR-926; вируса Y-62-33, например, АТСС VR-375; вируса O'Nyong, Eastern encephalitis, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вируса Weastern encephalitis, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и коронавируса, например, АТСС VR-740, и вирусов, описанных у Нагпге (1966) Proc Soc Exp Biol Med. 121:190.

Доставка композиций данного изобретения в клетки не ограничивается указанными выше вирусными векторами. Могут применяться другие способы и среды доставки, такие как, например, экспрессирующие векторы нуклеиновых кислот, поликатионная конденсированная ДНК, связанная или не связанная только с убитым аденовирусом, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года, и Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, связанная с лигандом ДНК, например, см. Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, клетки-носители для доставки эукариотических клеток, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и заявку на патент США с номером 08/404796, депонирование фотополимеризованных материалов гидрогелей, ручной пистолет для переноса генов на частицах, как описано в патенте США 5149655, ионизирующая радиация, как описано в патенте США 5206152 и в WO92/11033, нейтрализация заряда нуклеиновых кислот или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны у Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 и в Woffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585.

Может быть использован опосредованный частицами перенос генов, например, см. заявку США с регистрационным номером 60/023867. Кратко, последовательность может быть встроена в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубируют с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, как описано у Wu and Wu (1987) J. Biol. CHem. 262:4429-4432, инсулин, как описано у Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, галактоза, как описано у Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована депротеинизированная ДНК. Примеры способов введения депротеинизированной ДНК описаны в WO 90/11092 и патенте США 5580859. Эффективность поглощения может быть улучшена с использованием биодеградируемых гранул из латекса. Покрытые ДНК гранулы из латекса эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза данными гранулами. Данный способ может быть улучшен дополнительно обработкой гранул для увеличения гидрофобности и тем самым облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать в качестве векторов доставки генов, описаны в патенте США 5422120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 и ЕР-524968. Как описано в USSN.60/023867, при невирусной доставке последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубированы с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другие системы доставки включают применение липосом для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или повсеместно активных промоторов. Кроме того, невирусная доставка, пригодная для использования, включает в себя механические системы доставки, такие как подход, описанный у Woffendin et al., (1944) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24):11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и ее продукт экспрессии могут быть доставлены через депонирование фотополимеризованных материалов-гидрогелей. Другие общепринятые способы доставки генов, которые могут быть использованы для доставки кодирующей последовательности, включают, например, применение ручного пистолета для переноса генов на частицах, описанного в патенте США 5149655; применение ионизирующей радиации для активации перенесенного гена, как описано в патенте США 5206152 и WO92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных векторов доставки генов являются векторы, описанные в патенте США 5422120 и 4162915; в WO 95/13796; WO94/23697 и WO91/14445; в ЕР-0524968; и в Stryer, Biochemistry, pages 236-240 (1975) W.H.Freeman, Sab Francisko; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество вектора генной терапии согласно определенному выше термину. Для целей данного изобретения эффективная доза будет от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или 0,05 мг/кг - приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкций для индивидуума, которому их вводят.

Способы доставки

После приготовления полинуклеотидные композиции данного изобретения могут быть введены (1) непосредственно субъекту; (2) доставлены ex vivo к клеткам, полученным от данного субъекта; или (3) in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Субъектами для лечения могут быть млекопитающие или птицы. Субъектом для лечения может быть также человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в повреждение. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные применения (например, см. WO98/20734), иглы и генные пистолеты или гипоспреи. Режим введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Способы для доставки ex vivo и повторной имплантации трансформированных клеток субъекту известны в данной области и описаны, например, в WO93/14778. Примеры клеток, используемых в применениях ех vivo, включают, например, стволовые клетки, в частности гемопоэтические клетки, клетки лимфы, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Обычно доставка нуклеиновых кислот как для ех vivo, так и для in vitro применений может выполняться посредством следующих процедур, например, опосредованной декстраном трансфекции, осаждения фосфатом кальция, опосредованной полибреном трансфекции, слияния протопластов, электропорации, инкапсулирования полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямой микроинъекции ДНК в ядра, как хорошо известно в данной области.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Кроме фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, следующие дополнительные агенты могут быть использованы с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.

А. Полипептиды

Одним примером являются полипептиды, которые включают, без ограничения: асиалооромукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеиды; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Вирусные антигены, такие как белки оболочки, также могут быть использованы, а также белки из других инвазивных организмов, такие как пептид из 17 аминокислот из циркумспорозоитного белка Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.д.

Другими группами, которые могут быть включены, являются, например: гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тиреоидный гормон или витамины, фолиевая кислота.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.д.

Полиалкиленгликоль может также включаться с желательными полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, могут быть включены моно-, ди- и полисахариды. В предпочтительном варианте полисахаридом является декстран или DEAE-декстран, а также хитозан и поли(сополимер лактида и гликолида).

D. Липиды и липосомы

Желательные полинуклеотиды/полипептиды могут быть также инкапсулированы в липиды или упакованы в липсомы перед доставкой субъекту или к клеткам, полученным из него.

Инкапсулирование в липиды обычно выполняют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или улавливать и удерживать нуклеиновую кислоту. Отношение конденсированного полинуклеотида к препарату липида может варьироваться, но обычно будет около 1:1 (мг ДНК:микромоль липида) или липида может быть больше. В отношении обзора применения липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомные препараты для применения в данном изобретении включают катионогенные (положительно заряженные), анионогенные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионогенные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); и очищенные факторы транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), в функциональной форме.

Катионогенные липосомы являются легкодоступными. Например, содержащие N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмоний (DOTMA) липосомы доступны под товарным названием Липофектин от Gibco BRL, Grand Island, NY. (См. также Felgner supra). Другие коммерчески доступные липосомы включают трансфектасу (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионогенные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO90/11092, в отношении описания синтеза содержащих DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-триметиламмонио)пропан)липосом.

Подобным образом, анионогенные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, например, из Avani Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть легко получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают среди прочих фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Указанные материалы также могут быть смешаны с DOTMA и DOTAP в качестве исходных материалов в подходящих соотношениях. Способы получения липосом с использованием этих материалов хорошо известны в данной области.

Липосомы могут содержать мультиламеллярные везикулы (MLV), небольшие одноламеллярные везикулы (SUV) или большие одноламеллярные везикулы (LUV). Различные комплексы липосома-нуклеиновая кислота получают с использованием известных в данной области способов. См., например, Straubinger (1983) Meth. Iinmunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer and Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochim. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraiey (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348; Enoch and Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; и Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

E. Липопротеиды

Кроме того, липопротеиды могут включаться с доставляемым полинуклеотидом/полипептидом. Примеры используемых липопротеидов включают: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или слияния этих белков. Могут быть также использованы модификации природных липопротеидов, такие как ацетилированный LDL. Данные липопротеиды могут нацеливать доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие рецепторы липопротеидов. Предпочтительно, если липопротеиды включаются с доставляемым полинуклеотидом, то другой нацеливающий лиганд не включают в эту композицию.

Природные липопротеиды содержат липидную и белковую часть. Белковую часть называют апопротеином. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и E. По меньшей мере два из них содержат несколько белков, обозначенных римскими цифрами AI, AII, AIV; CI, СII, CIII.

Липопротеид может содержать более одного апопротеина. Например, природные хиломикроны содержат А, В, С и E, на протяжении времени эти липопротеиды теряют А и приобретают С и Е апопротеины. VLDL содержит апопротеины А, В, С и E, LDL содержит апопротеин В; HDL содержит апопротеины А, С и Е. Аминокислотный состав этих апопротеинов известен и описан, например, у Breslow (1985) Annu Rev. Biochem. 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J. Biol. Chem. 261:12918; Kane (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465 и Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

Липопротеиды содержат различные липиды, в том числе триглицериды, холестерин (свободный и в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется в природных липопротеидах. Например, хиломикроны содержат в основном триглицериды. Более подробное описание липидного содержимого природных липопротеидов может быть найдено, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Состав липидов выбирают для придания апопротеину конформации, удобной для рецептор-связывающей активности. Состав липидов может быть также выбран для облегчения гидрофобного взаимодействия и ассоциации с полинуклеотид-связывающей молекулой.

Природные липопротеиды могут быть выделены из сыворотки, например, ультрацентрифугированием. Такие способы описаны в Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Липопротеиды могут быть также получены in vitro или рекомбинантными способами экспрессией генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине. См, например, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 и Radding (1958) Biochim. Biophys. Acta 30:443. Липопротеиды могут быть также приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Дополнительное описание липопротеидов можно найти у Zuckermann et al. WO98/06437.

F. Подикатионные агенты

Поликатионные агенты могут включаться с или без липопротеида в композицию с доставляемым полинуклеотидом/ полипептидом.

Поликатионные агенты обычно проявляют положительный заряд при физиологическом рН и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот для облегчения доставки в желаемое местоположение. Эти агенты находят применение как in vitro, ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в живой субъект внутримышечно, подкожно и т.д.

Далее приводятся примеры применимых в качестве поликатионных агентов полипептидов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другие примеры включают гистоны, протамины, человеческий сывороточный альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые белки хромосом, белки оболочки из ДНК-вирусов, таких как Х174, факторы транскрипции также содержат домены, которые связывают ДНК и, следовательно, могут быть использованы в качестве конденсирующих нуклеиновые кислоты агентов. Кратко, факторы транскрипции, такие как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-i, Sp-i, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID, содержат основные домены, которые связывают ДНК-последовательности.

Органические поликатионные агенты включают: спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы из перечисленного выше для конструирования других полипептидных поликатионных агентов для получения синтетических поликатионных агентов.

Синтетические поликатионные агенты, которые являются применимыми, например, DEAE-декстран, полибрен, Липофектин™ и липофектАМИН™, являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы при объединении с полинуклеотидами/полипептидами.

Иммунодиагностические анализы

Менингококковые антигены данного изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для обнаружения уровней антител (или, наооборот, анти-менингококковые антитела могут быть использованы для обнаружения уровней антигена). Иммуноанализы на основе хорошо определенных рекомбинантных антигенов могут быть разработаны для замены инвазивных диагностических способов. Антитела к менингококковым белкам могут быть обнаружены в биологических образцах, в том числе, например, образцах крови или сыворотки. Построение иммуноанализов является предметом огромного числа вариаций, и многие из них известны в данной области. Протоколы для иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкуренции или на прямой реакции или на анализах типа сэндвич-анализов. Протоколы могут также использовать, например, твердые носители или могут выполняться с использованием иммунопреципитации. Большинство анализов включают применение меченого антитела или полипептида; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами-красителя. Известны также анализы, которые усиливают сигналы из образца; примерами являются анализы, которые используют биотин и авидин, и меченые и опосредованные ферментами иммуноанализы, такие как анализы ELISA.

Наборы, пригодные для иммунодиагностики и содержащие подходящие меченые реагенты, созданы упаковкой подходящих материалов, в том числе композиций данного изобретения, в подходящие контейнеры вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.д.), необходимыми для проведения анализа, а также с соответствующим набором инструкцией по проведению анализа.

Гибридизация нуклеиновых кислот

"Гибридизация" обозначает ассоциацию двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством образования водородных связей. Обычно, одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая находится в свободном виде в растворе. Затем две данные последовательности помещают для связывания друг с другом в условия, благоприятствующие образованию водородной связи. Факторы, которые влияют на образование водородных связей, включают: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание; агенты для блокирования неспецифического присоединения последовательности жидкой фазы к твердому носителю (реагент Denhardt или BLOTTO); концентрацию последовательностей; применение соединений для увеличения скорости ассоциации последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывок после гибридизации. См. Sambrook et al. [supra] Volume 2, chapter 9, pages 9.47-9.57.

“Жесткость” обозначает условия в реакции гибридизаци, которые будут способствовать связи очень сходных последовательностей в сравнении с последовательностями, которые отличаются. Например, должна быть выбрана комбинация температуры и концентрации солей, которая является на приблизительно 120-200°С ниже рассчитанной Тm исследуемого гибрида. Температура и солевые условия часто могут быть определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованные на фильтрах, гибридизуют с представляющей интерес последовательностью и затем промывают в условиях различной жесткости. См. Sambrook et al. на странице 9.50.

Переменными, которые должны учитываться при проведении, например, блоттинга по Саузерну, являются (1) сложность подвергаемой блоттингу ДНК и (2) гомология между зондом и детектируемыми последовательностями. Общее количество исследуемых фрагментов может варьироваться с размахом в 10 раз, от 0,1-1 мкг для плазмиды или продукта расщепления фага до 10^-9-10^-8 г на однокопийный ген в высокосложном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов меньшей сложности могут быть использованы существенно более короткие периоды блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшее количество исходных полинуклеотидов и меньшая удельная активность зондов. Например, однокопийный дрожжевой ген может быть детектирован со временем экспозиции всего лишь 1 час с 1 мкг дрожжевой ДНК в качестве исходного материала, блоттингом в течение 2 часов и гибридизацией в течение 4-8 часов с зондом 10⁸ имп/мин/мкг. Для однокопийного гена млекопитающего консервативный подход начинался бы с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда более 10⁸ имп/мин/мкг при времени экспозиции ~24 часа.

Несколько факторов могут влиять на температуру плавления (Тm) ДНК-ДНК-гибрида между зондом и представляющим интерес фрагментом и вследствие этого на подходящие условия для гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным фрагменту. Другие обычно встречающиеся переменные включают длину и общее содержание G+C гибридизующихся последовательностей и ионную силу и содержание формамида в буфере для гибридизации. Действия всех этих факторов могут быть тождественны одному уравнению:

Тm=81+16,6(log₁₀Сi)+0,4[%(G+С)]-0,6(%формамида)-600/n-1,5(%ошибочных спаривании),

где Ci обозначает концентрацию соли (одновалентных ионов), а п обозначает длину гибрида в п.н. (слегка модифицировано в сравнении с Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

В построении эксперимента гибридизации некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть изменены подходящим образом. Проще всего корректировать температуру гибридизации и промывок и концентрацию соли во время промывок. Когда температура гибридизации увеличивается (т.е. увеличивается жесткость), становится менее вероятной гибридизация между цепями, которые являются негомологичными, и в результате снижается фон. Если радиоактивно меченный зонд является не полностью гомологичным иммобилизованному фрагменту (как это часто имеет место в экспериментах с семейством генов и экспериментах с межвидовой гибридизацией), то температура гибридизации должна быть уменьшена, и фон будет увеличиваться. Температура промывок влияет на интенсивность полосы гибридизации и уровень фона таким же образом. Жесткость промывок также увеличивается с уменьшением концентраций соли.

Обычно подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, который на 95-100% гомологичен фрагменту-мишени, 37°С для гомологии 90-95% и 32°С для гомологии 85-90%. Для более низких гомологий содержание формамида должно быть снижено и температура должна быть скорректирована соответственно с использованием приведенного выше уравнения. Если гомология между зондом и фрагментом-мишенью является неизвестной, то самый простой подход состоит в том, чтобы начать с гибридизации и условий промывки, которые не являются жесткими. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, фильтр можно промыть при высокой жесткости и повторно экспонировать. Если время, требуемое для экспонирования, делает этот подход непрактичным, несколько жесткостей гибридизации и/или промывки должны испытываться параллельно.

Анализы с зондами нуклеиновых кислот

Способы, такие как ПЦР, анализы с разветвленным ДНК-зондом или способы блоттинга, использующие зонды нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, могут определять присутствие кДНК или мРНК. Говорят, что зонд “гибридизуется” с последовательностью данного изобретения, если он может образовать дуплекс или двухцепочечный комплекс, который является достаточно стабильным для детектирования.

Зонды нуклеиновых кислот будут гибридизоваться с менингококковыми нуклеотидными последовательностями данного изобретения (в том числе как со смысловыми, так и с антисмысловыми цепями). Хотя многие различные нуклеотидные последовательности будут кодировать конкретную аминокислотную последовательность, нативная менингококковая последовательность является предпочтительной, так как она является истинной последовательностью, присутствующей в клетках. мРНК представляет кодирующую последовательность, и таким образом, зонд должен быть комплементарным данной кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК является комплементарной мРНК, и таким образом, кДНК-зонд должен быть комплементарным данной некодирующей последовательности.

Последовательность зонда не должна быть обязательно идентичной менингококковой последовательности (или ее комплементу) - некоторая вариация в данной последовательности и длине может приводить к повышенной чувствительности анализа, если зонд нуклеиновой кислоты может образовывать дуплекс с нуклеотидами мишени, который может быть детектирован. Зонд нуклеиновой кислоты может также включать дополнительные нуклеотиды для стабилизации образовавшегося дуплекса. Дополнительная менингококковая последовательность может быть также полезной в качестве метки для детектирования образованного комплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5'-концу зонда, причем остальная последовательность данного зонда является комплементарной менингококковой последовательности. Альтернативно, в зонд могут быть вставлены в разных местах некомплементарные основания или более длинные последовательности, при условии, что последовательность зонда является достаточно комплементарной менингококковой последовательности, чтобы гибридизоваться с ней и посредством этого образовывать дуплекс, который может быть детектирован.

Точная длина и последовательность зонда будет зависеть от условий гибридизации, таких как температура, солевые условия и т.п. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности анализируемой последовательности зонд нуклеиновой кислоты обычно содержит по меньшей мере 10-20 нуклеотидов, предпочтительно 15-25 и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, хотя он может быть короче, чем здесь указано. Короткие праймеры обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.

Зонды могут быть получены синтетическими процедурами, такими как триэфирный способ Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185], или согласно Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461], или с использованием коммерчески доступных автоматических олигонуклеотидных синтезаторов.

Химическая природа зонда может быть выбрана согласно предпочтению. Для некоторых целей удобны ДНК или РНК. Для других целей могут быть включены модификации, например, модификации скелета, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения периода полужизни in vivo, изменения РНК-аффинности, увеличения устойчивости к нуклеазам и т.д. [например, см. Agrawal and lyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]; аналоги, такие как пептиднуклеиновые кислоты, также могут быть использованы [например, см. Соrеу (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt et ai. (1993) TIBTECH 11:384-386].

Альтернативно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом для обнаружения небольших количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Этот анализ описан у Mullis et al. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350]; в патентах США 4683195 и 4683202. Два “праймерных” нуклеотида гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для праймирования реакции. Праймеры могут содержать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью амплифицируемой мишени (или не является ее комплементом) для увеличения стабильности дуплекса или, например, для включения удобного сайта рестрикции. Обычно такая последовательность будет фланкировать желаемую менингококковую последовательность.

Термостабильная полимераза создает копии нуклеиновых кислот-мишеней из данных праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матрицы. После того как пороговое количество нуклеиновых кислот-мишеней генерируется полимеразой, они могут быть детектированы более традиционными способами, такими как Саузерн-блоты. При использовании способа блоттинга по Саузерну меченый зонд будет гибридизоваться с менингококковой последовательностью (или ее комплементом).

мРНК или кДНК могут быть также детектированы традиционными способами блоттинга, описанными у Sambrook et al. [supra]. мРНК или кДНК, генерируемая из мРНК с использованием полимеразного фермента, могут быть очищены и разделены с использованием гель-электрофореза. Затем нуклеиновые кислоты на геле подвергают блоттингу на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза. Твердую подложку подвергают действию меченого зонда и затем промывают для удаления негибридизованного зонда. Затем детектируют дуплексы, содержащие меченый зонд. Обычно зонд метят радиоактивной частью молекулы.

ПРИМЕРЫ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ФРАГМЕНТОВ

Белковые последовательности, описанные в WO99/36544, подвергали компьютерному анализу для прогнозирования антигенных пептидных фрагментов в полноразмерных белках. В этом анализе использовали три алгоритма:

- AMPHI (АМФИ) Эту программу использовали для предсказания Т-клеточных эпитопов [Gao et al. (1989) J. Immunol. 143:3007; Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retrovir 12:593; Quakyi et al. (1992) Scand J Immunol suppl. 11:9], и она доступна в Protean package of DNASTAR, Inc. (1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715 USA).

- антигенный ИНДЕКС, как описано Jameson and Wolf (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. CABIOS 4:181-186.

- ГИДРОФИЛЬНОСТЬ, как описано Норр and Woods (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. PNAS USA 78:3824-3828.

Таблица I показывает предпочтительные фрагменты белков, описанных в WO99/36544. Три алгоритма часто идентифицируют одни и те же фрагменты (например, ORF38-1 - фрагменты из остатков 37-42 и 143-146 оба идентифицированы дважды). Такие множественно-идентифицированные фрагменты являются особенно предпочтительными. Данные алгоритмы часто идентифицируют перекрывающиеся фрагменты (например, ORF40-1 - АМФИ идентифицирует остатки 161-165, а Гидрофильность идентифицировала остатки 163-175). Данное изобретение специально включает фрагменты, происходящие из комбинации этих перекрывающихся фрагментов (например, фрагмент от остатка 161 до остатка 175 в случае ORF40-1). Фрагменты, разделенные единственной аминокислотой, также часто идентифицируются (например, ORF40-1 Антигенный Индекс 423-426 и 428-438). Данное изобретение также включает в себя фрагменты, соединяющие два края таких “смежных” фрагментов (например, 423-438 для ORF40-1).

ТАБЛИЦА I - 1769 фрагментов белков, описанных в WO99/36544

Код: фрагмент #1 данной заявки является аминокислотами 6-14 ORF38-1, описанного в WO99/36544, фрагмент #2 данной заявки является аминокислотами 57-59 ORF38-1, описанного в WO99/36544, и т.д.

Фрагмент #	ORF W099/36544	Алгоритм	Аминокислоты
1.	38-1	АМФИ	6-14
2.	38-1	АМФИ	57-59
3.	38-1	АМФИ	67-76
4.	38-1	АМФИ	92-100
5.	38-1	АМФИ	127-137
6.	38-1	АМФИ	149-166
7.	38-1	АМФИ	210-215
8.	38-1	АМФИ	231-236
9.	38-1	АМФИ	270-272
10.	38-1	АМФИ	303-320

11.	38-1	Антигенный индекс	16-34
12.	38-1	Антигенный индекс	37-42
13.	38-1	Антигенный индекс	46-64
14.	38-1	Антигенный индекс	72-91
15.	38-1	Антигенный индекс	94-112
16.	38-1	Антигенный индекс	114-117
17.	38-1	Антигенный индекс	124-136
18.	38-1	Антигенный индекс	143-146
19.	38-1	Антигенный индекс	148-160
20.	38-1	Антигенный индекс	167-195
21.	38-1	Антигенный индекс	201-216
22.	38-1	Антигенный индекс	218-240
23.	38-1	Антигенный индекс	244-252
24.	38-1	Антигенный индекс	257-278
25.	38-1	Антигенный индекс	282-290
26.	38-1	Антигенный индекс	308-314
27.	38-1	Гидрофильность	21-34
28.	38-1	Гидрофильность	37-42
29.	38-1	Гидрофильность	47-55
30.	38-1	Гидрофильность	57-61
31.	38-1	Гидрофильность	72-74
32.	38-1	Гидрофильность	76-78
33.	38-1	Гидрофильность	82-91
34.	38-1	Гидрофильность	94-101
35.	38-1	Гидрофильность	108-112
36.	38-1	Гидрофильность	126-136
37.	38-1	Гидрофильность	143-146
38.	38-1	Гидрофильность	148-160
39.	38-1	Гидрофильность	167-195
40.	38-1	Гидрофильность	221-223
41.	38-1	Гидрофильность	226-236
42.	38-1	Гидрофильность	244-250
43.	38-1	Гидрофильность	257-274

44.	38-1	Гидрофильность	282-286
45.	38-1	Гидрофильность	311-314
46.	38а	АМФИ	6-14
47.	38а	АМФИ	57-59
48.	38а	АМФИ	67-76
49.	38а	АМФИ	92-100
50.	38а	АМФИ	127-137
51.	38а	АМФИ	149-166
52.	38а	АМФИ	210-215
53.	38а	АМФИ	223-225
54.	38а	АМФИ	231-236
55.	38а	АМФИ	270-272
56.	38а	АМФИ	303-320
57.	38а	Антигенный индекс	16-34
58.	38а	Антигенный индекс	37-42
59.	38а	Антигенный индекс	46-64
60.	38а	Антигенный индекс	72-91
61.	38а	Антигенный индекс	94-112
62.	38а	Антигенный индекс	114-117
63.	38а	Антигенный индекс	124-136
64.	38а	Антигенный индекс	143-146
65.	38а	Антигенный индекс	148-160
66.	38а	Антигенный индекс	165-195
67.	38а	Антигенный индекс	201-216
68.	38а	Антигенный индекс	218-240
69.	38а	Антигенный индекс	244-252
70.	38а	Антигенный индекс	257-278
71.	38а	Антигенный индекс	282-290
72.	38а	Антигенный индекс	308-314
73.	38а	Гидрофильность	21-34
74.	38а	Гидрофильность	37-42
75.	38а	Гидрофильность	47-55
76.	38а	Гидрофильность	57-61

77.	38а	Гидрофильность	72-74
78.	38а	Гидрофильность	76-78
79.	38а	Гидрофильность	82-91
80.	38а	Гидрофильность	94-101
81.	38а	Гидрофильность	108-112
82.	38а	Гидрофильность	126-136
83.	38а	Гидрофильность	143-146
84.	38а	Гидрофильность	148-160
85.	38а	Гидрофильность	165-195
86.	38а	Гидрофильность	221-223
87.	38а	Гидрофильность	226-236
88.	38а	Гидрофильность	244-250
89.	38а	Гидрофильность	257-273
90.	38а	Гидрофильность	282-286
91.	38а	Гидрофильность	311-314
92.	39-1	АМФИ	6-13
93.	39-1	АМФИ	21-24
94.	39-1	АМФИ	37-40
95.	39-1	АМФИ	60-75
96.	39-1	АМФИ	118-122
97.	39-1	АМФИ	134-139
98.	39-1	АМФИ	165-183
99.	39-1	АМФИ	192-195
100.	39-1	АМФИ	233-241
101.	39-1	АМФИ	247-267
102.	39-1	АМФИ	273-275
103.	39-1	АМФИ	299-308
104.	39-1	АМФИ	310-319
105.	39-1	АМФИ	322-330
106.	39-1	АМФИ	338-347
107.	39-1	АМФИ	358-364
108.	39-1	АМФИ	366-368
109.	39-1	АМФИ	376-378

110.	39-1	АМФИ	385-392
111.	39-1	АМФИ	413-416
112.	39-1	АМФИ	421-424
113.	39-1	АМФИ	429-438
114.	39-1	АМФИ	445-454
115.	39-1	АМФИ	456-458
116.	39-1	АМФИ	498-500
117.	39-1	АМФИ	512-519
118.	39-1	АМФИ	576-587
119.	39-1	АМФИ	589-600
120.	39-1	АМФИ	650-652
121.	39-1	АМФИ	670-674
122.	39-1	Антигенный индекс	26-32
123.	39-1	Антигенный индекс	35-45
124.	39-1	Антигенный индекс	54-69
125.	39-1	Антигенный индекс	79-84
126.	39-1	Антигенный индекс	88-96
127.	39-1	Антигенный индекс	105-110
128.	39-1	Антигенный индекс	117-124
129.	39-1	Антигенный индекс	152-154
130.	39-1	Антигенный индекс	190-192
131.	39-1	Антигенный индекс	222-231
132.	39-1	Антигенный индекс	246-265
133.	39-1	Антигенный индекс	292-295
134.	39-1	Антигенный индекс	318-335
135.	39-1	Антигенный индекс	353-362
136.	39-1	Антигенный индекс	370-372
137.	39-1	Антигенный индекс	402-404
138.	39-1	Антигенный индекс	406-408
139.	39-1	Антигенный индекс	419-421
140.	39-1	Антигенный индекс	446-449
141.	39-1	Антигенный индекс	453-460
142.	39-1	Антигенный индекс	465-469

143.	39-1	Антигенный индекс	476-487
144.	39-1	Антигенный индекс	491-499
145.	39-1	Антигенный индекс	505-514
146.	39-1	Антигенный индекс	522-536
147.	39-1	Антигенный индекс	557-567
148.	39-1	Антигенный индекс	569-575
149.	39-1	Антигенный индекс	577-580
150.	39-1	Антигенный индекс	593-599
151.	39-1	Антигенный индекс	603-619
152.	39-1	Антигенный индекс	626-628
153.	39-1	Антигенный индекс	634-637
154.	39-1	Антигенный индекс	639-647
155.	39-1	Антигенный индекс	655-658
156.	39-1	Антигенный индекс	672-674
157.	39-1	Антигенный индекс	677-686
158.	39-1	Антигенный индекс	688-691
159.	39-1	Антигенный индекс	693-699
160.	39-1	Антигенный индекс	707-710
161.	39-1	Гидрофильность	28-32
162.	39-1	Гидрофильность	38-44
163.	39-1	Гидрофильность	54-69
164.	39-1	Гидрофильность	80-83
165.	39-1	Гидрофильность	89-96
166.	39-1	Гидрофильность	117-119
167.	39-1	Гидрофильность	121-123
168.	39-1	Гидрофильность	152-154
169.	39-1	Гидрофильность	224-231
170.	39-1	Гидрофильность	247-265
171.	39-1	Гидрофильность	318-332
172.	39-1	Гидрофильность	357-361
173.	39-1	Гидрофильность	402-404
174.	39-1	Гидрофильность	406-408
175.	39-1	Гидрофильность	446-449

176.	39-1	Гидрофильность	454-459
177.	39-1	Гидрофильность	465-469
178.	39-1	Гидрофильность	476-487
179.	39-1	Гидрофильность	491-499
180.	39-1	Гидрофильность	506-514
181.	39-1	Гидрофильность	525-535
182.	39-1	Гидрофильность	560-567
183.	39-1	Гидрофильность	573-575
184.	39-1	Гидрофильность	577-580
185.	39-1	Гидрофильность	594-596
186.	39-1	Гидрофильность	605-607
187.	39-1	Гидрофильность	611-619
188.	39-1	Гидрофильность	634-637
189.	39-1	Гидрофильность	639-647
190.	39-1	Гидрофильность	672-674
191.	39-1	Гидрофильность	677-686
192.	39-1	Гидрофильность	688-690
193.	39-1	Гидрофильность	693-695
194.	39а	АМФИ	6-13
195.	39а	АМФИ	21-24
196.	39а	АМФИ	37-40
197.	39а	АМФИ	60-75
198.	39а	АМФИ	118-122
199.	39а	АМФИ	134-139
200.	39а	АМФИ	165-183
201.	39а	АМФИ	192-195
202.	39а	АМФИ	233-241
203.	39а	АМФИ	247-267
204.	39а	АМФИ	273-275
205.	39а	АМФИ	299-308
206.	39а	АМФИ	310-319
207.	39а	АМФИ	322-330
208.	39а	АМФИ	338-347

209.	39а	АМФИ	358-364
210.	39а	АМФИ	366-368
211.	39а	АМФИ	376-378
212.	39а	АМФИ	385-392
213.	39а	АМФИ	413-416
214.	39а	АМФИ	421-424
215.	39а	АМФИ	429-438
216.	39а	АМФИ	445-454
217.	39а	АМФИ	456-458
218.	39а	АМФИ	498-500
219.	39а	АМФИ	512-520
220.	39а	АМФИ	576-587
221.	39а	АМФИ	589-600
222.	39а	АМФИ	650-652
223.	39а	АМФИ	670-674
224.	39а	Антигенный индекс	26-32
225.	39а	Антигенный индекс	35-45
226.	39а	Антигенный индекс	54-69
227.	39а	Антигенный индекс	79-84
228.	39а	Антигенный индекс	89-96
229.	39а	Антигенный индекс	103-110
230.	39а	Антигенный индекс	117-124
231.	39а	Антигенный индекс	152-154
232.	39а	Антигенный индекс	190-192
233.	39а	Антигенный индекс	222-231
234.	39а	Антигенный индекс	246-265
235.	39а	Антигенный индекс	292-295
236.	39а	Антигенный индекс	318-335
237.	39а	Антигенный индекс	353-362
238.	39а	Антигенный индекс	370-372
239.	39а	Антигенный индекс	402-404
240.	39а	Антигенный индекс	406-408
241.	39а	Антигенный индекс	419-421

242.	39а	Антигенный индекс	446-449
243.	39а	Антигенный индекс	453-460
244.	39а	Антигенный индекс	465-469
245.	39а	Антигенный индекс	476-487
246.	39а	Антигенный индекс	491-499
247.	39а	Антигенный индекс	505-514
248.	39а	Антигенный индекс	529-535
249.	39а	Антигенный индекс	557-567
250.	39а	Антигенный индекс	569-575
251.	39а	Антигенный индекс	577-580
252.	39а	Антигенный индекс	593-599
253.	39а	Антигенный индекс	603-619
254.	39а	Антигенный индекс	626-628
255.	39а	Антигенный индекс	634-637
256.	39а	Антигенный индекс	639-647
257.	39а	Антигенный индекс	655-658
258.	39а	Антигенный индекс	672-674
259.	39а	Антигенный индекс	677-686
260.	39а	Антигенный индекс	688-691
261.	39а	Антигенный индекс	693-699
262.	39а	Антигенный индекс	707-710
263.	39а	Гидрофильность	28-32
264.	39а	Гидрофильность	38-44
265.	39а	Гидрофильность	54-69
266.	39а	Гидрофильность	80-83
267.	39а	Гидрофильность	89-95
268.	39а	Гидрофильность	105-108
269.	39а	Гидрофильность	117-119
270.	39а	Гидрофильность	121-123
271.	39а	Гидрофильность	152-154
272.	39а	Гидрофильность	224-231
273.	39а	Гидрофильность	247-265
274.	39а	Гидрофильность	318-332

275.	39а	Гидрофилы-юсть	357-361
276.	39а	Гидрофильность	402-404
277.	39а	Гидрофильность	406-408
278.	39а	Гидрофильность	446-449
279.	39а	Гидрофильность	454-459
280.	39а	Гидрофильность	465-469
281.	39а	Гидрофильность	476-487
282.	39а	Гидрофильность	491-499
283.	39а	Гидрофильность	506-514
284.	39а	Гидрофильность	525-535
285.	39а	Гидрофильность	560-567
286.	39а	Гидрофильность	573-575
287.	39а	Гидрофильность	577-580
288.	39а	Гидрофильность	594-596
289.	39а	Гидрофильность	605-607
290.	39а	Гидрофильность	611-619
291.	39а	Гидрофильность	634-637
292.	39а	Гид рофил ьность	639-647
293.	39а	Гидрофильность	672-674
294.	39а	Гид рофил ьность	677-686
295.	39а	Гидрофильность	688-690
296.	39а	Гидрофильность	693-695
297.	40-1	АМФИ	6-14
298.	40-1	АМФИ	16-19
299.	40-1	АМФИ	22-27
300.	40-1	АМФИ	30-33
301.	40-1	АМФИ	41-44
302.	40-1	АМФИ	62-68
303.	40-1	АМФИ	129-139
304.	40-1	АМФИ	161-165
305.	40-1	АМФИ	181-191
306.	40-1	АМФИ	199-202
307.	40-1	АМФИ	215-220

308.	40-1	АМФИ	237-249
309.	40-1	АМФИ	298-302
310.	40-1	АМФИ	313-318
311.	40-1	АМФИ	335-342
312.	40-1	АМФИ	376-383
313.	40-1	АМФИ	399-402
314.	40-1	АМФИ	426-428
315.	40-1	АМФИ	430-433
316.	40-1	АМФИ	435-437
317.	40-1	АМФИ	479-482
318.	40-1	АМФИ	491-511
319.	40-1	АМФИ	523-525
320.	40-1	АМФИ	560-563
321.	40-1	Антигенный индекс	21-32
322.	40-1	Антигенный индекс	49-61
323.	40-1	Антигенный индекс	64-66
324.	40-1	Антигенный индекс	74-92
325.	40-1	Антигенный индекс	98-123
326.	40-1	Антигенный индекс	129-135
327.	40-1	Антигенный индекс	138-176
328.	40-1	Антигенный индекс	193-195
329.	40-1	Антигенный индекс	199-219
330.	40-1	Антигенный индекс	226-240
331.	40-1	Антигенный индекс	242-245
332.	40-1	Антигенный индекс	251-257
333.	40-1	Антигенный индекс	261-276
334.	40-1	Антигенный индекс	279-306
335.	40-1	Антигенный индекс	308-346
336.	40-1	Антигенный индекс	352-367
337.	40-1	Антигенный индекс	375-378
338.	40-1	Антигенный индекс	384-406
339.	40-1	Антигенный индекс	408-420
340.	40-1	Антигенный индекс	423-426

341.	40-1	Антигенный индекс	428-438
342.	40-1	Антигенный индекс	553-459
343.	40-1	Антигенный индекс	462-481
344.	40-1	Антигенный индекс	485-494
345.	40-1	Антигенный индекс	506-518
346.	40-1	Антигенный индекс	535-539
347.	40-1	Антигенный индекс	544-552
348.	40-1	Антигенный индекс	559-566
349.	40-1	Антигенный индекс	571-582
350.	40-1	Гидрофильность	21-32
351.	40-1	Гидрофильность	51-61
352.	40-1	Гидрофильность	64-66
353.	40-1	Гидрофильность	75-92
354.	40-1	Гидрофильность	100-122
355.	40-1	Гидрофильность	129-135
356.	40-1	Гидрофильность	140-145
357.	40-1	Гидрофильность	149-152
358.	40-1	Гидрофильность	157-161
359.	40-1	Гидрофильность	163-175
360.	40-1	Гидрофильность	199-201
361.	40-1	Гидрофильность	203-219
362.	40-1	Гидрофильность	227-240
363.	40-1	Гидрофильность	251-257
364.	40-1	Гидрофильность	261-276
365.	40-1	Гидрофильность	279-306
366.	40-1	Гидрофильность	308-318
367.	40-1	Гидрофильность	320-328
368.	40-1	Гидрофильность	334-341
369.	40-1	Гидрофильность	354-356
370.	40-1	Гидрофильность	359-366
371.	40-1	Гидрофильность	392-398
372.	40-1	Гидрофильность	400-405
373.	40-1	Гидрофильность	410-420

374.	40-1	Гидрофильность	429-438
375.	40-1	Гидрофильность	463-467
376.	40-1	Гидрофильность	471-480
377.	40-1	Гидрофильность	487-493
378.	40-1	Гидрофильность	506-518
379.	40-1	Гидрофильность	547-552
380.	40-1	Гидрофильность	575-579
381.	40а	АМФИ	6-10
382.	40а	АМФИ	19-27
383.	40а	АМФИ	30-33
384.	40а	АМФИ	41-44
385.	40а	АМФИ	61-72
386.	40а	АМФИ	78-81
387.	40а	АМФИ	92-94
388.	40а	АМФИ	128-130
389.	40а	АМФИ	132-134
390.	40а	АМФИ	161-165
391.	40а	АМФИ	181-193
392.	40а	АМФИ	197-199
393.	40а	АМФИ	204-211
394.	40а	АМФИ	213-218
395.	40а	АМФИ	227-229
396.	40а	АМФИ	237-249
397.	40а	АМФИ	298-302
398.	40а	АМФИ	313-318
399.	40а	АМФИ	335-342
400.	40а	АМФИ	376-383
401.	40а	АМФИ	399-402
402.	40а	АМФИ	426-428
403.	40а	АМФИ	435-437
404.	40а	АМФИ	475-483
405.	40а	АМФИ	492-512
406.	40а	АМФИ	524-526

407.	40а	АМФИ	561-564
408.	40а	Антигенный индекс	21-34
409.	40а	Антигенный индекс	50-64
410.	40а	Антигенный индекс	75-83
411.	40а	Антигенный индекс	88-97
412.	40а	Антигенный индекс	105-122
413.	40а	Антигенный индекс	129-134
414.	40а	Антигенный индекс	140-176
415.	40а	Антигенный индекс	190-207
416.	40а	Антигенный индекс	211-217
417.	40а	Антигенный индекс	224-240
418.	40а	Антигенный индекс	242-245
419.	40а	Антигенный индекс	250-255
420.	40а	Антигенный индекс	260-276
421.	40а	Антигенный индекс	279-306
422.	40а	Антигенный индекс	308-346
423.	40а	Антигенный индекс	352-367
424.	40а	Антигенный индекс	375-378
425.	40а	Антигенный индекс	384-406
426.	40а	Антигенный индекс	408-420
427.	40а	Антигенный индекс	423-438
428.	40а	Антигенный индекс	453-468
429.	40а	Антигенный индекс	471-481
430.	40а	Антигенный индекс	487-493
431.	40а	Антигенный индекс	507-519
432.	40а	Антигенный индекс	536-540
433.	40а	Антигенный индекс	545-553
434.	40а	Антигенный индекс	560-567
435.	40а	Антигенный индекс	572-583
436.	40а	Гидрофильность	21-34
437.	40а	Гидрофильность	50-64
438.	40а	Гидрофильность	75-83
439.	40а	Гидрофильность	88-96

440.	40а	Гидрофильность	105-121
441.	40а	Гидрофильность	129-134
442.	40а	Гидрофильность	140-145
443.	40а	Гидрофильность	148-155
444.	40а	Гидрофильность	157-161
445.	40а	Гидрофильность	163-175
446.	40а	Гидрофильность	196-202
447.	40а	Гидрофильность	211-217
448.	40а	Гидрофильность	225-230
449.	40а	Гидрофильность	232-240
450.	40а	Гидрофильность	253-255
451.	40а	Гидрофильность	261-276
452.	40а	Гидрофильность	279-306
453.	40а	Гидрофильность	308-318
454.	40а	Гидрофильность	320-328
455.	40а	Гидрофильность	334-341
456.	40а	Гидрофильность	354-356
457.	40а	Гидрофильность	359-366
458.	40а	Гидрофильность	392-398
459.	40а	Гидрофильность	400-405
460.	40а	Гидрофильность	410-420
461.	40а	Гидрофильность	428-438
462.	40а	Гидрофильность	462-468
463.	40а	Гидрофильность	472-481
464.	40а	Гидрофильность	489-493
465.	40а	Гидрофильность	507-519
466.	40а	Гидрофильность	548-553
467.	40а	Гидрофильность	576-580
468.	41-1	АМФИ	30-36
469.	41-1	АМФИ	93-98
470.	41-1	АМФИ	111-122
471.	41-1	АМФИ	126-129
472.	41-1	АМФИ	136-143

473.	41-1	АМФИ	145-150
474.	41-1	АМФИ	156-158
475.	41-1	АМФИ	186-195
476.	41-1	АМФИ	201-208
477.	41-1	АМФИ	213-223
478.	41-1	АМФИ	236-247
479.	41-1	АМФИ	250-255
480.	41-1	АМФИ	273-282
481.	41-1	АМФИ	303-309
482.	41-1	АМФИ	311-314
483.	41-1	АМФИ	329-338
484.	41-1	АМФИ	344-362-
485.	41-1	АМФИ	372-377
486.	41-1	АМФИ	385-392
487	41-1	АМФИ	409-412
488.	41-1	АМФИ	419-426
489.	41-1	АМФИ	458-463
490.	41-1	АМФИ	470-474
491.	41-1	АМФИ	486-489
492.	41-1	АМФИ	512-518
493.	41-1	АМФИ	527-551
494.	41-1	АМФИ	564-579
495.	41-1	АМФИ	593-597
496.	41-1	Антигенный индекс	13-22
497.	41-1	Антигенный индекс	30-38
498.	41-1	Антигенный индекс	43-55
499.	41-1	Антигенный индекс	73-75
500.	41-1	Антигенный индекс	87-89
501.	41-1	Антигенный индекс	105-112
502.	41-1	Антигенный индекс	114-124
503.	41-1	Антигенный индекс	136-141
504.	41-1	Антигенный индекс	147-153
505.	41-1	Антигенный индекс	163-166

506.	41-1	Антигенный индекс	174-184
507.	41-1	Антигенный индекс	195-207
508.	41-1	Антигенный индекс	226-236
509.	41-1	Антигенный индекс	244-246
510.	41-1	Антигенный индекс	249-265
511.	41-1	Антигенный индекс	281-287
512.	41-1	Антигенный индекс	294-313
513.	41-1	Антигенный индекс	317-342
514.	41-1	Антигенный индекс	350-375
515.	41-1	Антигенный индекс	379-386
516.	41-1	Антигенный индекс	390-396
517.	41-1	Антигенный индекс	413-422
518.	41-1	Антигенный индекс	425-430
519.	41-1	Антигенный индекс	436-440
520.	41-1	Антигенный индекс	446-465
521.	41-1	Антигенный индекс	468-495
522.	41-1	Антигенный индекс	498-518
523.	41-1	Антигенный индекс	520-522
524.	41-1	Антигенный индекс	525-542
525.	41-1	Антигенный индекс	547-558
526.	41-1	Антигенный индекс	565-590
527.	41-1	Антигенный индекс	595-602
528.	41-1	Антигенный индекс	608-619
529.	41-1	Гидрофильность	14-21
530.	41-1	Гидрофильность	30-33
531.	41-1	Гидрофильность	45-55
532.	41-1	Гидрофильность	87-89
533.	41-1	Гидрофильность	106-111
534.	41-1	Гидрофильность	114-120
535.	41-1	Гидрофильность	122-124
536.	41-1	Гидрофильность	136-141
537.	41-1	Гидрофильность	148-150
538.	41-1	Гидрофильность	177-184

539.	41-1	Гидрофильность	195-207
540.	41-1	Гидрофильность	226-234
541.	41-1	Гидрофильность	249-265
542.	41-1	Гидрофильность	285-287
543.	41-1	Гидрофильность	294-297
544.	41-1	Гидрофильность	299-313
545.	41-1	Гидрофильность	317-321
546.	41-1	Гидрофильность	323-342
547.	41-1	Гидрофильность	350-371
548.	41-1	Гидрофильность	379-386
549.	41-1	Гидрофильность	417-422
550.	41-1	Гидрофильность	425-427
551.	41-1	Гидрофильность	447-449
552.	41-1	Гидрофильность	459-462
553.	41-1	Гидрофильность	468-475
554.	41-1	Гидрофильность	479-482
555.	41-1	Гидрофильность	484-491
556.	41-1	Гидрофильность	499-518
557.	41-1	Гидрофильность	520-522
558.	41-1	Гидрофильность	526-542
559.	41-1	Гидрофильность	550-558
560.	41-1	Гидрофильность	568-590
561.	41-1	Гидрофильность	595-598
562.	41-1	Гидрофильность	617-619
563.	41а	АМФИ	6-12
564.	41а	АМФИ	32-34
565.	41а	АМФИ	69-74
566.	41а	АМФИ	86-98
567.	41а	АМФИ	111-119
568.	41а	АМФИ	121-126
569.	41а	АМФИ	132-134
570.	41а	АМФИ	155-160
571.	41а	АМФИ	162-171

572.	41а	АМФИ	177-184
573.	41а	АМФИ	189-199
574.	41а	АМФИ	212-223
575.	41а	АМФИ	226-231
576.	41а	АМФИ	249-258
577.	41а	АМФИ	287-290
578.	41а	АМФИ	305-314
579.	41а	АМФИ	320-338
580.	41а	АМФИ	348-353
581.	41а	АМФИ	361-368
582.	41а	АМФИ	385-388
583.	41а	АМФИ	395-402
584.	41а	АМФИ	434-439
585.	41а	АМФИ	446-450
586.	41а	АМФИ	462-467
587.	41а	АМФИ	470-475
588.	41а	АМФИ	488-494
589.	41а	АМФИ	503-525
590.	41а	АМФИ	540-555
591.	41а	АМФИ	569-573
592.	41а	АМФИ	578-594
593.	41а	Антигенный индекс	10-13
594.	41а	Антигенный индекс	19-31
595.	41а	Антигенный индекс	48-50
596.	41а	Антигенный индекс	63-65
597.	41а	Антигенный индекс	82-101
598.	41а	Антигенный индекс	112-117
599.	41а	Антигенный индекс	123-129
600.	41а	Антигенный индекс	139-142
601.	41а	Антигенный индекс	150-160
602.	41а	Антигенный индекс	171-183
603.	41а	Антигенный индекс	202-212
604.	41а	Антигенный индекс	220-222

605.	41а	Антигенный индекс	225-241
606.	41а	Антигенный индекс	257-263
607.	41а	Антигенный индекс	270-289
608.	41а	Антигенный индекс	293-318
609.	41а	Антигенный индекс	326-351
610.	41а	Антигенный индекс	355-362
611.	41а	Антигенный индекс	366-372
612.	41а	Антигенный индекс	389-398
613.	41а	Антигенный индекс	401-406
614.	41а	Антигенный индекс	412-416
615.	41а	Антигенный индекс	422-441
616.	41а	Антигенный индекс	444-446
617.	41а	Антигенный индекс	451-471
618.	41а	Антигенный индекс	475-494
619.	41а	Антигенный индекс	496-498
620.	41а	Антигенный индекс	501-518
621.	41а	Антигенный индекс	523-534
622.	41а	Антигенный индекс	540-566
623.	41а	Антигенный индекс	571-578
624.	41а	Антигенный индекс	582-595
625.	41а	Гидрофильность	21-31
626.	41а	Гидрофильность	63-65
627.	41а	Гидрофильность	83-96
628.	41а	Гидрофильность	98-100
629.	41а	Гидрофильность	112-117
630.	41а	Гидрофильность	124-126
631.	41а	Гидрофильность	153-160
632.	41а	Гидрофильность	171-183
633.	41а	Гидрофильность	202-210
634.	41а	Гидрофильность	220-222
635.	41а	Гидрофильность	225-241
636.	41а	Гидрофильность	261-263
637.	41а	Гидрофильность	270-273

638.	41а	Гидрофильность	275-289
639.	41а	Гидрофильность	293-297
640.	41а	Гидрофильность	299-318
641.	41а	Гидрофильность	326-347
642.	41а	Гидрофильность	355-362
643.	41а	Гидрофильность	393-398
644.	41а	Гидрофильность	401-403
645.	41а	Гидрофильность	423-425
646.	41а	Гидрофильность	435-438
647.	41а	Гидрофильность	454-458
648.	41а	Гидрофильность	460-471
649.	41а	Гидрофильность	475-494
650.	41а	Гидрофильность	496-498
651.	41а	Гидрофильность	502-518
652.	41а	Гидрофильность	527-534
653.	41а	Гидрофильность	544-566
654.	41а	Гидрофильность	571-574
655.	41а	Гидрофильность	593-595
656.	44-1	АМФИ	57-60
657.	44-1	АМФИ	76-79
658.	44-1	Антигенный индекс	22-34
659.	44-1	Антигенный индекс	38-46
660.	44-1	Антигенный индекс	50-55
661.	44-1	Антигенный индекс	64-70
662.	44-1	Антигенный индекс	72-80
663.	44-1	Антигенный индекс	83-89
664.	44-1	Антигенный индекс	96-106
665.	44-1	Антигенный индекс	110-124
666.	44-1	Гидрофильность	22-34
667.	44-1	Гидрофильность	40-46
668.	44-1	Гидрофильность	64-69
669.	44-1	Гидрофильность	73-80
670.	44-1	Гидрофильность	84-89

671.	44-1	Гидрофильность	97-106
672.	44-1	Гидрофильность	120-124
673.	44а	АМФИ	57-60
674.	44а	АМФИ	76-79
675.	44а	Антигенный индекс	23-34
676.	44а	Антигенный индекс	38-46
677.	44а	Антигенный индекс	50-55
678.	44а	Антигенный индекс	64-70
679.	44а	Антигенный индекс	72-80
680.	44а	Антигенный индекс	83-89
681.	44а	Антигенный индекс	96-106
682.	44а	Антигенный индекс	110-124
683.	44а	Гидрофильность	28-34
684.	44а	Гидрофильность	40-46
685.	44а	Гидрофильность	64-69
686.	44а	Гидрофильность	73-80
687.	44а	Гидрофильность	84-89
688.	44а	Гидрофильность	97-106
689.	44а	Гидрофильность	120-124
690.	49-1	АМФИ	16-21
691.	49-1	АМФИ	44-48
692.	49-1	АМФИ	56-61
693.	49-1	АМФИ	92-97
694.	49-1	АМФИ	118-127
695.	49-1	АМФИ	130-149
696.	49-1	АМФИ	156-178
697.	49-1	АМФИ	235-240
698.	49-1	АМФИ	253-264
699.	49-1	АМФИ	268-271
700.	49-1	АМФИ	278-285
701.	49-1	АМФИ	287-292
702.	49-1	АМФИ	298-300
703.	49-1	АМФИ	328-337

704.	49-1	АМФИ	343-350
705.	49-1	АМФИ	355-365
706.	49-1	АМФИ	378-389
707.	49-1	АМФИ	422-424
708.	49-1	АМФИ	442-450
709.	49-1	АМФИ	464-481
710.	49-1	АМФИ	486-496
711.	49-1	АМФИ	514-521
712.	49-1	АМФИ	548-551
713.	49-1	АМФИ	553-557
714.	49-1	АМФИ	562-568
715.	49-1	АМФИ	573-575
716.	49-1	АМФИ	588-590
717.	49-1	АМФИ	603-605
718.	49-1	АМФИ	614-618
719.	49-1	Антигенный индекс	15-21
720.	49-1	Антигенный индекс	26-43
721.	49-1	Антигенный индекс	50-59
722.	49-1	Антигенный индекс	61-75
723.	49-1	Антигенный индекс	79-87
724.	49-1	Антигенный индекс	98-108
725.	49-1	Антигенный индекс	110-120
726.	49-1	Антигенный индекс	122-139
727.	49-1	Антигенный индекс	147-164
728.	49-1	Антигенный индекс	171-179
729.	49-1	Антигенный индекс	185-197
730.	49-1	Антигенный индекс	214-216
731.	49-1	Антигенный индекс	229-231
732.	49-1	Антигенный индекс	248-266
733.	49-1	Антигенный индекс	278-283
734.	49-1	Антигенный индекс	289-295
735.	49-1	Антигенный индекс	316-326
736.	49-1	Антигенный индекс	337-349

737.	49-1	Антигенный индекс	368-378
738.	49-1	Антигенный индекс	386-388
739.	49-1	Антигенный индекс	390-410
740.	49-1	Антигенный индекс	412-414
741.	49-1	Антигенный индекс	423-429
742.	49-1	Антигенный индекс	438-454
743.	49-1	Антигенный индекс	462-475
744.	49-1	Антигенный индекс	482-500
745.	49-1	Антигенный индекс	503-509
746.	49-1	Антигенный индекс	521-528
747.	49-1	Антигенный индекс	540-562
748.	49-1	Антигенный индекс	572-579
749.	49-1	Антигенный индекс	590-606
750.	49-1	Антигенный индекс	610-612
751.	49-1	Антигенный индекс	617-619
752.	49-1	Антигенный индекс	626-634
753.	49-1	Антигенный индекс	637-640
754.	49-1	Гидрофильность	18-21
755.	49-1	Гидрофильность	26-29
756.	49-1	Гидрофильность	31-43
757.	49-1	Гидрофильность	51-57
758.	49-1	Гидрофильность	64-68
759.	49-1	Гидрофильность	79-87
760.	49-1	Гидрофильность	98-107
761.	49-1	Гидрофильность	122-125
762.	49-1	Гидрофильность	147-164
763.	49-1	Гидрофильность	172-175
764.	49-1	Гидрофильность	187-197
765.	49-1	Гидрофильность	229-231
766.	49-1	Гидрофильность	256-262
767.	49-1	Гидрофильность	264-266
768.	49-1	Гидрофильность	278-283
769.	49-1	Гидрофильность	290-292

770.	49-1	Гидрофильность	319-326
771.	49-1	Гидрофильность	337-349
772.	49-1	Гидрофильность	368-376
773.	49-1	Гидрофильность	386-388
774.	49-1	Гидрофильность	390-410
775.	49-1	Гидрофильность	412-414
776.	49-1	Гидрофильность	423-429
777.	49-1	Гидрофильность	441-451
778.	49-1	Гидрофильность	446-472
779.	49-1	Гидрофильность	484-490
780.	49-1	Гидрофильность	492-494
781.	49-1	Гидрофильность	496-498
782.	49-1	Гидрофильность	522-528
783,	49-1	Гидрофильность	543-562
784.	49-1	Гидрофильность	591-606
785.	49-1	Гидрофильность	617-619
786.	49-1	Гидрофильность	626-632
787.	49-1	Гидрофильность	637-640
788.	49а	АМФИ	55-61
789.	49а	АМФИ	92-97
790.	49а	АМФИ	118-127
791.	49а	АМФИ	129-135
792.	49а	АМФИ	137-145
793.	49а	АМФИ	156-178
794.	49а	АМФИ	198-200
795.	49а	АМФИ	235-240
796.	49а	АМФИ	252-264
797.	49а	АМФИ	277-285,
798.	49а	АМФИ	287-292
799.	49а	АМФИ	298-300
800.	49а	АМФИ	321-326
801.	49а	АМФИ	328-337
802.	49а	АМФИ	343-350

803.	49а	АМФИ	355-365
804.	49а	АМФИ	378-389
805.	49а	АМФИ	392-397
806.	49а	АМФИ	415-424
807.	49а	АМФИ	453-456
808.	49а	АМФИ	471-480
809.	49а	АМФИ	486-504
810.	49а	АМФИ	514-519
811.	49а	АМФИ	527-534
812.	49а	АМФИ	551-554
813.	49а	АМФИ	561-568
814.	49а	АМФИ	600-605
815.	49а	АМФИ	612-616
816.	49а	АМФИ	628-633
817.	49а	АМФИ	636-641
818.	49а	АМФИ	654-660
819.	49а	АМФИ	669-691
820.	49а	АМФИ	706-721
821.	49а	АМФИ	735-739
822.	49а	АМФИ	744-760
823.	49а	Антигенный индекс	4-23
824.	49а	Антигенный индекс	27-43
825.	49а	Антигенный индекс	51-62
826.	49а	Антигенный индекс	64-68
827.	49а	Антигенный индекс	72-75
828.	49а	Антигенный индекс	79-87
829.	49а	Антигенный индекс	98-108
830.	49а	Антигенный индекс	110-120
831.	49а	Антигенный индекс	124-139
832.	49а	Антигенный индекс	147-164
833.	49а	Антигенный индекс	176-179
834.	49а	Антигенный индекс	185-197
835.	49а	Антигенный индекс	214-216

836.	49а	Антигенный индекс	229-231
837.	49а	Антигенный индекс	248-267
838.	49а	Антигенный индекс	278-283
839.	49а	Антигенный индекс	289-295
840.	49а	Антигенный индекс	305-308
841.	49а	Антигенный индекс	316-326
842.	49а	Антигенный индекс	337-349
843.	49а	Антигенный индекс	368-378
844.	49а	Антигенный индекс	386-388
845.	49а	Антигенный индекс	391-407
846.	49а	Антигенный индекс	423-429
847.	49а	Антигенный индекс	436-455
848.	49а	Антигенный индекс	459-484
849.	49а	Антигенный индекс	492-517
850.	49а	Антигенный индекс	521-528
851.	49а	Антигенный индекс	532-539
852.	49а	Антигенный индекс	555-564
853.	49а	Антигенный индекс	567-572
854.	49а	Антигенный индекс	578-582
855.	49а	Антигенный индекс	588-607
856.	49а	Антигенный индекс	610-612
857.	49а	Антигенный индекс	617-637
858.	49а	Антигенный индекс	641-660
859.	49а	Антигенный индекс	662-664
860.	49а	Антигенный индекс	667-684
861.	49а	Антигенный индекс	689-700
862.	49а	Антигенный индекс	706-732
863.	49а	Антигенный индекс	737-744
864.	49а	Антигенный индекс	748-761
865.	49а	Гидрофильность	4-23
866.	49а	Гидрофильность	31-43
867.	49а	Гидрофильность	51-53
868.	49а	Гидрофильность	55-57

869.	49а	Гидрофильность	64-68
870.	49а	Гидрофильность	79-87
871.	49а	Гидрофильность	98-106
872.	49а	Гидрофильность	114-120
873.	49а	Гидрофильность	130-139
874.	49а	Гидрофильность	147-164
875.	49а	Гидрофильность	187-197
876.	49а	Гидрофильность	229-231
877.	49а	Гидрофильность	249-262
878.	49а	Гидрофильность	264-266
879.	49а	Гидрофильность	278-283
880.	49а	Гидрофильность	290-292
881.	49а	Гидрофильность	319-326
882.	49а	Гидрофильность	337-349
883.	49а	Гидрофильность	368-376
884.	49а	Гидрофильность	386-388
885.	49а	Гидрофильность	391-407
886.	49а	Гидрофильность	427-429
887.	49а	Гидрофильность	436-439
888.	49а	Гидрофильность	441-455
889.	49а	Гидрофильность	459-463
890.	49а	Гидрофильность	465-484
891.	49а	Гидрофильность	492-513
892.	49а	Гидрофильность	521-528
893.	49а	Гидрофильность	559-564
894.	49а	Гидрофильность	567-569
895.	49а	Гидрофильность	589-591
896.	49а	Гидрофильность	601-604
897.	49а	Гидрофильность	620-624
898.	49а	Гидрофильность	626-637
899.	49а	Гидрофильность	641-660
900.	49а	Гидрофильность	662-664
901.	49а	Гидрофильность	668-684

902.	49а	Гидрофильность	693-700
903.	49а	Гидрофильность	710-732
904.	49а	Гидрофильность	737-740
905.	49а	Гидрофильность	759-761
906.	51-1	АМФИ	15-21
907.	51-1	АМФИ	40-54
908.	51-1	АМФИ	75-86
909.	51-1	АМФИ	108-110
910.	51-1	АМФИ	112-124
911.	51-1	АМФИ	141-148
912.	51-1	АМФИ	184-189
913.	51-1	АМФИ	211-216
914.	51-1	Антигенный индекс	58-65
915.	51-1	Антигенный индекс	123-127
916.	51-1	Антигенный индекс	132-137
917.	51-1	Антигенный индекс	149-153
918.	51-1	Антигенный индекс	165-177
919.	51-1	Антигенный индекс	198-204
920.	51-1	Антигенный индекс	222-231
921.	51-1	Гидрофильность	60-65
922.	51-1	Гидрофильность	123-127
923.	51-1	Гидрофильность	132-135
924.	51-1	Гидрофильность	165-174
925.	51-1	Гидрофильность	200-203
926.	51-1	Гидрофильность	222-227
927.	51а	АМФИ	15-21
928.	51 а	АМФИ	40-54
929.	51а	АМФИ	75-86
930.	51а	АМФИ	108-110
931.	51 а	АМФИ	112-124
932.	51а	АМФИ	141-148
933.	51а	АМФИ	184-189
934.	51а	АМФИ	211-216

935.	51а	Гидрофильность	60-65
936.	51а	Гидрофильность	123-127
937.	51а	Гидрофильность	132-135
938.	51а	Гидрофильность	165-174
939.	51а	Гидрофильность	200-203
940.	51а	Гидрофильность	222-227
941.	52-1	АМФИ	48-50
942.	52-1	АМФИ	64-73
943.	52-1	Антигенный индекс	19-26
944.	52-1	Антигенный индекс	30-35
945.	52-1	Антигенный индекс	42-52
946.	52-1	Антигенный индекс	57-86
947.	52-1	Гидрофильность	22-26
948.	52-1	Гидрофильность	30-35
949.	52-1	Гидрофильность	42-52
950.	52-1	Гидрофильность	57-71
951.	52-1	Гидрофильность	78-86
952.	69-1	АМФИ	25-27
953.	69-1	АМФИ	46-66
954.	69-1	Антигенный индекс	32-41
955.	69-1	Антигенный индекс	43-45
956.	69-1	Антигенный индекс	71-78
957.	69-1	Гидрофильность	32-38
958.	69-1	Гидрофильность	71-78
959.	69а	АМФИ	25-27
960.	б9а	АМФИ	46-66
961.	69а	Антигенный индекс	32-41
962.	69а	Антигенный индекс	43-46
963.	69а	Антигенный индекс	71-78
964.	69а	Гидрофильность	32-38
965.	69а	Гидрофильность	71-78
966.	77-1	АМФИ	12-16
967.	77-1	АМФИ	23-33

968.	77-1	АМФИ	35-42
969.	77-1	АМФИ	51-57
970.	77-1	АМФИ	67-70
971.	77-1	АМФИ	73-79
972.	77-1	АМФИ	122-124
973.	77-1	АМФИ	130-134
974.	77-1	АМФИ	165-178
975.	77-1	АМФИ	191-211
976.	77-1	Антигенный индекс	22-31
977.	77-1	Антигенный индекс	34-44
978.	77-1	Антигенный индекс	80-94
979.	77-1	Антигенный индекс	101-104
980.	77-1	Антигенный индекс	155-158
981.	77-1	Антигенный индекс	167-181
982.	77-1	Гидрофильность	22-28
983.	77-1	Гидрофильность	38-44
984.	77-1	Гидрофильность	80-92
985.	77-1	Гидрофильность	171-178
986.	77а	АМФИ	8-15
987.	77а	АМФИ	24-30
988.	77а	АМФИ	40-43
989.	77а	АМФИ	46-52
990.	77а	АМФИ	95-97
991.	77а	АМФИ	103-107
992.	77а	АМФИ	114-125
993.	77а	АМФИ	144-151
994.	77а	АМФИ	154-156
995.	77а	АМФИ	166-184
996.	77а	Антигенный индекс	7-17
997.	77а	Антигенный индекс	53-67
998.	77а	Антигенный индекс	74-77
999.	77а	Антигенный индекс	128-131
1000.	77а	Антигенный индекс	140-154

1001.	77а	Гидрофильность	11-17
1002.	77а	Гидрофильность	53-65
1003.	77а	Гидрофильность	141-151
1004.	81-1	АМФИ	30-40
1005.	81-1	АМФИ	54-56
1006.	81-1	АМФИ	60-63
1007.	81-1	АМФИ	76-93
1008.	81-1	АМФИ	96-101
1009.	81-1	АМФИ	104-406
1010.	81-1	АМФИ	118-126
1011.	81-1	АМФИ	190-205
1012.	81-1	АМФИ	230-233
1013.	81-1	АМФИ	239-242
1014.	81-1	АМФИ	256-258
1015.	81-1	АМФИ	264-284
1016.	81-1	АМФИ	290-297
1017.	81-1	АМФИ	317-326
1018.	81-1	АМФИ	388-396
1019.	81-1	АМФИ	403-414
1020.	81-1	АМФИ	458-463
1021.	81-1	АМФИ	476-480
1022.	81-1	Антигенный индекс	1-4
1023.	81-1	Антигенный индекс	35-38
1024.	81-1	Антигенный индекс	86-89
1025.	81-1	Антигенный индекс	95-98
1026.	81-1	Антигенный индекс	100-103
1027.	81-1	Антигенный индекс	128-136
1028.	81-1	Антигенный индекс	154-174
1029.	81-1	Антигенный индекс	197-211
1030.	81-1	Антигенный индекс	220-226
1031.	81-1	Антигенный индекс	232-240
1032.	81-1	Антигенный индекс	244-249
1033.	81-1	Антигенный индекс	251-253

1034.	81-1	Антигенный индекс	255-258
1035.	81-1	Антигенный индекс	276-290
1036.	81-1	Антигенный индекс	292-301
1037.	81-1	Антигенный индекс	307-312
1038.	81-1	Антигенный индекс	318-323
1039.	81-1	Антигенный индекс	334-345
1040.	81-1	Антигенный индекс	352-358
1041.	81-1	Антигенный индекс	364-372
1042.	81-1	Антигенный индекс	376-384
1043.	81-1	Антигенный индекс	387-401
1044.	81-1	Антигенный индекс	409-417
1045.	81-1	Антигенный индекс	423-444
1046.	81-1	Антигенный индекс	452-459
1047.	81-1	Антигенный индекс	486-488
1048.	81-1	Антигенный индекс	490-499
1049.	81-1	Антигенный индекс	507-520
1050.	81-1	Гидрофильность	1-4
1051.	81-1	Гидрофильность	35-38
1052.	81-1	Гидрофильность	95-98
1053.	81-1	Гидрофильность	128-136
1054.	81-1	Гидрофильность	154-164
1055.	81-1	Гидрофильность	166-172
1056.	81-1	Гидрофильность	202-209
1057.	81-1	Гидрофильность	220-226
1058.	81-1	Гидрофильность	234-238
1059.	81-1	Гидрофильность	245-249
1060.	81-1	Гидрофильность	251-253
1061.	81-1	Гидрофильность	284-287
1062.	81-1	Гидрофильность	292-299
1063.	81-1	Гидрофильность	307-312
1064.	81-1	Гидрофильность	321-323
1065.	81-1	Гидрофильность	338-345
1066.	81-1	Гидрофильность	366-368

1067.	81-1	Гидрофильность	378-384
1068.	81-1	Гидрофильность	387-401
1069.	81-1	Гидрофильность	409-415
1070.	81-1	Гидрофильность	453-459
1071.	81-1	Гидрофильность	493-499
1072.	81-1	Гидрофильность	507-509
1073.	81-1	Гидрофильность	512-518
1074..	82а	АМФИ	36-40
1075.	82а	АМФИ	95-111
1076.	82а	АМФИ	117-132
1077.	82а	АМФИ	135-137
1078.	82а	АМФИ	160-174
1079.	82а	АМФИ	183-187
1080.	82а	Антигенный индекс	2-8
1081.	82а	Антигенный индекс	56-60
1082.	82а	Антигенный индекс	90-97
1083.	82а	Антигенный индекс	104-111
1084.	82а	Антигенный индекс	114-137
1085.	82а	Антигенный индекс	141-151
1086.	82а	Антигенный индекс	170-175
1087.	82а	Антигенный индекс	180-188
1088.	82а	Антигенный индекс	194-201
1089.	82а	Антигенный индекс	206-209
1090.	82а	Антигенный индекс	216-218
1091.	82а	Гидрофильность	2-8
1092.	82а	Гидрофильность	56-60
1093.	82а	Гидрофильность	90-97
1094.	82а	Гидрофильность	105-108
1095.	82а	Гидрофильность	120-128
1096.	82а	Гидрофильность	130-134
1097.	82а	Гидрофильность	141-151
1098.	82а	Гидрофильность	170-175
1099.	82а	Гидрофильность	186-188

1100.	82а	Гидрофильность	195-201
1101.	82а	Гидрофильность	206-209
1102.	112-1	АМФИ	6-8
1103.	112-1	АМФИ	12-34
1104.	112-1	АМФИ	45-53
1105.	112-1	АМФИ	63-65
1106.	112-1	АМФИ	70-82
1107.	112-1	АМФИ	84-86
1108.	112-1	АМФИ	107-109
1109.	112-1	АМФИ	116-123
1110.	112-1	АМФИ	183-186
1111.	112-1	АМФИ	244-246
1112.	112-1	АМФИ	248-258
1113.	112-1	АМФИ	280-282
1114.	112-1	АМФИ	302-313
1115.	112-1	Антигенный индекс	35-44
1116.	112-1	Антигенный индекс	57-61
1117.	112-1	Антигенный индекс	81-84
1118.	112-1	Антигенный индекс	91-98
1119.	112-1	Антигенный индекс	125-133
1120.	112-1	Антигенный индекс	140-147
1121.	112-1	Антигенный индекс	149-159
1122.	112-1	Антигенный индекс	161-165
1123.	112-1	Антигенный индекс	174-190
1124.	112-1	Антигенный индекс	192-200
1125.	112-1	Антигенный индекс	202-216
1126.	112-1	Антигенный индекс	218-224
1127.	112-1	Антигенный индекс	228-232
1128.	112-1	Антигенный индекс	239-244
1129.	112-1	Антигенный индекс	255-263
1130.	112-1	Антигенный индекс	290-300
1131.	112-1	Гидрофильность	38-40
1132.	112-1	Гидрофильность	57-61

1133.	112-1	Гидрофильность	92-98
1134.	112-1	Гидрофильность	125-133
1135.	112-1	Гидрофильность	141-143
1136.	112-1	Гидрофильность	150-159
1137.	112-1	Гидрофильность	161-164
1138.	112-1	Гидрофильность	175-190
1139.	112-1	Гидрофильность	203-216
1140.	112-1	Гидрофильность	218-224
1141.	112-1	Гидрофильность	228-232
1142.	112-1	Гидрофильность	239-244
1143.	112-1	Гидрофильность	259-261
1144.	112-1	Гидрофильность	293-297
1145.	112а	АМФИ	6-8
1146.	112а	АМФИ	12-34
1147.	112а	АМФИ	47-54
1148.	112а	АМФИ	63-65
1149.	112а	АМФИ	69-72
1150.	112а	АМФИ	84-86
1151.	112а	АМФИ	89-91
1152.	112а	АМФИ	107-109
1153.	112а	АМФИ	116-123
1154.	112а	АМФИ	183-186
1155.	112а	АМФИ	244-246
1156.	112а	АМФИ	248-258
1157.	112а	АМФИ	280-282
1158.	112а	АМФИ	302-310
1159.	112а	АМФИ	321-336
1160.	112а	Антигенный индекс	35-44
1161.	112а	Антигенный индекс	57-61
1162.	112а	Антигенный индекс	81-84
1163.	112а	Антигенный индекс	91-98
1164.	112а	Антигенный индекс	125-133
1165.	112а	Антигенный индекс	140-147

1166.	112а	Антигенный индекс	150-158
1167.	112а	Антигенный индекс	161-164
1168.	112а	Антигенный индекс	174-190
1169.	112а	Антигенный индекс	194-200
1170.	112а	Антигенный индекс	202-216
1171.	112а	Антигенный индекс	218-220
1172.	112а	Антигенный индекс	222-224
1173.	112а	Антигенный индекс	228-232
1174.	112а	Антигенный индекс	239-244
1175.	112а	Антигенный индекс	256-263
1176.	112а	Антигенный индекс	290-301
1177.	112а	Антигенный индекс	351-356
1178.	112а	Гидрофильность	38-40
1179.	112а	Гидрофильность	57-61
1180.	112а	Гидрофильность	93-98
1181.	112а	Гидрофильность	125-133
1182.	112а	Гидрофильность	141-143
1183.	112а	Гидрофильность	150-155
1184.	112а	Гидрофильность	161-164
1185.	112а	Гидрофильность	175-190
1186.	112а	Гидрофильность	203-216
1187.	112а	Гидрофильность	218-220
1188.	112а	Гидрофильность	222-224
1189.	112а	Гидрофильность	228-232
1190.	112а	Гидрофильность	239-244
1191.	112а	Гидрофильность	259-261
1192.	112а	Гидрофильность	293-297
1193.	112а	Гидрофильность	351-356
1194.	114-1	АМФИ	45-54
1195.	114-1	АМФИ	154-160
1196.	114-1	АМФИ	182-190
1197.	114-1	АМФИ	224-226
1198.	114-1	АМФИ	229-233

1199.	114-1	АМФИ	285-287
1200.	114-1	АМФИ	303-310
1201.	114-1	АМФИ	321-332
1202.	114-1	АМФИ	392-398
1203.	114-1	АМФИ	413-416
1204.	114-1	АМФИ	450-452
1205.	114-1	АМФИ	477-487
1206.	114-1	АМФИ	506-509
1207.	114-1	АМФИ	525-529
1208.	114-1	АМФИ	565-567
1209.	114-1	АМФИ	614-621
1210.	114-1	АМФИ	631-635
1211.	114-1	АМФИ	770-774
1212.	114-1	АМФИ	810-813
1213.	114-1	АМФИ	847-849
1214.	114-1	АМФИ	851-853
1215.	114-1	АМФИ	875-879
1216.	114-1	АМФИ	951-956
1217.	114-1	АМФИ	975-980
1218.	114-1	АМФИ	1034-1036
1219.	114-1	АМФИ	1048-1051
1220.	114-1	АМФИ	1073-1081
1221.	114-1	АМФИ	1086-1090
1222.	114-1	АМФИ	1095-1102
1223.	114-1	АМФИ	1111-1115
1224.	114-1	АМФИ	1163-1167
1225.	114-1	АМФИ	1242-1245
1226.	114-1	АМФИ	1275-1281
1227.	114-1	АМФИ	1312-1317
1228.	114-1	АМФИ	1338-1347
1229.	114-1	АМФИ	1349-1355
1230.	114-1	АМФИ	1357-1360
1231.	114-1	АМФИ	1362-1365

1232.	114-1	АМФИ	1376-1398
1233.	114-1	АМФИ	1418-1421
1234.	114-1	АМФИ	1425-1429
1235.	114-1	АМФИ	1468-1473
1236.	114-1	АМФИ	1476-1485
1237.	114-1	АМФИ	1495-1515
1238.	114-1	АМФИ	1518-1526
1239.	114-1	АМФИ	1546-1555
1240.	114-1	АМФИ	1557-1559
1241.	114-1	АМФИ	1580-1583
1242.	114-1	АМФИ	1585-1597
1243.	114-1	АМФИ	1604-1606
1244.	114-1	АМФИ	1613-1624
1245.	114-1	АМФИ	1626-1630
1246.	114-1	АМФИ	1638-1644
1247.	114-1	АМФИ	1655-1660
1248.	114-1	АМФИ	1662-1664
1249.	114-1	АМФИ	1672-1674
1250.	114-1	АМФИ	1677-1679
1251.	114-1	АМФИ	1691-1694
1252.	114-1	АМФИ	1713-1716
1253.	114-1	АМФИ	1719-1729
1254.	114-1	АМФИ	1735-1738
1255.	114-1	АМФИ	1753-1757
1256.	114-1	АМФИ	1772-1778
1257.	114-1	АМФИ	1790-1792
1258.	114-1	АМФИ	1817-1826
1259.	114-1	АМФИ	1828-1832
1260.	114-1	АМФИ	1840-1851
1261.	114-1	АМФИ	1854-1856
1262.	114-1	АМФИ	1871-1881
1263.	114-1	АМФИ	1883-1896
1264.	114-1	АМФИ	1922-1927

1265.	114-1	АМФИ	1934-1946
1266.	114-1	АМФИ	1950-1955
1267.	114-1	АМФИ	1957-1964
1268.	114-1	Антигенный индекс	1-6
1269.	114-1	Антигенный индекс	10-16
1270.	114-1	Антигенный индекс	23-37
1271.	114-1	Антигенный индекс	41-55
1272.	114-1	Антигенный индекс	75-85
1273.	114-1	Антигенный индекс	91-97
1274.	114-1	Антигенный индекс	102-140
1275.	114-1	Антигенный индекс	147-156
1276.	114-1	Антигенный индекс	161-168
1277.	114-1	Антигенный индекс	172-174
1278.	114-1	Антигенный индекс	181-189
1279.	114-1	Антигенный индекс	196-203
1280.	114-1	Антигенный индекс	208-213
1281.	114-1	Антигенный индекс	220-229
1282.	114-1	Антигенный индекс	242-248
1283.	114-1	Антигенный индекс	251-266
1284.	114-1	Антигенный индекс	268-276.
1285.	114-1	Антигенный индекс	295-307,
1286.	114-1	Антигенный индекс	309-312
1287.	114-1	Антигенный индекс	318-340
1288.	114-1	Антигенный индекс	345-351
1289.	114-1	Антигенный индекс	357-366
1290.	114-1	Антигенный индекс	371-381
1291.	114-1	Антигенный индекс	385-392
1292.	114-1	Антигенный индекс	404-417
1293.	114-1	Антигенный индекс	419-432
1294.	114-1	Антигенный индекс	440-456
1295.	114-1	Антигенный индекс	464-468
1296.	114-1	Антигенный индекс	473-480
1297.	114-1	Антигенный индекс	482-488

1298.	114-1	Антигенный индекс	496-511
1299.	114-1	Антигенный индекс	515-530
1300.	114-1	Антигенный индекс	535-549
1301.	114-1	Антигенный индекс	555-560
1302.	114-1	Антигенный индекс	564-582
1303.	114-1	Антигенный индекс	588-596
1304.	114-1	Антигенный индекс	602-615
1305.	114-1	Антигенный индекс	617-620
1306.	114-1	Анти генный индекс	622-624
1307.	114-1	Антигенный индекс	628-632
1308.	114-1	Антигенный индекс	637-640
1309.	114-1	Антигенный индекс	647-654
1310.	114-1	Антигенный индекс	660-666
1311.	114-1	Антигенный индекс	668-688
1312.	114-1	Антигенный индекс	696-725
1313.	114-1	Антигенный индекс	730-733
1314.	114-1	Антигенный индекс	738-755
1315.	114-1	Антигенный индекс	760-766
1316.	114-1	Антигенный индекс	779-783
1317.	114-1	Антигенный индекс	786-799
1318.	114-1	Антигенный индекс	807-809
1319.	114-1	Антигенный индекс	811-819
1320.	114-1	Антигенный индекс	831-839
1321.	114-1	Антигенный индекс	845-857
1322.	114-1	Антигенный индекс	860-862
1323.	114-1	Антигенный индекс	864-868
1324.	114-1	Антигенный индекс	872-879
1325.	114-1	Антигенный индекс	883-891
1326.	114-1	Антигенный индекс	893-903
1327.	114-1	Антигенный индекс	908-916
1328.	114-1	Антигенный индекс	919-936
1329.	114-1	Антигенный индекс	941-947
1330.	114-1	Антигенный индекс	950-956

1331.	114-1	Антигенный индекс	959-976
1332.	114-1	Антигенный индекс	979-991
1333.	114-1	Антигенный индекс	993-1000
1334.	114-1	Антигенный индекс	1007-1022
1335.	114-1	Антигенный индекс	1041-1053
1336.	114-1	Антигенный индекс	1062-1068
1337.	114-1	Антигенный индекс	1075-1108
1338.	114-1	Антигенный индекс	1115-1121
1339.	114-1	Антигенный индекс	1126-1145
1340.	114-1	Антигенный индекс	1148-1152
1341.	114-1	Антигенный индекс	1156-1178
1342.	114-1	Антигенный индекс	1195-1206
1343.	114-1	Антигенный индекс	1208-1212
1344.	114-1	Антигенный индекс	1217-1243
1345.	114-1	Антигенный индекс	1246-1263
1346.	114-1	Антигенный индекс	1271-1282
1347.	114-1	Антигенный индекс	1284-1288
1348.	114-1	Антигенный индекс	1292-1295
1349.	114-1	Антигенный индекс	1299-1307
1350.	114-1	Антигенный индекс	1318-1328
1351.	114-1	Антигенный индекс	1330-1340
1352.	114-1	Антигенный индекс	1344-1359
1353.	114-1	Антигенный индекс	1367-1384
1354.	114-1	Антигенный индекс	1395-1399
1355.	114-1	Антигенный индекс	1405-1417
1356.	114-1	Антигенный индекс	1445-1449
1357.	114-1	Антигенный индекс	1491-1510
1358.	114-1	Антигенный индекс	1526-1529
1359.	114-1	Антигенный индекс	1532-1548
1360.	114-1	Антигенный индекс	1552-1556
1361.	114-1	Антигенный индекс	1560-1562
1362.	114-1	Антигенный индекс	1573-1583
1363.	114-1	Антигенный индекс	1594-1611

1364.	114-1	Антигенный индекс	1627-1635
1365.	114-1	Антигенный индекс	1643-1645
1366.	114-1	Антигенный индекс	1647-1665
1367.	114-1	Антигенный индекс	1680-1686
1368.	114-1	Антигенный индекс	1700-1722
1369.	114-1	Антигенный индекс	1724-1726
1370.	114-1	Антигенный индекс	1739-1746
1371.	114-1	Антигенный индекс	1752-1757
1372.	114-1	Антигенный индекс	1780-1783
1373.	114-1	Антигенный индекс	1791-1795
1374.	114-1	Антигенный индекс	1804-1808
1375.	114-1	Антигенный индекс	1829-1835
1376.	114-1	Антигенный индекс	1841-1859
1377.	114-1	Антигенный индекс	1867-1886
1378.	114-1	Антигенный индекс	1897-1903
1379.	114-1	Антигенный индекс	1908-1912
1380.	114-1	Антигенный индекс	1917-1922
1381.	114-1	Антигенный индекс	1926-1934
1382.	114-1	Антигенный индекс	1938-1945
1383.	114-1	Антигенный индекс	1947-1957
1384.	114-1	Антигенный индекс	1961-1968
1385.	114-1	Антигенный индекс	1974-1978
1386.	114-1	Гидрофильность	4-6
1387.	114-1	Гидрофильность	12-15
1388.	114-1	Гидрофильность	23-34
1389.	114-1	Гидрофильность	43-55
1390.	114-1	Гидрофильность	76-85
1391.	114-1	Гидрофильность	104-110
1392.	114-1	Гидрофильность	118-123
1393.	114-1	Гидрофильность	127-132
1394.	114-1	Гидрофильность	147-154
1395.	114-1	Гидрофильность	163-167
1396.	114-1	Гидрофильность	185-187

1397.	114-1	Гидрофильность	197-203
1398.	114-1	Гидрофильность	208-211
1399.	114-1	Гидрофильность	221-227
1400.	114-1	Гидрофильность	243-245
1401.	114-1	Гидрофильность	253-261
1402.	114-1	Гидрофильность	263-266
1403.	114-1	Гидрофильность	270-272
1404.	114-1	Гидрофильность	295-301
1405.	114-1	Гидрофильность	309-312
1406.	114-1	Гидрофильность	320-328
1407.	114-1	Гидрофильность	332-337
1408.	114-1	Гидрофильность	345-351
1409.	114-1	Гидрофильность	360-366
1410.	114-1	Гидрофильность	371-378
1411.	114-1	Гидрофильность	387-392
1412.	114-1	Гидрофильность	404-415
1413.	114-1	Гидрофильность	419-432
1414.	114-1	Гидрофильность	441-450
1415.	114-1	Гидрофильность	452-456
1416.	114-1	Гидрофильность	473-480
1417.	114-1	Гидрофильность	482-485
1418.	114-1	Гидрофильность	496-500
1419.	114-1	Гидрофильность	504-509
1420.	114-1	Гидрофильность	515-520
1421.	114-1	Гидрофильность	536-549
1422.	114-1	Гидрофильность	555-560
1423.	114-1	Гидрофильность	565-568
1424.	114-1	Гидрофильность	570-579
1425.	114-1	Гидрофильность	589-594
1426.	114-1	Гидрофильность	602-604
1427.	114-1	Гидрофильность	609-615
1428.	114-1	Гидрофильность	617-620
1429.	114-1	Гидрофильность	660-666

1430.	114-1	Гидрофильность	668-680
1431.	114-1	Гидрофильность	684-686
1432.	114-1	Гидрофильность	699-708
1433.	114-1	Гидрофильность	715-725
1434.	114-1	Гидрофильность	730-733
1435.	114-1	Гидрофильность	738-744
1436.	114-1	Гидрофильность	746-754
1437.	114-1	Гидрофильность	760-766
1438.	114-1	Гидрофильность	789-793
1439.	114-1	Гидрофильность	816-818
1440.	114-1	Гидрофильность	831-836
1441.	114-1	Гидрофильность	845-857
1442.	114-1	Гидрофильность	860-862
1443.	114-1	Гидрофильность	864-866
1444.	114-1	Гидрофильность	873-879
1445.	114-1	Гидрофильность	883-885
1446.	114-1	Гидрофильность	887-889
1447.	114-1	Гидрофильность	896-899
1448.	114-1	Гидрофильность	908-916
1449.	114-1	Гидрофильность	919-932
1450.	114-1	Гид рофил ьность	941-947
1451.	114-1	Гидрофильность	962-975
1452.	114-1	Гидрофильность	979-989
1453.	114-1	Гидрофильность	993-1000
1454.	114-1	Гидрофильность	1007-1022
1455.	114-1	Гидрофильность	1041-1043
1456.	114-1	Гидрофильность	1045-1053
1457.	114-1	Гидрофильность	1062-1068
1458.	114-1	Гидрофильность	1075-1078
1459.	114-1	Гидрофильность	1080-1087
1460.	114-1	Гидрофильность	1089-1104
1461.	114-1	Гидрофильность	1115-1121
1462.	114-1	Гидрофильность	1126-1141

1463	114-1	Гидрофилы-юсть	1143-1145
1464.	114-1	Гидрофильность	1148-1151
1465.	114-1	Гидрофильность	1157-1178
1466.	114-1	Гидрофильность	1197-1203
1467.	114-1	Гидрофильность	1217-1243
1468.	114-1	Гидрофильность	1246-1263
1469.	114-1	Гидрофильность	1271-1273
1470	114-1	Гидрофильность	1275-1277
1471.	114-1	Гидрофильность	1284-1288
1472.	114-1	Гидрофильность	1299-1307
1473.	114-1	Гидрофильность	1318-1326
1474.	114-1	Гидрофильность	1334-1340
1475.	114-1	Гидрофильность	1350-1355
1476.	114-1	Гидрофильность	1357-1359
1477.	114-1	Гидрофильность	1367-1384
1478.	114-1	Гидрофильность	1407-1417
1479.	114-1	Гидрофильность	1491-1510
1480.	114-1	Гидрофильность	1534-1540
1481.	114-1	Гидрофильность	1576-1583
1482.	114-1	Гидрофильность	1595-1607
1483.	114-1	Гидрофильность	1629-1635
1484.	114-1	Гидрофильность	1643-1645
1485.	114-1	Гидрофильность	1649-1665
1486.	114-1	Гидрофильность	1682-1686
1487.	114-1	Гидрофильность	1704-1722
1488.	114-1	Гидрофильность	1724-1726
1489.	114-1	Гидрофильность	1740-1746
1490.	114-1	Гидрофильность	1804-1806
1491.	114-1	Гидрофильность	1829-1835
1492.	114-1	Гидрофильность	1842-1855
1493.	114-1	Гидрофильность	1876-1879
1494.	114-1	Гидрофильность	1898-1900
1495.	114-1	Гидрофильность	1910-1912

1496.	114-1	Гидрофильность	1920-1922
1497.	114-1	Гидрофильность	1928-1930
1498.	114-1	Гидрофильность	1938-1940
1499.	114-1	Гидрофильность	1948-1954
1500.	114-1	Гидрофильность	1962-1967
1501.	114а	АМФИ	45-54
1502.	114а	АМФИ	154-160
1503.	114а	АМФИ	182-190
1504.	114а	АМФИ	224-226
1505.	114а	АМФИ	229-233
1506.	114а	АМФИ	285-287
1507.	114а	АМФИ	303-310
1508.	114а	АМФИ	321-332
1509.	114а	АМФИ	348-350
1510.	114а	АМФИ	392-398
1511.	114а	АМФИ	414-416
1512.	114а	АМФИ	478-486
1513.	114а	АМФИ	506-509
1514.	114а	АМФИ	525-529
1515.	114а	АМФИ	565-567
1516.	114а	АМФИ	614-621
1517.	114а	АМФИ	631-635
1518.	114а	АМФИ	770-774
1519.	114а	АМФИ	811-813
1520.	114а	АМФИ	847-849
1521.	114а	АМФИ	851-853
1522.	114а	АМФИ	875-879
1523.	114а	АМФИ	951-959
1524.	114а	АМФИ	975-981
1525.	114а	АМФИ	1034-1036
1526.	114а	АМФИ	1048-1051
1527.	114а	АМФИ	1073-1081
1528.	114а	АМФИ	1086-1090

1529.	114а	АМФИ	1095-1102
1530.	114а	АМФИ	1111-1115
1531.	114а	АМФИ	1163-1166
1532.	114а	АМФИ	1275-1281
1533.	114а	АМФИ	1312-1317
1534.	114а	АМФИ	1338-1347
1535.	114а	АМФИ	1349-1355
1536.	114а	АМФИ	1357-1365
1537.	114а	АМФИ	1376-1398
1538.	114а	АМФИ	1418-1420
1539.	114а	АМФИ	1455-1460
1540.	114а	АМФИ	1472-1484
1541.	114а	АМФИ	1497-1505
1542.	114а	АМФИ	1507-1512
1543.	114а	Антигенный индекс	1-6
1544.	114а	Антигенный индекс	10-16
1545.	114а	Антигенный индекс	23-37
1546.	114а	Антигенный индекс	41-55
1547.	114а	Антигенный индекс	75-85
1548.	114а	Антигенный индекс	91-97
1549.	114а	Антигенный индекс	102-137
1550.	114а	Антигенный индекс	147-156
1551.	114а	Антигенный индекс	161-168
1552.	114а	Антигенный индекс	172-174
1553.	114а	Антигенный индекс	181-189
1554.	114а	Антигенный индекс	196-203
1555.	114а	Антигенный индекс	208-213
1556.	114а	Антигенный индекс	220-229
1557.	114а	Антигенный индекс	242-248
1558.	114а	Антигенный индекс	251-266
1559.	114а	Антигенный индекс	268-276
1560.	114а	Антигенный индекс	295-307
1561.	114а	Антигенный индекс	309-312

1562.	114а	Антигенный индекс	318-340
1563.	114а	Антигенный индекс	345-352
1564.	114а	Антигенный индекс	357-366
1565.	114а	Антигенный индекс	371-381
1566.	114а	Антигенный индекс	385-392
1567.	114а	Антигенный индекс	404-427
1568.	114а	Антигенный индекс	429-434
1569.	114а	Антигенный индекс	440-456
1570.	114а	Антигенный индекс	465-468
1571.	114а	Антигенный индекс	473-494
1572.	114а	Антигенный индекс	496-510
1573.	114а	Антигенный индекс	515-530
1574.	114а	Антигенный индекс	535-549
1575.	114а	Антигенный индекс	555-560
1576.	114а	Антигенный индекс	564-578
1577.	114а	Антигенный индекс	588-596
1578.	114а	Антигенный индекс	602-615
1579.	114а	Антигенный индекс	617-620
1580.	114а	Антигенный индекс	622-624
1581.	114а	Антигенный индекс	628-632
1582.	114а	Антигенный индекс	637-640
1583.	114а	Антигенный индекс	647-654
1584.	114а	Антигенный индекс	660-666
1585.	114а	Антигенный индекс	668-688
1586.	114а	Антигенный индекс	697-725
1587.	114а	Антигенный индекс	730-733
1588.	114а	Антигенный индекс	738-755
1589.	114а	Антигенный индекс	760-766
1590.	114а	Антигенный индекс	779-783
1591.	114а	Антигенный индекс	786-799
1592.	114а	Антигенный индекс	806-809
1593.	114а	Антигенный индекс	811-819
1594.	114а	Антигенный индекс	831-839

1595.	114а	Антигенный индекс	845-857
1596.	114а	Антигенный индекс	860-862
1597.	114а	Антигенный индекс	864-868
1598.	114а	Антигенный индекс	872-879
1599.	114а	Антигенный индекс	883-891
1600.	114а	Антигенный индекс	893-902
1601.	114а	Антигенный индекс	908-916
1602.	114а	Антигенный индекс	923-936
1603.	114а	Антигенный индекс	941-947
1604.	114а	Антигенный индекс	950-956
1605.	114а	Антигенный индекс	959-976
1606.	114а	Антигенный индекс	979-989
1607.	114а	Антигенный индекс	993-1000
1608.	114а	Антигенный индекс	1007-1022
1609.	114а	Антигенный индекс	1041-1053
1610.	114а	Антигенный индекс	1062-1068
1611.	114а	Антигенный индекс	1075-1108
1612.	114а	Антигенный индекс	1115-1121
1613.	114а	Антигенный индекс	1126-1145
1614.	114а	Антигенный индекс	1148-1152
1615.	114а	Антигенный индекс	1157-1176
1616.	114а	Антигенный индекс	1195-1206
1617.	114а	Антигенный индекс	1208-1212
1618.	114а	Антигенный индекс	1224-1243
1619.	114а	Антигенный индекс	1247-1263
1620.	114а	Антигенный индекс	1271-1282
1621.	114а	Антигенный индекс	1284-1288
1622.	114а	Антигенный индекс	1292-1295
1623.	114а	Антигенный индекс	1299-1307
1624.	114а	Антигенный индекс	1318-1328
1625.	114а	Антигенный индекс	1330-1340
1626.	114а	Антигенный индекс	1344-1359
1627.	114а	Антигенный индекс	1367-1384

1628.	114а	Антигенный индекс	1396-1399
1629.	114а	Антигенный индекс	1405-1417
1630.	114а	Антигенный индекс	1434-1436
1631.	114а	Антигенный индекс	1449-1451
1632.	114а	Антигенный индекс	1468-1487
1633.	114а	Антигенный индекс	1498-1503
1634.	114а	Антигенный индекс	1509-1515
1635.	114а	Антигенный индекс	1525-1532
1636.	114а	Гидрофильность	4-6
1637.	114а	Гидрофильность	12-15
1638.	114а	Гидрофильность	23-34
1639.	114а	Гидрофильность	43-55
1640.	114а	Гидрофильность	76-85
1641.	114а	Гидрофильность	104-110
1642.	114а	Гидрофильность	118-123
1643.	114а	Гидрофильность	127-132
1644.	114а	Гидрофильность	147-154
1645.	114а	Гидрофильность	163-167
1646.	114а	Гидрофильность	185-187
1647.	114а	Гидрофильность	197-203
1648.	114а	Гидрофильность	208-211
1649.	114а	Гидрофильность	221-227
1650.	114а	Гидрофильность	243-245
1651.	114а	Гидрофильность	253-261
1652.	114а	Гидрофильность	263-266
1653.	114а	Гидрофильность	270-272
1654.	114а	Гидрофильность	295-301
1655.	114а	Гидрофильность	309-312
1656.	114а	Гидрофильность	320-328
1657.	114а	Гидрофильность	332-337
1658.	114а	Гидрофильность	345-351
1659.	114а	Гидрофильность	360-366
1660.	114а	Гидрофильность	371-378

1661.	114а	Гидрофильность	387-392
1662.	114а	Гидрофильность	404-417
1663.	114а	Гидрофильность	421-423
1664.	114а	Гидрофильность	425-427
1665.	114а	Гидрофильность	442-456
1666.	114а	Гидрофильность	473-488
1667.	114а	Гидрофильность	499-509
1668.	114а	Гидрофильность	515-520
1669.	114а	Гидрофильность	536-549
1670.	114а	Гидрофильность	555-560
1671.	114а	Гидрофильность	565-568
1672.	114а	Гидрофильность	570-578
1673.	114а	Гидрофильность	589-594
1674.	114а	Гидрофильность	602-604
1675.	114а	Гидрофильность	609-615
1676.	114а	Гидрофильность	617-620
1677.	114а	Гидрофильность	660-665
1678.	114а	Гидрофильность	668-680
1679.	114а	Гидрофильность	684-686
1680.	114а	Гидрофильность	699-708
1681.	114а	Гидрофильность	715-725
1682.	114а	Гидрофильность	730-733
1683.	114а	Гидрофильность	738-744
1684.	114а	Гидрофильность	746-754
1685.	114а	Гидрофильность	760-766
1686.	114а	Гидрофильность	789-793
1687.	114а	Гидрофильность	816-818
1688.	114а	Гидрофильность	831-836
1689.	114а	Гидрофильность	845-857
1690.	114а	Гидрофильность	860-862
1691.	114а	Гидрофильность	864-866
1692.	114а	Гидрофильность	873-879
1693.	114а	Гидрофильность	883-885

1694.	114а	Гидрофильность	887-889
1695.	114а	Гидрофильность	896-899
1696.	114а	Гидрофильность	908-916
1697.	114а	Гидрофильность	923-932
1698.	114а	Гидрофильность	941-947
1699.	114а	Гидрофильность	961-975
1700.	114а	Гидрофильность	979-989
1701.	114а	Гидрофильность	993-1000
1702.	114а	Гидрофильность	1007-1022
1703.	114а	Гидрофильность	1041-1043
1704.	114а	Гидрофильность	1045-1053
1705.	114а	Гидрофильность	1062-1068
1706.	114а	Гидрофильность	1075-1078
1707.	114а	Гидрофильность	1080-1087
1708.	114а	Гидрофильность	1089-1104
1709.	114а	Гидрофильность	1115-1121
1710.	114а	Гидрофильность	1126-1141
1711.	114а	Гидрофильность	1143-1145
1712.	114а	Гидрофильность	1148-1151
1713.	114а	Гидрофильность	1158-1171
1714.	114а	Гидрофильность	1197-1203
1715.	114а	Гидрофильность	1224-1243
1716.	114а	Гидрофильность	1251-1263
1717.	114а	Гидрофильность	1271-1273
1718.	114а	Гидрофильность	1275-1277
1719.	114а	Гидрофильность	1284-1288
1720.	114а	Гидрофильность	1299-1307
1721.	114а	Гидрофильность	1318-1326
1722.	114а	Гидрофильность	1334-1340
1723.	114а	Гидрофильность	1350-1359
1724.	114а	Гидрофильность	1367-1384
1725.	114а	Гидрофильность	1407-1417
1726.	114а	Гидрофильность	1449-1451

1727.	114а	Гидрофильность	1469-1482
1728.	114а	Гидрофильность	1484-1486
1729.	114а	Гидрофильность	1498-1503
1730.	114а	Гидрофильность	1510-1512
1731.	114а	Гидрофильность	1527-1532
1732.	124-1	АМФИ	37-43
1733.	124-1	АМФИ	94-96
1734.	124-1	АМФИ	113-115
1735.	124-1	Антигенный индекс	20-26
1736.	124-1	Антигенный индекс	38-43
1737.	124-1	Антигенный индекс	52-55
1738.	124-1	Антигенный индекс	62-70
1739.	124-1	Антигенный индекс	88-97
1740.	124-1	Антигенный индекс	104-114
1741.	124-1	Антигенный индекс	123-135
1742.	124-1	Антигенный индекс	146-155
1743.	124-1	Гидрофильность	20-26
1744.	124-1	Гидрофильность	41-43
1745.	124-1	Гидрофильность	52-55
1746.	124-1	Гидрофильность	63-69
1747.	124-1	Гидрофильность	91-94
1748.	124-1	Гидрофильность	104-114
1749.	124-1	Гидрофильность	123-135
1750.	124-1	Гидрофильность	146-155
1751.	124а	АМФИ	19-21
1752.	124а	АМФИ	23-29
1753.	124а	АМФИ	37-43
1754.	124а	АМФИ	94-96
1755.	124а	Антигенный индекс	38-43
1756.	124а	Антигенный индекс	52-55
1757.	124а	Антигенный индекс	62-70
1758.	124а	Антигенный индекс	77-80
1759.	124а	Антигенный индекс	90-96

1760.	124а	Антигенный индекс	105-115
1761.	124а	Антигенный индекс	120-135
1762.	124а	Антигенный индекс	145-153
1763.	124а	Гидрофильность	41-43
1764.	124а	Гидрофильность	52-55
1765.	124а	Гидрофильность	63-69
1766.	124а	Гидрофильность	91-95
1767.	124а	Гидрофильность	108-115
1768.	124а	Гидрофильность	120-135
1769.	124а	Гидрофильность	146-153

Должно быть понятно, что данное изобретение описано выше только посредством примера, и без отклонения от объема и сущности данного изобретения могут быть произведены его модификации.

ТАБЛИЦА II

Данное изобретение не включает в его объем белки, содержащие любую из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544. Как указано выше, если длина какой-либо конкретной белковой последовательности, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам, то антигенный фрагмент данного изобретения имеет самое большее х-1 аминокислот данного белка. Для каждой из 45 белковых последовательностей, приведенных в WO99/36544, величина х приведена для ссылки в следующей таблице:

SEQ ID NO:	X	SEQ ID NO:	X	SEQ ID NO:	X	SEQ ID NO:	X
2	245	26	571	50	185	74	150
4	591	28	710	52	166	76	255
6	592	30	710	54	326	78	255
8	164	32	62	56	356	80	172
10	321	34	86	58	284	82	242
12	321	36	92	60	1978	84	242
14	124	38	103	62	1532	86	183
16	124	40	85	64	593	88	155
18	173	42	78	66	129	90	153
20	640	44	78	68	319
22	761	46	219	70	619
24	111	48	212	72	595

1. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент белка Neisseria meningitidis, характеризуемого аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, где указанный фрагмент включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и имеет не более 1977 аминокислот SEQ ID NO:1 и/или, по крайней мере, один фрагмент белка Neisseria meningitidis, характеризуемого аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, где указанный фрагмент включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и имеет не более 1531 аминокислот SEQ ID NO:2, при условии, что указанный белок не характеризуется ни аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, ни аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

2. Белок по п.1, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 76-85, 91-97, 102-140, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-415, 404-417, 413-416, 419-432, 440-456, 441-450, 450-452, 452-456, 464-468, 473-480, 477-487, 482-485, 482-488, 496-500, 496-511, 504-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-582, 565-567, 565-568, 570-579, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 696-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 807-809, 810-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-903, 896-899, 908-916, 919-932, 919-936, 941-947, 950-956, 951-956, 959-976, 962-975, 975-980, 979-989, 979-991, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1156-1178, 1157-1178, 1163-1167, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1217-1243, 1242-1245, 1246-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1355, 1357-1359, 1357-1360, 1362-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1395-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1421, 1425-1429, 1445-1449, 1468-1473, 1476-1485, 1491-1510, 1495-1515, 1518-1526, 1526-1529, 1532-1548, 1534-1540, 1546-1555, 1552-1556, 1557-1559, 1560-1562, 1573-1583, 1576-1583, 1580-1583, 1585-1597, 1594-1611, 1595-1607, 1604-1606, 1613-1624, 1626-1630, 1627-1635, 1629-1635, 1638-1644, 1643-1645, 1647-1665, 1649-1665, 1655-1660, 1662-1664, 1672-1674, 1677-1679, 1680-1686, 1682-1686, 1691-1694, 1700-1722, 1704-1722, 1713-1716, 1719-1729, 1724-1726, 1735-1738, 1739-1746, 1740-1746, 1752-1757, 1753-1757, 1772-1778, 1780-1783, 1790-1792, 1791-1795, 1804-1806, 1804-1808, 1817-1826, 1828-1832, 1829-1835, 1840-1851, 1841-1859, 1842-1855, 1854-1856, 1867-1886, 1871-1881, 1876-1879, 1883-1896, 1897-1903, 1898-1900, 1908-1912, 1910-1912, 1917-1922, 1920-1922, 1922-1927, 1926-1934, 1928-1930, 1934-1946, 1938-1940, 1938-1945, 1947-1957, 1948-1954, 1950-1955, 1957-1964, 1961-1968, 1962-1967 или 1974-1978 указанной SEQ ID NO:1.

3. Белок по п.1, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 91-97, 102-137, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251,266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 345-352, 348-350, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-417, 404-427, 414-416, 421-423, 425-427, 429-434, 440-456, 442-456, 465-468, 473-488, 473-494, 478-486, 496-510, 499-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-578, 565-567, 565-568, 570-578, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-665, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 697-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 806-809, 811-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-902, 896-899, 908-916, 923-932, 923-936, 941-947, 950-956, 951-959, 959-976, 961-975, 975-981, 979-989, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1157-1176, 1158-1171, 1163-1166, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1224-1243, 1247-1263, 1251-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1359, 1357-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1396-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1420, 1434-1436, 1449-1451, 1455-1460, 1468-1487, 1469-1482, 1472-1484, 1484-1486, 1497-1505, 1498-1503, 1507-1512, 1509-1515, 1510-1512, 1525-1532 или 1527-1532 указанной SEQ ID NO:2.

4. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

5. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

6. Белок по любому из пп.1-3, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

7. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 76-85, 91-97, 102-140, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-415, 404-417, 413-416, 419-432, 440-456, 441-450, 450-452, 452-456, 464-468, 473-480, 477-487, 482-485, 482-488, 496-500, 496-511, 504-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-582, 565-567, 565-568, 570-579, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 696-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 807-809, 810-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-903, 896-899, 908-916, 919-932, 919-936, 941-947, 950-956, 951-956, 959-976, 962-975, 975-980, 979-989, 979-991, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1156-1178, 1157-1178, 1163-1167, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1217-1243, 1242-1245, 1246-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1355, 1357-1359, 1357-1360, 1362-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1395-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1421, 1425-1429, 1445-1449, 1468-1473, 1476-1485, 1491-1510, 1495-1515, 1518-1526, 1526-1529, 1532-1548, 1534-1540, 1546-1555, 1552-1556, 1557-1559, 1560-1562, 1573-1583, 1576-1583, 1580-1583, 1585-1597, 1594-1611, 1595-1607, 1604-1606, 1613-1624, 1626-1630, 1627-1635, 1629-1635, 1638-1644, 1643-1645, 1647-1665, 1649-1665, 1655-1660, 1662-1664, 1672-1674, 1677-1679, 1680-1686, 1682-1686, 1691-1694, 1700-1722, 1704-1722, 1713-1716, 1719-1729, 1724-1726, 1735-1738, 1739-1746, 1740-1746, 1752-1757, 1753-1757, 1772-1778, 1780-1783, 1790-1792, 1791-1795, 1804-1806, 1804-1808, 1817-1826, 1828-1832, 1829-1835, 1840-1851, 1841-1859, 1842-1855, 1854-1856, 1867-1886, 1871-1881, 1876-1879, 1883-1896, 1897-1903, 1898-1900, 1908-1912, 1910-1912, 1917-1922, 1920-1922, 1922-1927, 1926-1934, 1928-1930, 1934-1946, 1938-1940, 1938-1945, 1947-1957, 1948-1954, 1950-1955, 1957-1964, 1961-1968, 1962-1967 или 1974-1978 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 белка Neisseria meningitidis при условии, что указанный белок не характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

8. Белок по п.7, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

9. Белок по п.7, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

10. Белок по п.7, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

11. Белок, включающий, по крайней мере, один фрагмент, который включает, по крайней мере, одну антигенную детерминанту и является аминокислотами 1-6, 4-6, 10-16, 12-15, 23-34, 23-37, 41-55, 43-55, 45-54, 75-85, 91-97, 102-137, 104-110, 118-123, 127-132, 147-154, 147-156, 154-160, 161-168, 163-167, 172-174, 181-189, 182-190, 185-187, 196-203, 197-203, 208-211, 208-213, 220-229, 221-227, 224-226, 229-233, 242-248, 243-245, 251-266, 253-261, 263-266, 268-276, 270-272, 285-287, 295-301, 295-307, 303-310, 309-312, 318-340, 320-328, 321-332, 332-337, 345-351, 345-352, 348-350, 357-366, 360-366, 371-378, 371-381, 385-392, 387-392, 392-398, 404-417, 404-427, 414-416, 421-423, 425-427, 429-434, 440-456, 442-456, 465-468, 473-488, 473-494, 478-486, 496-510, 499-509, 506-509, 515-520, 515-530, 525-529, 535-549, 536-549, 555-560, 564-578, 565-567, 565-568, 570-578, 588-596, 589-594, 602-604, 602-615, 609-615, 614-621, 617-620, 622-624, 628-632, 631-635, 637-640, 647-654, 660-665, 660-666, 668-680, 668-688, 684-686, 697-725, 699-708, 715-725, 730-733, 738-744, 738-755, 746-754, 760-766, 770-774, 779-783, 786-799, 789-793, 806-809, 811-813, 811-819, 816-818, 831-836, 831-839, 845-857, 847-849, 851-853, 860-862, 864-866, 864-868, 872-879, 873-879, 875-879, 883-885, 883-891, 887-889, 893-902, 896-899, 908-916, 923-932, 923-936, 941-947, 950-956, 951-959, 959-976, 961-975, 975-981, 979-989, 993-1000, 1007-1022, 1034-1036, 1041-1043, 1041-1053, 1045-1053, 1048-1051, 1062-1068, 1073-1081, 1075-1078, 1075-1108, 1080-1087, 1086-1090, 1089-1104, 1095-1102, 1111-1115, 1115-1121, 1126-1141, 1126-1145, 1143-1145, 1148-1151, 1148-1152, 1157-1176, 1158-1171, 1163-1166, 1195-1206, 1197-1203, 1208-1212, 1224-1243, 1247-1263, 1251-1263, 1271-1273, 1271-1282, 1275-1277, 1275-1281, 1284-1288, 1292-1295, 1299-1307, 1312-1317, 1318-1326, 1318-1328, 1330-1340, 1334-1340, 1338-1347, 1344-1359, 1349-1355, 1350-1359, 1357-1365, 1367-1384, 1376-1398, 1396-1399, 1405-1417, 1407-1417, 1418-1420, 1434-1436, 1449-1451, 1455-1460, 1468-1487, 1469-1482, 1472-1484, 1484-1486, 1497-1505, 1498-1503, 1507-1512, 1509-1515, 1510-1512, 1525-1532 или 1527-1532 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 белка Neisseria meningitidis, при условии, что указанный белок не характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

12. Белок по п.11, используемый для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

13. Белок по п.11, используемый для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

14. Белок по п.11, используемый для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

15. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-3, 7 и 11, которая характеризуется нуклеотидной последовательностью, в соответствии с генетическим кодом определяющей аминокислотную последовательность белка по любому из пп.1-3, 7 и 11.

16. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria.

17. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства диагностического реагента для обнаружения бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

18. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для производства реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

19. Фармацевтическая композиция для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria, включающая эффективное количество белка по любому из пп.1-3, 7 и 11 или нуклеиновой кислоты по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель.

20. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является вакциной.

21. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является диагностическим реагентом.

22. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция является иммуногенной композицией.

23. Композиция по п.19, используемая в качестве лекарственного средства.

24. Способ лечения инфекции, вызываемой бактериями Neisseria, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п.19.