Способ определения активности щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей у пчел

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в подготовке мазков, их фиксации, промывке, заливке и инкубировании в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и красителя нейтрального прочного синего В, промывании, дополнительном окрашивании и оценке качественной окраски. Способ позволяет расширить технологические возможности и снизить трудоемкость. 5 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии у пчел.

В ветеринарии определение иммунитета у пчел является проблемой, для решения которой необходимо, в частности, определение щелочной фосфатазы в органах и тканях.

Известно определение щелочной фосфатазы в мазках крови и костного мозга человека [см. Kaplow (1955-1963) Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия. Лабораторные методы. Пер. с англ. Е.В.Самочатовой, под ред. проф. Н.С.Кисляк, М., "Медицина", 1983. стр. 143-144], где осуществляют подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием.

Также известно определение щелочной фосфатазы в тканях [Gomori (1952 г) З.Лойда, Р.Госсрай, Т.Шиблер, Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Пер. с англ. к.б.н. И.Б.Бухвалова, к. м. н. О.В.Копьева, под ред. проф. Н.Т. Райхлина, - М., Мир, 1982. стр. 12, 17, 142-143], где осуществляют подготовку мазков биологического субстрата, взятие, обработку, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилфосфата и нейтрального прочного синего В, промывание, дополнительное окрашивание прочным красным и оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске.

Недостатками данного метода является отсутствие возможности определения щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей пчел. Определение активности щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей имеет важное значение в диагностике иммунобиологической реактивности организма пчел в разные физиологические периоды. Снижение иммунитета влечет за собой нарушение гомеостаза организма и вытекающих из него последствий: снижение сохранности жизнеспособности как взрослых пчел, работоспособности, репродуктивной способности и т.д.

Техническим решением задачи является расширение технологических возможностей, снижение трудоемкости при изготовлении гистологических препаратов.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей пчел, включающем подготовку мазков биологического субстрата, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилфосфата и нейтрального прочного синего В, промывание, дополнительное окрашивание прочным красным и оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске, в качестве биологического субстрата используют гомогенат из органов и тканей пчел, а буферный раствор готовят из глицин-гидроксид натрия, для которого используют 25 мл 0,2 М раствор глицина (аминоуксусная кислота) - C₂H₅NO₂, и 4,4-6,0 мл 0,2М раствор NaOH (гидроксид натрия), для обеспечения рН 9,0-9,2.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что обеспечивается возможность определения активности щелочной фосфатазы в платоцитах, находящихся в гомогенате из органов и тканей у пчел, наиболее быстрым и точным, по сравнению с известным методом определения щелочной фосфатазы в гистологических препаратах у теплокровных животных, как с научной, так и с экономической стороны. Фермент поступает из тканей органов в форменные элементы гемолимфы и локализуется в цитоплазме платоцитов и в их мембране в виде гранул и во всей цитоплазматической жидкости.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены окрашенные гранулы по степеням: фиг.1 - 0-я - степень; фиг.2 - 1-я степень; фиг.3 – 2-я степень; фиг.4 - 3-я степень; фиг.5 - 4-я степень.

Пример конкретного осуществления способа определения активности щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей пчел

Подготовка мазков из гомогената органов и тканей и их фиксация

Для получения гомогената из органов и тканей (не обездвиженных эфиром пчел, чтобы активность фермента не снизилась) у пчел удаляли наружный покров глазными ножницами и пинцетом, затем удаляли кишечник. Ткани и органы, полученные от десяти пчел, помещали в стеклянный ручной гомогенизатор и добавили из расчета 1:1 забуференный буферной смесью - глицин-гидроксидом натрия (рН 9,0-9,2) физиологический раствор, затем осторожным движением тефлонового пестика вверх и вниз, чтобы не вылилось содержимое, гомогенизировали в течение 2-3 минут.

Из гомогената готовили мазок. Для этого каплю гомогената наносили на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживали между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45° подводили шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен гомогенатом. Движением правой руки от себя каплю распределяли тонким слоем по предметному стеклу. Хорошим мазком будет такой, в котором гомогенат располагается на поверхности стекла без просветов, в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края. Мазки с гомогенатом сушат на воздухе и фиксируют в парах 40% формалина в течение 3-5 минут. Для этого на дно эксикатора наливают около 150 мл формалина, оставляют под закрытой крышкой на 30 минут для возгонки паров формалина. Затем осторожно снимают крышку и на решетку эксикатора помещают мазки и закрывают крышкой. Таким образом, мазки фиксируются.

Приготовление буферного раствора

Вначале проводили калибровку иономера рН - 150. Для приготовления буферной смеси берут: 25 мл 0,2 М раствора глицина (аминоуксусная кислота) - С₂Н₅NО₂, в который добавляют 4,4-6,0 мл 0,2 М раствор NaOH, для обеспечения рН 9,0-9,2. Очень важно получить рН в пределах 9,0-9,2 для активации фермента - щелочной фосфатазы.

Приготовление забуференного физиологического раствора

Берут 0,9 г хлорида натрия, к которому добавляют 99,1 мл буферной смеси глицин-гидроксид натрия (рН 9,0-9,2) и хорошо перемешивают.

Приготовление 0,5% забуференного раствора нейтрального красного

Берут 0,5 г нейтрального красного, к которому добавляют 99,5 мл забуференный физиологический раствор (рН 9,0-9,2).

Приготовление буферно-инкубационной смеси

Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовить инкубационную смесь желательно в затемненной комнате. Для этого готовят растворы 1 и 2.

Приготовление раствора 1

Берут 2,4-2,5 мг α-нафтилфосфата натрия в количестве, которое постепенно растворяют в 2,5-3 мл буфере глицин-гидроксид натрия и 1,3 мл ацетона для полного растворения α-нафтилфосфата.

Приготовление раствора 2

Берут 4-5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 2,5-3 мл буфера глицин-гидроксид натрия (рН 9,0-9,2) и полученные растворы А и В смешивают, фильтруют в темноте через стеклянный фильтр.

Обработка мазков из гомогената буферно-инкубационной смесью

На фиксированные формалином мазки из гомогената органов и тканей наносят равномерным слоем инкубационная смесь и помещают во влажную камеру, которая готовится следующим образом: берут стерильную чашку Петри, на ее дно кладут хорошо смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, на нее помещают мазки из гомогената органов и тканей и закрывают крышкой чашки Петри. Такая влажная камера не дает возможности испарению инкубационной смеси, включающей в себя легколетучее вещество (α-нафтол) во время инкубации, а также позволяет строго соблюдать температурный режим (18-20°С) в термостате, т.к. фермент активен при заданной температуре и экономии инкубационной смеси.

Инкубацию проводят в темноте в течение 45 минут при температуре 18-20°С. промывают проточной водой 10 минут, ополаскивают дистиллированной водой несколько раз, высушивают, и ядра клеток платоцитов, находящихся в органах и тканях, докрашивают в красный цвет краской 0,5% нейтральным красным приготовленный на забуференном глицин-гидроксидом натрия (рН 9,0-9,2) физиологическом растворе в течение 0,5-1 минуты, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в коричневый цвет цитоплазмы цлатоцитов, мембраны клеток, окрашенных в cepo-голубой цвет, определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Микроскопия мазков

Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы при увеличении (90×15). Активность щелочной фосфатазы определяют по количеству окрашенных гранул и цитоплазмы платоцитов и их мембраны в коричневый цвет, ядра клеток которых докрашены в красный цвет нейтральным красным.

Визуально проводят оценку цитохимической реакции:

0-я степень - окрашено только ядро, цитоплазма ярко-желтого цвета, контуры мембраны слабо окрашены в серо-голубой цвет;

1-я степень - вся цитоплазма диффузно окрашена в желто-коричневый цвет, контуры мембраны окрашены в cepo-голубой цвет;

2-я степень - в цитоплазме видны хорошо окрашенные гранулы в коричневый цвет, окрашено более 1/4 цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в серо-голубой цвет;

3-я степень - всю цитоплазму занимают гранулы, окрашены в коричневый цвет, но ядро свободно 3/4 и более цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в серовато-синий цвет;

4-я степень - гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро, окрашены в коричневый цвет, контуры мембраны интенсивно окрашены в синий цвет.

Средний цитохимический индекс выводят по следующей формуле

предварительно подсчитывая 100 платоцитов:

где а, б, в, г, д - количество клеток платоцитов соответственно 0,1,2,3,4-й степени.

Пример расчета среднего цитохимического индекса активности щелочной фосфатазы у пчел Приокской породы:

При расчете данного примера неактивных платоцитов, т.е. нулевых (0), было подсчитано в гомогенате в количестве 52 клеток, первой степени 14 клеток, второй степени 7 клеток, третьей степени 14 клеток, четвертой степени 13 клеток. Таким образом, средний цитохимический индекс активности щелочной фосфатазы составил 1,22.

Таблица 1 Активность щелочной фосфатазы в гомогенате из тканей и органов у пчел(М±m; n=10)
Породы пчел	Средний цитохимический индекс
Итало-карпатская помесь первого поколения	1,09±0,06
Карпатская порода	1,19±0,09
Приокская	1,22±0,02
Серая горная кавказская	1,28±0,08

Данная методика позволяет экспресс-методом определить микробицидные свойства организма пчел, в частности определить активность щелочной фосфатазы в платоцитах, находящихся в гомогенате из органов и тканей. В платоцитах, находящихся в органах и тканях, содержится больше щелочной фосфатазы, чем в платоцитах, находящихся в сосудах. Определение активности щелочной фосфатазы в гомогенате является одним из важных тестов диагностики иммунитета организма пчел. Высокие показатели среднего цитохимического индекса активности щелочной фосфатазы в органах и тканях указывает на состояние иммунного статуса и общее клиническое состояние организма пчел. Чем выше показатели среднего цитохимического индекса щелочной фосфатазы, тем выше ее активность, что указывает высокий уровень иммунного статуса организма пчел. При снижении активности щелочной фосфатазы, т.е. отсутствии или незначительного количества 3 и 4 степени активности платоцитов, снижается иммунный статус организма, что способствует развитию или предрасположенности к различным заболеваниям и тем самым снижается жизнеспособность пчел.

Способ определения активности щелочной фосфатазы в гомогенате из органов и тканей пчел, включающий подготовку мазков биологического субстрата, фиксацию, промывку, заливку и их инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилофосфата и красителя нейтрального прочного синего В, при этом буферный раствор готовят из глицин-гидроксид натрия, для которого используют 25 мл 0,2 М раствора глицина и 4,4-6,0 мл 0,2 М раствора гидроксид натрия для обеспечения рН 9,0-9,2, затем осуществляют промывание, дополнительное окрашивание краской нейтральной красной и оценку качественной окраски на щелочную фосфатазу по окраске.