Способ блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте

Изобретение относится к области микробиологии, молекулярной онкологии и может быть использовано для исследования процессов разрушения раковых клеток, находящихся в питательной среде или тканях биологического объекта. Способ включает воздействие на клетку или группу клеток внешнего источника энергии. При этом перед воздействием вводят, по меньшей мере, два электрода, один из которых - на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другой - на наружную поверхность мембраны клетки и измеряют значение мембранного потенциала. Затем к введенным электродам подключают противоположно по полярности внешний источник ЭДС со значением разности потенциалов не меньше значения мембранного потенциала клетки. Способ позволяет создать модель повреждения клетки путем ее “энергетического взрыва” и гибели.

 

Изобретение относится к области микробиологии и клинической медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для исследования процессов разрушения раковых клеток, находящихся в питательной среде, в организме и вне организма.

Исследование причин возникновения злокачественных опухолей и лечение онкологических заболеваний в последние годы перешли на молекулярный уровень.

Доказано, что для превращения нормальной клетки в раковую необходима активация не менее двух онкогенов, а для сохранения ее в этом качестве необходимо постоянное поступление онкобелков (Л. Киселев. Новое о молекулярной природе рака. Вестник АН СССР №1, 1987 г.).

В связи с этим блокирование деления раковых клеток проводится в следующих направлениях. Так, например, известен способ деструкции раковых клеток, основанный на использовании иммунохимиотерапии, в основу которого положен прием химических препаратов совместно с цитокинами, позволяющими блокировать деление раковых клеток (Л.А.Грачева. Цитокины в онкогематологии, М., “Алтус”, 1996 г., с.168.) Однако наличие токсического действия цитостатиков обуславливает возникновение рецидива заболевания. Для снижения токсических действий цитостатиков используется способ доставки цитостатика в комплексе с ДНК-антрациклином к опухоли. В этом случае раковые клетки активно поглощают ДНК, и благодаря этому внутрь клетки попадает цитостатик, что и приводит к гибели клетки (Tronet A., Depredate Campeneeve D., Smedt-Malengreaux M., de Aassi G. Experimental leukemia Chemotherapy with a lysosmotropic Adriamycin - DNA complex.// Eur. J. Cancer. - 1974, 10, 405). Однако селективная доставка химического препарата вызывает необходимость постоянного контроля антрациклина в крови.

Известен способ блокировки деления раковых клеток, основанный на введении в раковые клетки так называемого гена-протектора (ген РБ), который позволяет восстановить нарушенный “баланс сил” и тем самым остановить неудержимый рост раковых клеток (Г.Абелев. Научный поиск в онкологии. Наука и жизнь, №12, 1989 г., стр.16 -20). Однако, как показала практика, ген РБ эффективен в относительной мере только к редким формам рака - ретинобластоме и остеосаркоме.

В настоящее время в микробиологии наметилась тенденция блокирования и уничтожения раковых клеток посредством прямого энергетического воздействия на них. Это относится к методам воздействия электромагнитной энергией, преимущественно высокочастотной и световой с использованием лазеров. Колебательные процессы, инициированные излучением лазера, принципиально отличаются своей высокой упорядоченностью, что делает лазер уникальным инструментом для воздействия на биологические объекты с их сложной и совершенной системой электромагнитных энергетических взаимоотношений. Так, известен способ блокирования деления раковых клеток с использованием локальной лазерной гипертермии, основанный на воздействии света (А.Г.Коноплянников, Л.В.Штейн. Использование гипертермии для подавления репаративных процессов в опухолевых клетках и для повышения эффективности лучевой терапии. Медицинская радиология, 1977, №2, с.23-27). При анализе локальной лазерной гипертермии было обнаружено, что для эффективного объемного воздействия на раковые клетки необходимо использование инфракрасного диапазона излучения лазера с мощностью более 3-5 Вт. В этом случае глубина проникновения фотонов в ткани измеряется сантиметрами. При всех положительных сторонах этого способа было обнаружено, что для достижения требуемого эффекта необходимо соблюдать особый режим светового воздействия. Кроме того, необходимы особые светорассеивающие инструменты для внутритканевой световой гипертермии.

Наиболее близким техническим решением по совокупности существенных признаков является способ блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте, включающий воздействие на клетку или группу клеток внешним источником энергии с последующим преобразованием энергии клетки (Ardenne M. Von Theoretische und Experimentalle Grundlagen der Kreber-Mehrshrift-Therapie. Berlin, 1967, 365 s.). В основе предложенного способа лежит идея создания в клетке условий для некоего “энергетического взрыва”, в инициировании начального “запального” процесса в энергетически перенасыщенной среде. В этом случае избыток выделившейся локально энергии будет лавинообразно распространяться до полного использования “реактогенного” материала клетки. Состояние готовности к “энергетическому взрыву” клетки автор данного способа обеспечивает с помощью такого инструмента форсирования клеточной энергопродукции, как гипертермия. Для того чтобы максимально стимулировать процесс развития такой цепной реакции, автор дополнил гипертермию гипергликемией. Это оправдано тем, что раковые клетки возмещают энергетические потери за счет гликолиза. В то же время такая шоковая терапия рака является сложной, многоэтапной.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в повышении эффективности блокирования и разрушения раковых клеток.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте, включающем воздействие на клетку или группу клеток внешним источником электродвижущей силы (ЭДС), вначале в клетку или в группу клеток вводят электроды, одни из которых вводят на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другие - на наружную поверхность мембраны клетки, затем используют внешний источник ЭДС, полюса которого соединяют с противоположными по полярности электродами. Способ осуществляется следующим образом. Вводят электроды, представляющие собой потенциалочувствительные зонды АНС или микроэлектроды, в клетку или группу клеток. Затем предварительно измеряют значение мембранного потенциала в клетке. Число электродов должно быть не менее двух, один из которых вводится на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другой - на наружную поверхность мембраны клетки. На следующем этапе внешний источник ЭДС с разностью потенциалов не меньше значения мембранного потенциала клетки подключают к электродам таким образом, что его полюса соединяются с противоположными по полярности электродами.

В основе предложенного способа блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте лежит стимулирование начала процесса блокирования деления в энергетически перенасыщенной среде раковой клетки при помощи электрического воздействия на нее. Причина заключена в особенностях структуры раковых клеток. Они имеют иной характер трансмембранного переноса материалов, необходимых для клеточной интеграции, иные размеры мембранных пор и значение потенциала действия клеточных мембран, что в конечном итоге делает их энергетически перенасыщенными объектами. Известно, например, что раковые клетки излучают в оптическом диапазоне частот в ~ 100 раз интенсивнее нормальных клеток (Гурвич А.Г. Введение в учение о митогенезе. M., “Наука”, 1948 г.).

Действие электрического тока от внешнего источника, направление которого противоположно направлению тока в электродах, искусственно введенных в клетку или группу клеток, вызывает повышение пористости мембран, изменение размеров липидных пор, что ведет к изменению энергетики и высоты энергетического барьера последних. На начальном этапе взаимодействия двух энергетических объектов - клетки и внешнего источника ЭДС - действие электрического тока клетки направлено на повышение стабильности липидной бислойной мембраны, сохранение мембранного потенциала за счет расходования клеточной энергии.

При дальнейшем взаимодействии двух энергетических объектов в клетке появляются структурные дефекты в виде сквозных липидных пор (электропорация). Это приводит к резкой интенсификации процессов преобразования энергии в клетке, что в свою очередь создает условия для инициирования в ней “энергетического взрыва” и, как следствие, ее гибели. Описанная модель соответствует теории механизма гибели как нормальных, так и раковых клеток (В.Афанасьев, Б.Король и др. Две формы клеточной гибели: цитометрический и биохимический анализ. Доклады АН СССР, т.285, №2, 1985 г.).

Таким образом, введение внешнего источника ЭДС, значение потенциала которого не меньше значения мембранного потенциала клетки, обуславливает наличие описанных выше процессов в клетке. Эти процессы ведут на начальном этапе взаимодействия двух энергетических объектов к сохранению целостности клеточной мембраны посредством расхода дополнительной энергии раковой клеткой и, следовательно, к замедлению деления и ослаблению агрессивности раковой клетки. В дальнейшем они приводят к разрушению самой раковой клетки за счет полного расхода клеточной энергии: происходит переход необходимых внутриклеточных видов энергии в виды, которые безвозвратно рассеиваются во внешней среде.

Методом проточной цитометрии удается контролировать размер клеток после применения способа блокирования деления клеток, а также определить цитоплазматические и мембранные особенности клетки.

В проведенных исследованиях в качестве клеточного материала использовались быстро делящиеся бактерии Gluconobacter oxydans (около 5 мг в мл). Клетки вместе с ростовым субстратом размещались в измерительной кювете электрохимической ячейки с объемом ~3 мл. В клеточную среду вводили электроды, которые соединяли посредством медных проводов с прибором, измеряли значение мембранного потенциала, 60 mV, после чего к введенным электродам подключали противоположно по полярности внешний источник ЭДС со значением разности потенциалов 60 mV, не меньшим значения мембранного потенциала клетки, и его поддерживали в течение 15 мин. По истечении 15 мин источник внешнего потенциала был отключен. Опыт показал, что в следующие полчаса система развила потенциал, значение которого ~30 мV. Это значительно меньше, чем первоначальная величина 60 мV. В свою очередь было показано, что уменьшение значения мембранного потенциала приводит к замедлению деления клеток. В результате клеточная масса испытуемой среды оказывалась на ~20% меньше контрольной, где воздействие внешнего источника отсутствовало.

Данный способ позволяет подойти к решению задачи блокирования деления раковых клеток совершенно с другой стороны по отношению к известным способам: он позволяет исключить использование химических токсических препаратов, сократить время наступления лечебного эффекта, что в конечном итоге является важным шагом к решению проблем лечения раковых заболеваний.

Способ блокирования деления раковых клеток, включающий воздействие на клетку или группу клеток внешнего источника энергии, отличающийся тем, что перед воздействием вводят, по меньшей мере, два электрода, один из которых - на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другой - на наружную поверхность мембраны клетки и измеряют значение мембранного потенциала, после чего к введенным электродам подключают противоположно по полярности внешний источник ЭДС со значением разности потенциалов не меньше значения мембранного потенциала клетки.