Способ подготовки к криоконсервированию спермы сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к животноводству. Способ включает получение спермы от быков, оценку, разбавление и расфасовку в полимерные микроконтейнеры с помощью вакуума и закупоривания их с обоих концов. Один конец закупоривается герметиком, состоящим из сплава для покрытия твердых сычужных сыров - 60% и парафина - 40% к общему объему. Затем в условия изолированной камеры, с избыточным давлением стерильного воздуха, расфасовывается при помощи вакуума разбавленная сперма индивидуально от каждого быка. Второй конец микроконтейнера закупоривают погружением в санированный антибиотиком желток куриного яйца на 1-2 сек и эквилибрируют. Способ обеспечивает высокое качество спермы.

 

Изобретение относится к животноводству, к разведению сельхозживотных и, в частности, крупного рогатого скота, а именно криоконсервированию живых клеток организма для длительного хранения, транспортировки и использования.

Известен способ: «Французская технология» (автор R.Cassu, 1964 г.), заключающийся в применении оригинальных расфасовочных машин-автоматов для розлива разбавленного патентованной средой «Лецифосплас - 470» семени быков-производителей в микроконтейнеры, по французской технологии - пайеты или капиллярные трубочки из полимеров, с последующим замораживанием в парах жидкого азота для длительного хранения до использования. Ф.И.Осташко. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев: Урожай, 1978, c.167)[1].

Недостатком этого способа является неудобство работы лаборантов в течение длительного времени с семенем в помещении при низкой температуре (+4). Оборудование «Французской технологии», сложное в регулировке и обслуживании, размещается и обслуживается в холодильной камере, необходимо кропотливое соблюдение технологии, при малейших нарушениях параметров снижается качество конечного продукта.

Необходимость промывки и последующей стерилизации аппаратуры после каждого быка резко снижает производительность машины, достигающей до 4000 доз 8 час. [1].

Известен также способ подготовки семени к криоконсервации по «Харьковской технологии «(авторские свидетельства СССР: А 61 М 7/02 №523693, 1974 [2] и А 61 Д 7/02 №1072861, 1982 [3], Ф.И.Осташко, В.Шинкаренко. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев: Урожай, 1970) [4], заключающиеся в том, что подготовленное в стерильных условиях семя быков-производителей фасуется в одноразовую упаковку при комнатной температуре с помощью специального аппарата АРС-2 (Осташко Ф.И., Чирков В.А., авторское свидетельство СССР №343690, МКл Aj 5/00, 1971)[5] непрерывной разливки в пленочную трубчатую упаковку, с последующей запайкой-разделением на отдельные облицованные гранулы, которые ссыпаются в алюминиевые тубы, проходят эквилибрацию при t=2-5°C, вращаясь в барабане, установленном в холодильной камере.

Недостаток этого способа заключается в низкой производительности технологической установки, от 3000 до 3600 доз в час, неудобстве работы с семенем на завершающем этапе при осеменении коров - большие, до 20-25%, потери остатков семени в оболочке гранул, грубый осеменительный инструмент препятствует нормальной работе (П. Пакенас «Литовская технология» изд. Вильнюс 1993 г. с.4.).[6]

Известен также способ получения семени быков по «Литовской технологии». «Литовская технология содержания и использования племенных быков» П. Пакенас, изд. «ACADEMIA», Вильнюс, 1993 [7], авторское свидетельство СССР №552080, А 61 Д 7/02, 1975 [8], заключающийся в том, что предусматривает автоматизацию и механизацию почти всех технологических процессов по уходу за быками, получение от них семени, оценку его, разбавление, расфасовку, замораживание, хранение и дальнейшее использование.

Полученное от быков семя после оценки и разбавления расфасовывается в полимерные трубчатые микроконтейнеры с помощью вакуума и автоматически закрывается с обоих концов стеклянными шариками.

Недостаток этого способа в том, что необходимо вручную помещать столбик воздуха в центр микроконтейнера - капилляра для создания «воздушного буфера», необходимого для предотвращения растрескивания стенок при замораживании в жидком азоте, введение в микроконтейнер воздушного пузырька нарушает стерильность семени, применяемое оборудование, машины-автоматы сложны в регулировке, необходимы высокие требования к применяемым материалам и комплектующим, при обслуживании требуется высококвалифицированный персонал, но машины не обеспечивают стерильности при расфасовке, малопроизводительны, требуются параллельные технологические линии, дополнительный обслуживающий квалифицированный персонал.

Наиболее близкий прототип описан в РЕКОМЕНДАЦИИ Министерства сельского хозяйства РСФСР: «Технология замораживания спермы быков-производителей в жидком азоте с применением полипропиленовых соломинок» (И.Х.Хабибулин, Л.Г.Каримова, В.Е.Киселев. М.: РОССЕЛЬХОЗИЗДАТ, 1977) [9].

Технология дополнена орудованием: автор И. Хабибулин, авторские свидетельства: СССР №871798, 1975 [10] и №1219075 А, 1983, А 61 Д 7-02 [11] и основана на разработках академика В.К. Милованова по применению одноразовых натуральных соломинок в 1936 году и Э. Соренса Дания, предложившего в 1940 году пластмассовые капилляры (П.И.Пакенас. Литовская технология. Вильнюс, 1993, с.3).

Основные недостатки способа «Башкирская технология»: несоблюдение зооветеринарных требований по стерильности в работе, грубый, антифизиологический инструмент для искусственного осеменения маток, отсутствие одноразовых стерильных чехлов.

Предложенный в рамках «Башкирской технологии» в 1974 году И. Хабибулиным [9] в качестве герметика парафин при практических испытаниях дал отрицательный результат: через год хранения в жидком азоте трубчатых микроконтейнеров (капилляров) происходило растрескивание и расслоение парафиновой пробки-герметика и разгермитизация микроконтейнеров и проникновение в них жидкого азота и микрофлоры.

Азот, проникший через трещины, при размораживании вызвал самопроизвольный выброс продукции - в течение первого года хранения до 50%, через два года до 75%.

Предложенная И. Хабибулиным взамен парафина в 1978 году в качестве герметика клеевая композиция существовала в ограниченном количестве только в опытной разработке Уральского филиала Башкирской Академий наук и промышленностью не освоена. Практические испытания образца показали технологическую непригодность предложенного.

Предложенный И. Хабибулиным в 1978 году в рамках «Башкирской технологии» расфасовочный аппарат [10] из-за конструктивных недостатков не обеспечивал технологических параметров и качества и был забракован при практических испытаниях.

Предложенная в 1978 году И. Хабибулиным в рамках «Башкирской технологии» усовершенствованная расфасовочная камера [11] не вписывалась в технологический процесс, не обеспечивала стерильности и из-за конструктивных недостатков и качество продукции и была забракована на стадии освоения, при практических испытаниях.

Подготовка и стерилизация инструмента и оборудования проводится по общепринятым технологиям.

Одноразовые полиэтиленовые спермоприемники изготавливают из полиэтиленового рукава шириной 100 мм, толщиной пленки 0,025 мм, полученной на заводе путем вытяжки через экструдер из расплава при Т +250°C, одновременно осуществляется стерилизация полиэтиленового рукава для семяприемников. Дополнительная стерилизация семяприемников и затраты на это исключаются при сохранении высокого качества продукции.

На «ТЕРМОПАКЕ» запаивают оба конца полиэтиленового рукава под углом в 45 градусов, а перед снаряжением искусственные вагины для получения семени от быка разрезают на два семяприемника.

Снаряженные по общепринятой технологии искусственные вагины помещают в биотермостат для вагин с постоянной Т= +42 - +43 градуса.

Семя от быков получают по общепринятой технологии.

После получения эякулята с вагины снимают защитный чехол над «тепловым экраном», который расположен под укрепленной на стене «Молнией» (ТЕРМОПАК для полиэтиленовых пакетов).

Под «тепловой экран» использован нагревательный элемент от термостата ТВ-3 для искусственных вагин с автоматической регулировкой температуры в зоне стабильной температуры +35-+38 (от холодового шока нативного семени).

Исключаются затраты на поддержание стабильной температуры на манеже для взятия семени в зимний период.

На «Молнии-3» запаивают-отсекают треугольный полиэтиленовый пакет с эякулятом (на котором перед садкой быка надписывают шариковой ручкой кличку быка и номер эякулята) и помещают в шлюз, снабженный устройством для автоматического поддержания температуры и избыточного воздушного давления от лаборатории к манежу для перекрытия потока бакзагрязненного воздуха с манежа и бактерицидной лампой.

Перед работой в шлюзе включают встроенную бактерицидную лампу на 30 минут, воздушный компрессор работает в рабочее время постоянно.

Полученный через шлюз пакет с эякулятом обтирают спиртовым тампоном и взвешивают на эл. весах с точностью до 0,1 грамма. Эл.весы ВЛКТ-500М для удобства работы встроены в столешницу лабораторного стола.

Стерильными ножницами надрезают край пакета и берут пробу для анализа семени на концентрацию на КФК-2-УХЛ 4,2.

Активность и подвижность семени проверяют на микроскопе, вмонтированном в универсальную бактерицидную камеру УБНК-1. Вмонтированный в боковую стенку камеры микроскоп позволяет сохранять высокую степень стерильности при определении активности семени быков и исключает бакзагрязнение.

Разбавление проводят по СПЕЦИАЛЬНОЙ ТАБЛИЦЕ, учитывающей внутренний объем капилляра, объем герметика в капилляре, объем заливки желтком куриного яйца для образования защитной пленки на втором конце.

В таблице учтен объем эякулята, активность и подвижность сперматозоидов, необходимый объем добавляемого разбавителя семени для каждого эякулята, дополнительный объем в капилляре для герметизации второго конца желтком куриного яйца и количество капилляров для расфасовки всего объема разбавленного семени.

Основа расчета: при 9 баллах активности нативного и 43,5 миллионах активных спермиев в одной дозе перед замораживанием.

После размораживания: при активности 4 балла семя должно соответствовать государственному стандарту - иметь в дозе не менее 15 миллионов активных, с поступательным движением спермиев.

После определения активности и концентрации семени таблица дает возможность без дополнительных расчетов определять оптимальную степень разбавления нативного семени, объем разбавителя для полученного эякулята и количество капилляров для расфасовки этой серии.

Разбавление в сдвоенной универсальной камере УВНК в стерильных условиях.

Семя разбавляется в индивидуальные стаканы (с надписью на стакане: кличка и номер быка во избежание случайного смешивания). До разбавления эякуляты и мензурки с разбавителем помещают в кассеты биотермостата от «Литовской технологии» [7], вмонтированного в сдвоенную камеру УБНК.

Для длительного хранения семя расфасовывается в марлевые мешочки 50×150 мм (на 50-150 капилляров), а марлевые мешочки с семенем складируются в мешки из плотного материала.

Мешок маркируется: порода, линия, кличка и номер быка, дублируется на этикетке биостата.

Для соблюдения стерильности при работе технологического конвейера вакуум-тарелка была вмонтирована в универсальную настольную бактерицидную камеру.

Для обеспечения всех рабочих мест у камеры на лабораторном столе соединены торцами две камеры УБНК-1, в боковую стенку вмонтирован микроскоп, обогревательный столик от «Литовской технологии» [7], трансформатор к нему размещен в тумбочке лабораторного стола.

В тумбочке смонтирована бактерицидная камера, воздушный компрессор (ФЭН для сушки волос), воздуховод подает стерильный воздух в камеры УБНК, создавая избыточное давление, и вся работа с семенем быков проводится только в закрытой сдвоенной камере УБНК.

Электровакуум-насос вмонтирован в тумбочку лабораторного стола и герметично соединен вакуум-шлангом через тройник с вакуум-тарелкой. Тройник дает возможность дополнительно подключать нужное число вакуум-тарелок при paботе с большим количеством быков, что резко повышает пропускную способность установки.

Разбавленное семя фасуют в полипропиленовые капилляры с наружным D=2,50±0,05 мм, внутренним D=2,00±0,05 мм, длиной 100 ±1,00 мм.

Для расфасовки по «Уфимской технологии» пригодны любые капилляры, используемые при других технологиях.

Главное отличие «Уфимской технологии», разработанной в лаборатории Башплемпредприятия, - способ закупорки разбавленного семени производителя в микроконтейнере и герметики, применяемые для этого.

С одного конца микроконтейнер - капилляр запаивается спецмастикой - герметиком.

Основа герметика: сплав СДС-13М для покрытия твердых сычужных сыров. Температура плавления, t=+130-140°С, нетоксичен, применяется в молочной промышленности.

В состав входят компоненты: церезин, полиэтилен, воск 3В-1,бутилкаучук.

Для приготовления герметика взвешивается 60% сплава СДС-13М, к нему добавляется до 40% по весу тугоплавкого парафина.

Для запайки капилляров оптимизированный герметик расплавляется в течение 2-3 часов в длинной металлической кювете слабым нагревом до температуры кипения (мелкими пузырьками) до t+140°С, добавляется парафин и цветной карандаш по стеклу для контроля породы.

Сплав СДС-13М (каждая партия) поверяется на соответствие технологическим параметрам и при небходимости оптимизируется по составу для предупреждения появления микротрещин на герметике в жидком азоте при температуре -196°С и отслоения в зоне контакта с полипропиленовой стенкой капилляра и скольжения герметика как поршня, после размораживания, при температуре + 30-35 градусов, без большого сопротивления, при выталкивании семени из шприца ШО-3 при осеменении коровы.

Капилляры раскатывают на мерной линейке, фиксируют зажимом, выравнивают по высоте нажимом на кромку стола, (кромку стерилизуют перед работой спиртовым тампоном) и окунают в расплав герметика на 2-3 секунды на глубину до двух миллиметров, поверхностное натяжение затягивает расплав на 2,5-3,0 миллиметра.

Зажим с запаянными капиллярами переносят в воду для охлаждения и связывают в пучки по 25 или по 50 шт.

Пучки капилляров размещают вертикально, запайкой вниз в бьюксы и стерилизуют кварцевой лампой 30-45 мин на высоте лампы до 100 см над бьюксом и закрывают до использования.

Перед использованием пучки (дневная потребность) помещают в камеру УБНК-1 с включенными на ночь бактерицидными лампами.

При расфасовке семени между пробкой герметика и столбиком семени при откачке вакуум-насосом до -1,0 атм остается зазор в 0,1- 0,3 мм, а на другом конце (при правильном расчете таблицы) 1,0-2,0 мм до конца капилляра, где и закрывает отверстие капилляра желток куриного яйца пленкой до 0,1 мм, санируемый ГАМПом или антибиотиком по 5 мг на 20 мл желтка куриного яйца.

Для расфасовки всего эякулята отсчитывают пучки капилляров (по 25 или по 50 штук в пучке) и добавляют из россыпного стакана. Пример: 186 доз =(50×3)+25+11 россыпью. Все собирают в один пучок, обхватывают резиновым колечком (от камеры вагины барана) и помещают в стакан с разбавленным семенем быка - открытыми концами вниз.

На вакуум-тарелку размещают 3-4 стакана с разбавленным семенем и вложенными пучками капилляров, с нанесенными кличками быков, накрывают стеклянным колпаком и включают электровакуум-насос. За откачкой воздуха следят по манометру, при достижении -1,0 атм за 3-5 минут кран на тарелке перекрывают, насос отключают.

После опадания пены впускают воздух под стеклянный колпак, вакуум, образовавшийся в каждом капилляре под герметиком, одновременно втягивает разбавленное семя во все пучки во всех стаканах, стоящих на вакуум-тарелке под колпаком.

При правильно рассчитанной таблице на дне стаканов практически не остается разбавителя, на открытом конце капилляров остается 2-х мм столбик воздуха.

Пучки капилляров открытыми концами погружают в чашку Петри с желтком куриного яйца, поверхностное натяжение создает пленку.

Каждая серия семени сопровождается этикеткой, где указываются: КЛИЧКА и N быка, ДАТА получения семени, N СЕРИИ и КОЛИЧЕСТВО ДОЗ в серии.

Каждый пучок раздельно прокатывают по стерильному полотенцу для снятия излишков желтка, раскатывают на рамке от «Литовской технологии» [7] и ставят в холодильник для эквилибрации.

РАЗБАВИТЕЛЬ и способ его приготовления для семени быков при расфасовке в капилляры - общий для всех технологий.

Эквилибрация - 4 часа, при Т=+2-+5°С, в горизонтальном холодильнике-прилавке «ТАИР-102» (во избежание перепадов температуры во время работы при частом открывании дверцы вертикального холодильника холодный воздух вываливается, температура в холодильнике нестабильна).

За время эквилибрации желток на втором конце капилляра застывает в пленку, полностью герметизирующую содержимое капилляра от жидкого азота, бактериального и токсического воздействия.

Замораживание на пенопластовом кругу, плавающем на поверхности жидкого азота (покрытом медной сеткой от «Литовского устройства для замораживания семени - УЗС-12»[7]).

Высота сетки под размещение рамок с капиллярами над уровнем жидкого азота в биостате КВ-6202 до 50-75 мм над уровнем азота.

Цикл замораживания в течение 7 мин. Параметры температуры и времени контролируют электронным таймер-термометром ЭТ-200.

При необходимости (низкий уровень азота в биостате) для вскипания и снижения t aзота до -170 градусов вдоль стенки в биостат спускают на шнурах 1-2 алюминиевых диска Д =500 мм, толщиной 15-20 мм (транспортная крышка от биостата.

Полностью заменяет подачу паров азота для тех же целей с резервуара жидкого азота перед началом замораживания (по «Литовской технологии»[7]).

Регулировка погружения пенопластового круга от уровня азота до медной сетки 5,0-7,5 см регулируется подвешиванием грузиков или добавлением кусочков пенопласта.

Уровень погружения создает зону стабильной и оптимальной для замораживания семени температуры.

После замораживания капилляры засыпают через охлажденную воронку в заранее надписанные (N серии, N, кличка быка и дата получения семени, количество доз) марлевые мешочки, отдельно каждая серия.

Партия семени складируется в отдельный карантинный биостат на весь период карантина.

Карантин и экспресс-анализ семени общий для всех технологий.

После проверки на бакзагрязненность в ОБК, комиссионной проверки на соответствие ГОСту 26030-83 партия семени по акту передается в БАНК СЕМЕНИ.

Бычники работают сдельно, оплата зa дозу семени, полученную от закрепленной группы быков, после проверки на бакзагрязенность и отвечающую требованиям госстандарта.

Первичный учет в лаборатории, общий для всех технологий, в журнале - 1-ИО.

С журнала все лабораторные данные ежедневно разносятся в БАЗУ ДАННЫХ специальной селекционной программы в VIKe.

Программой закладывается в базу данных: ежедневный учет спермопродукции по каждому быку, учет движения семени: от получения до реализации в хозяйство, учет работы каждого бычника и начисление сдельной зарплаты за дозу.

Распечатка пакета сопроводительной документации при отправке семени в хозяйство: сертификаты на спермопродукцию и жидкий азот, ветсвидетельство, ордер и счет на отправленную продукцию.

В конце месяца и года проводится анализ полученной и отправленной спермопродукции по породам, линиям, реестр отправленного семени по хозяйствам и реестр счетов на продукцию.

Выводится остаток семени в банке по породе и по каждому быку.

Транспортировка азота и семени производится на азотовозах одновременно с заправкой сосудов Дьюара на пунктах искусственного осеменения в хозяйствах зоны обслуживания.

Проверенное перед отправкой семя размещают в транспортных канистрах Д=60 или 100 мм и доставляют в хозяйства в сосудах АТ-6 или Х-34 Т.

На пунктах искусственного осеменения при получении семени его перекладывают из транспортных канистр азотовоза в чистое ведро с налитым при заправке сосуда жидким азотом и в нем переносят на пункт искусственного осеменения.

На пункте при перекладке в канистру срезается завязка с этикеткой, которая привязываемся на ручку канистры, азот из ведра доливается в сосуд Дьюара.

Для размораживания семени применяются «ОТТАИВАТЕЛИ» фирмы «ГАМЕТА-АГРО».

Размораживание семени и осеменение коров проводят по общепринятым технологиям.

Осеменение проводят мано- или ректоцервикальным способом.

Основные преимущества «Уфимской технологии»:

Высокая производительность при минимальном штате.

Высокое качество семени обеспечивается:

Полным технологическим циклом работы с семенем в стерильных условиях закрытой универсальной настольной бактерицидной камеры.

Сдельной оплатой бычникам и технику по взятию семени за конечный продукт - дозу семени, соответствующую ГОСТу.

Простотой в работе по всем технологическим циклам, отсутствием проблем с оборудованием и запчастями.

Применением стандартного одноразового инструмента при осеменении.

Стоимость стандартного герметика почти в сто раз ниже стоимости стеклянных шариков для закупорки по «Литовской технологии» [7].

Низкая стоимость и доступность оборудования для расфасовки семени: цена электровакуум-насоса и вакуум-тарелки в несколько десятков раз ниже импортных расфасовочных машин, требующих сложной регулировки и квалифицированных специалистов по обслуживанию.

Все дополнительные приспособления сделаны из доступных материалов руками работников коллектива лаборатории.

Способ подготовки к криоконсервированию спермы сельскохозяйственных животных, заключающийся в том, что полученную сперму оценивают по качеству, разбавляют и расфасовывают в полимерные микроконтейнеры с помощью вакуума с последующей их герметизацией, при этом перед расфасовкой спермы готовят герметизирующий состав, состоящий из предварительно расплавленного сплава для покрытия твердых сычужных сыров, содержащего бутилкаучук, воск, полиэтилен и церезин, к которому добавляют тугоплавкий парафин при следующем соотношении компонентов, об.%: сплав для покрытия сычужных сыров 60%, тугоплавкий парафин 40%, после чего опускают в него на 2-3 с на глубину не более 2 мм один из концов микроконтейнера, затем охлаждают, стерилизуют и помещают в изолированную камеру с избыточным давлением стерильного воздуха в ней, где и расфасовывают под вакуумом разбавленную сперму в микроконтейнер, а затем герметизируют микроконтейнер путем погружения второго его конца в санированный антибиотиком желток куриного яйца на 1-2 с и эквилибрируют.