Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

Изобретение относится к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений. Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis осуществляют на питательной среде, состоящей из двух слоев. Для приготовления двухслойной среды стерильный ПФД (перфтордекалин) в количестве 2 мл помещают в пробирку, на него наслаивают 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом формируют систему, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон. Для разведения в среде готовят навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводят стерильной дистиллированной водой, раствор вносят в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствует критической. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносят в каждую пробирку по 0,2 мл. Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивают по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ (трифенил-тетразолия хлористого), который добавляют по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубируют еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашиваются в бордовый цвет. Культуру считают устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствует интенсивности окраски в контроле. При сравнении результатов точности определения лекарственной чувствительности с референс-методами получено полное совпадение результатов, однако способ по изобретению позволит сократить длительность определения до 9-ти дней. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений в условиях ограниченного финансирования.

Известен метод определения ЛЧ микобактерий с помощью ручной флюоресцентной системы BBL MGIT (BD). Индикация роста микобактерий в этой системе осуществляется по флюоресценции индикатора, расположенного в придонной части пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), содержащей бульон Middlebrook 7H9. Для оценки результатов в этой системе необходим источник ультрафиолетового излучения - трансиллюминатор (длина волны 365 нм) или прибор MicroMGIT. Кроме того, альтернативу классическим методикам представляют бактериологические системы, основанные на бульонном культивировании с помощью анализаторов: полуавтоматического радиометрического ВАСТЕС 460 и полностью автоматизированного ВАСТЕС MGIT 960, которые хорошо совместимы между собой по результатам. Определение ЛЧ с использованием ручной бактериологической системы BBL MGIT или анализаторов ВАСТЕС 460 и ВАСТЕС 960 занимает по времени 3-4 недель, при этом тестирование связано с дорогостоящим оборудованием и реактивами, что делает его неприемлемым при недостаточных ресурсах здравоохранения (Проблемы туберкулеза. – 2002 - №1, - стр.58-62).

Наиболее близким ускоренным и дешевым способом определения ЛЧ M.tuberculosis является способ посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезными препаратами с последующим определением роста M.tuberculosis.

(Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. - М.: Медгиз, 1963, - 225 стр.).

Однако известный способ не обеспечивает необходимый рост M.tuberculosis, эффективность, скорость и точность определения ЛЧ.

Целью предложенного способа является увеличение скорости роста М. tuberculosis, повышение точности и сокращение срока определения ЛЧ M.tuberculosis, что повышает эффективность определения ЛЧ к противотуберкулезным препаратам и как следствие своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.

Указанная цель достигается тем, что создают двухфазную жидкую среду, в качестве нижней фазы в которой используют перфтордекалин-газовую подложку - с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 М, при соотношении слоев обогащенной среды Школьниковой к подложке, равном 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток с помощью 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого.

Использование газовой подложки дает возможность улучшить аэрацию растущей культуры и замедлить развитие ацидоза за счет газообмена между средой и подложкой и на разделе фаз проводить калориметрическую оценку наличия или отсутствия роста M.tuberculosis посредством 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого (далее - ТТХ), который в течение 24 часов окрашивает активно растущую микробную популяцию.

В присутствии растущих микобактерий бесцветный ТТХ изменяет свой цвет на бордовый/малиновый, окрашивая микроколонии. Величину микобактериального роста, который располагается преимущественно на границе фаз, значительно легче оценить визуально при использовании ТТХ.

Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis с использованием двухфазной среды с ПФД осуществляется следующим образом.

Для приготовления двухфазной среды стерильный ПФД в количестве 2 мл помещался в пробирку, на него наслаивали 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом, формировалась двухфазная система, нижнюю фазу которой составлял более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон - обогащенная среда Школьниковой.

Готовили навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводили стерильной дистиллированной водой, раствор вносили в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствовала приведенной в таблице 1.

Таблица 1

Критические (низкие) концентрации препаратов (мкг/мл) в пробирках

Среда для определения ЛЧ	Противотуберкулезные препараты, содержащиеся в средах
	Стрептомицин	Изониазид	Рифампицин	Этамбутол
Школьниковой	0,8*	0,1*	1,0*	3,5*

В таблице 2 представлены все необходимые при постановке теста компоненты, которые вносились в 4 пробирки с противотуберкулезными препаратами и 1 пробирку для контроля роста.

Таблица 2

Определение лекарственной чувствительности M.tuberculosis с использованием двухфазной системы

Препарат	ПФД	Обогащенная среда Шк.	Р-р препарата	Дистил. вода	Микробная взвесь	ТТХ
Стрептомицин	2,0	2,0	0,1		0,2	0,1
Изониазид	2,0	2,0	0,1		0,2	0,1
Рифампицин	2,0	2,0	0,1		0,2	0,1
Этамбутол	2,0	2,0	0,1		0,2	0,1
Контроль роста (без препарата)	2,0	2,0		0,1	0,2	0,1

Объектом исследования служили три культуры микобактерий:

M.tuberculosis H37Rv, лабораторный штамм, чувствительный к

противотуберкулезным препаратам;

M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к изониазиду;

M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к стрептомицину,

изониазиду, рифампицину и этамбутолу.

Из каждой культуры готовили микробную взвесь в физиологическом растворе с 0,05% твина-80 по стандарту мутности ГИСК, соответствующему 5×10⁸ микробных тел/мл, затем взвесь разводили 1:10. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносили в каждую пробирку по 0,2 мл.

Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивали по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ, который добавляли по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубировались еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашивались в бордовый цвет. Культуру считали устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствовала интенсивности окраски в контроле.

Полученный результат определения лекарственной чувствительности сравнивался с референс-методами, которые регламентированы приказом МЗ РФ №109 от 2003 г.: на плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) и с помощью оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод.

На плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) удается обнаружить лекарственно устойчивые мутанты в культуре М. tuberculosis в течение 3-4 недель. Наиболее существенным недостатком этого метода является длительный срок исследования, значительно осложняющий своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения. Недостатком метода с применением оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод, является его высокая стоимость, поскольку требуется дорогое импортное оборудование и дорогие реактивы.

Пример 1 осуществления определения ЛЧ M.tuberculosis в жидкой двухфазной среде.

Для определения ЛЧ M.tuberculosis отбирали 30 изолятов M.tuberculosis, выделенных от больных с различными формами туберкулеза легких. Из них 16 культур M.tuberculosis были чувствительными, а 14 - устойчивыми к противотуберкулезным препаратам первого ряда.

Внесение противотуберкулезных препаратов: стрептомицина (S), изониазида (I), рифампицина (R) и этамбутола (Е), а также инокуляцию исследуемой культуры M.tuberculosis в двухфазную систему культивирования производили в соответствии со схемой, приведенной выше.

Результаты, полученные разработанным способом, сравнивали с данными определения ЛЧ, полученными классическим методом абсолютных концентраций на плотных средах Ливенштейна-Йенсена и методом с применением оборудования BBL MGIT AST, которые рассматривались в качестве референс-методов. Получено полное совпадение результатов чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Однако на плотных средах исследование заняло 28 дней, на жидких средах с применением оборудования BBL MGIT AST - 20 дней, а предлагаемым способом - всего 9 дней, при этом способ низкозатратен и удобен в исполнении.

Наиболее важным для лечения и прогноза заболевания является выявление мультирезистентности, то есть определение чувствительности M.tuberculosis к рифампицину и изониазиду.

Таким образом, предлагаемый способ, не требующий дорогостоящего оборудования и реактивов, сопоставим по результатам с традиционными методами и позволяет определить ЛЧ культур M.tuberculosis, что самое главное - к рифампицину и изониазиду, в течение 9 дней, что в несколько раз быстрее, чем другими методами, и позволяет осуществить своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.

1. Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезным препаратом, отличающийся тем, что посев осуществляют в двуслойную среду, нижний слой которой представляет собой перфтордекалин с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 М и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.%, а верхний слой - обогащенная среда Школьниковой при соотношении слоев 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток, и по степени метаболической активности определяют чувствительность или резистентность микобактерий к противотуберкулезному препарату.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что метаболическую активность определяют с помощью окрашивания микробных клеток растворов трифенил-тетразолия хлористого.