Способ приготовления маркера для прижизненной индикации малых доз радионуклида в организме
Владельцы патента RU 2256915:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия Министерства Здравоохранения Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности радиобиологии, и может быть использовано для определения в крови цезия нуклида при воздействии на организм малых доз радиации. Сущность изобретения: нативные эритроциты барана последовательно обрабатывают глютаровым альдегидом, затем альбумином сыворотки крови человека, и, наконец, 1% раствором цезия хлорида. Полученный по заявляемому способу маркер специфичен и позволяет выявлять наличие цезия нуклида в организме облученных малыми дозами и через длительный срок после облучения. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности в радиобиологии, и может быть использовано для определения в крови цезия нуклида при воздействии на организм малых доз радиации, независимо от времени воздействия.
Известен способ выявления острого радиоактивного заражения организма (патент №2104544, 10/II - 1998 г.) в эксперименте, в котором описан способ приготовления маркера для прижизненной индикации радионуклида (стронция) в организме. Способ заключается в обработке эритроцитов барана глютаровым альдегидом и стронция хлоридом.
Недостатки: малая чувствительность способа.
Изобретение направлено на решение задачи: создание наиболее чувствительного маркера для определения в крови цезия нуклида при воздействии на организм малых доз радиации.
Для индикации нуклида в организме разработан альбумин-цезиевый маркер, позволяющий выявлять на лимфоцитах крови облученных людей повышенное количество цезиевых рецепторов с образованием морфологических структур - “розеток” (РОК). Принцип приготовления маркера заключается в обработке нативных эритроцитов барана 0,25% глютаровым альдегидом, в результате которой эритроциты и глютаровый альдегид ковалентно связываются друг с другом через свои аминогруппы (NH2), через вторую аминогруппу с альдегидом прочно связывается 0,2% альбумин, полученный из сыворотки человеческой крови. При обработке 0,1% раствором цезия хлорида альбумин взаимодействует с цезием, повышая чувствительность маркера.
Способ осуществляют следующим образом: на торсионных весах взвешивают 1 мг хлорида цезия, к этой навеске добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. На торсионных весах взвешивают 2 мг сухого альбумина, полученного из человеческой сыворотки крови. Данную навеску растворяют в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Обработку эритроцитов барана глютаровым альдегидом производят, соединяя 0,5 мл 5% взвеси тщательно отмытых свежих эритроцитов с 0,25%-ным свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1. Смесь выдерживают в термостате при температуре +37°С в течение 15 минут, после чего эритроциты тщательно дважды отмывают от альдегида забуференным изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,2), каждый раз сливая надосадочную жидкость и доводят этим же раствором до первоначального объема (5% взвесь). К 0,1 мл суспензии глютаровых эритроцитов добавляют 1 мл забуференного физиологического раствора рН 6,4 и центрифугируют 5 минут при 1500 оборотов в минуту. Отмывают таким образом 2 раза, каждый раз сливают надосадочную жидкость перед тем, как добавить вновь 1 мл забуференного физиологического раствора рН 6,4. К полученному осадку глютаровых эритроцитов добавляют 0,1 мл заранее приготовленного 0,2% раствора человеческого альбумина.
Ресуспензируют полученную смесь и помещают в термостат на 30 минут при температуре +37°С, периодически встряхивают каждые 5-10 минут. Достают из термостата смесь через 30 минут, центрифугируют 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Оттягивают надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 1 мл забуференного раствора натрия хлорида рН 7,2. Перемешивают полученную смесь путем встряхивания, центрифугируют 5 минут при 1000 оборотов в минуту, сливают надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 0,1 мл 0,1% раствора цезия хлорида. Перемешивают полученную смесь путем встряхивания и помещают в термостат на 30 минут при температуре +37°С, встряхивая периодически каждые 5-10 минут. Через 30 минут полученную смесь достают из термостата, центрифугируют 5 минут при 1000 оборотов в минуту, стягивают надосадочную жидкость. Добавляют к полученному осадку 1 мл забуференного физраствора (рН 7,2), центрифугируют полученную смесь 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Стягивают надосадочную жидкость. Полученный осадок осторожно пипетируют и добавляют к нему 0,5 мл среды 199. Альбумин-цезиевый маркер готов для постановки иммунной реакции с целью индикации цезия в организме.
С применением полученного маркера были обследованы на предмет наличия цезиевых РОК в организме 10 необлученных людей и 10 участников ликвидации последствий аварии (УЛПА) на Чернобыльской АЭС (ЧАЭС). Результаты представлены в таблице 1.
Они указывают, что в крови УЛПА на ЧАЭС выявлено в 3 раза больше цезий-чувствительных лимфоцитов, даже через 16 лет после облучения в зоне аварии на ЧАЭС. Этот показатель свидетельствует о наличии повышенного (по сравнению с контрольной группой людей) содержания цезия в организме у УЛПА.
Для доказательства большей чувствительности маркера с использованием в его структуре дополнительного спейсера - альбумина проведены исследования у одних и тех же обследованных людей с исключением из структуры маркера альбумина (эритроциты, глютар, цезий) и с маркером полной структуры (эритроциты, глютар, альбумин, цезий), результаты которых представлены в таблицах 2 и 3.
Пример 1.
У УЛПА У-ва 1945 г.р., находившегося в зоне аварии на ЧАЭС с 14.07 по 26.08.1986 г. (42 дня), полученная доза радиации по документам составила 23 сГр.
Взяли 5 мл венозной крови в пробирку с гепарином спустя 16 лет по возвращении из зоны аварии, развели средой 199 1:1, выделили лимфоциты в градиенте плотности фиколл-верографина. Для реакции иммунного розеткообразования использовали концентрацию клеток, равную 4×106 в 1 мл среды 199. Вносили 0,1 мл клеток в пробирку, добавляли 0,1 мл альбумин-цезиевого маркера, осторожно встряхивали. Полученную суспензию ставили в термостат на 15 минут при температуре +37°С. Доставали из термостата пробирку и помещали на 60 минут в холодильник при температуре +4°С. Через один час пробирку с суспензией клеток доставали и центрифугировали 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Стягивали пипеткой надосадочную жидкость из пробирки, осадок осторожно пипетировали. Затем в пробирку с осадком добавляли 1 каплю 0,5% раствора глютарового альдегида (разводили физраствором). Полученную суспензию выдерживали при комнатной температуре 20 минут. Затем в пробирку добавляли 0,75 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Стягивали микропипеткой надосадочную жидкость, добавляли в пробирку с осадком 0,5 мл раствора бычьей сыворотки. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 1500 оборотов в минуту. Стягивали надосадочную жидкость, осадок пипетировали. Каплю полученного осадка переносили на предметное стекло при помощи пастеровской пипетки и делали мазок, высушивали его на воздухе, фиксировали этаноловым спиртом в течение 30 минут и окрашивали в течение 3-5 минут по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них количество лимфоцитов, фиксировавших на своей мембране три и более бараньих эритроцита.
Заключение: в результате проведенного исследования в крови У-ва обнаружено 23% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных цезию хлориду, что подтверждает наличие цезия нуклида в организме У-ва.
Пример 2.
Взяли 5 мл крови в пробирку с гепарином у УЛПА Сп-ва, 1962 г.р., находившегося в зоне аварии на ЧАЭС с 12.11. по 20.12.1986 г. (38 дней). Получили лейкоцитарную взвесь, отработали ее описанным образом. Затем соединили с заявленным альбумин-цезиевым маркером и проделали все последующие этапы исследования.
Заключение: в результате проведенного исследования в крови УЛПА обнаружено 21% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных цезию хлориду, что подтверждает наличие цезия нуклида в организме Сп-ва.
Пример 3.
Взяли 5 мл венозной крови в пробирку с гепарином у необлученного человека. Развели средой 199 1:1, выделили лимфоциты в градиенте плотности фиколл-верографина. Для реакции иммунного розеткообразования использовали концентрацию клеток, равную 4×106 в 1 мл среды 199. Вносили 0,1 мл клеток в пробирку, добавляли 0,1 мл альбумин-цезиевого маркера, осторожно встряхивали. Полученную суспензию ставили в термостат на 15 минут при температуре +37°С. Доставали из термостата пробирку и помещали на 60 минут в холодильник при температуре +4°С. Через один час пробирку с суспензией клеток доставали и центрифугировали 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Стягивали пипеткой надосадочную жидкость из пробирки, осадок осторожно пипетировали. Затем в пробирку с осадком добавляли одну каплю 0,5% раствора глютарового альдегида (разведенного физраствором). Полученную суспензию выдерживали при комнатной температуре 20 минут. Затем в пробирку добавляли 0,75 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 1000 оборотов в минуту. Стягивали микропипеткой надосадочную жидкость, добавляли в пробирку с осадком 0,5 мл раствора бычьей сыворотки. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 1500 оборотов в минуту. Стягивали надосадочную жидкость, осадок пипетировали. Каплю полученного осадка переносили на предметное стекло при помощи пастеровской пипетки и делали мазок, высушивали его на воздухе, фиксировали этаноловым спиртом в течение 30 минут и окрашивали в течение 3-5 минут по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них количество лимфоцитов, фиксировавших на своей мембране три и более бараньих эритроцита.
Заключение: в результате проведенного исследования в крови необлученного Л-ва обнаружено 6% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных цезия хлориду, что говорит об отсутствии повышенного содержания цезия нуклида в организме Л-ва по сравнению с облученными людьми.
| Таблица 1. Число цезиевых РОК (%) в крови необлученных и облученных людей с применением заявленного маркера. | |||
| Количество цезиевых РОК в крови | |||
| Необлученных людей (контроль) | Участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС | ||
| Обследованные | Количество РОК | Обследованные | Количество РОК |
| 1. M-в | 8 | 1. C-в | 21 |
| 2. Ан-в | 9 | 2. Б-в | 22 |
| 3. Ж-в | 7 | 3. Ус-в | 23 |
| 4. Ч-в | 8 | 4. А-в | 24 |
| 5. К-в | 6 | 5. Ф-в | 21 |
| 6. Ш-в | 6 | 6. П-в | 17 |
| 7. С-в | 7 | 7. К-н | 21 |
| 8. Ач-в | 5 | 8. К-р | 23 |
| 9. Л-в | 6 | 9. Б-х | 19 |
| 10. Ле-в | 9 | 10. Сп-в | 21 |
| М±m | 7,1±0,6 | 21,2±0,8 | |
| p | 0,001 |
| Таблица 2. Число цезиевых РОК (%) в крови необлученных людей с применением в реакции различных маркеров. | |||
| № | Необлученные люди (контроль) | Структура маркеров | |
| Эритроциты, глютар, цезий | Эритроциты, глютар, альбумин, цезий | ||
| 1. | М-в | 6 | 8 |
| 2. | Ан-в | 3 | 9 |
| 3. | Ж-в | 3 | 7 |
| 4. | Ч-в | 4 | 8 |
| 5. | К-в | 2 | 6 |
| 6. | Ш-в | 4 | 6 |
| 7. | С-в | 5 | 7 |
| 8. | Аг-в | 3 | 5 |
| 9. | Л-в | 4 | 6 |
| 10 | Ле-в | 4 | 9 |
| М±m | 3,8±0,6 | 7,1±0,6 | |
| p | <0,001 |
| Таблица 3. Число цезиевых РОК (%) в крови УЛПА с применением в реакции различных маркеров. | |||
| № | Обследованные УЛПА | Структура маркеров | |
| Эритроциты, глютар, цезий | Эритроциты, глютар, альбумин, цезий | ||
| 1. | С-в | 11 | 21 |
| 2. | Б-в | 10 | 22 |
| 3. | У-в | 11 | 23 |
| 4. | А-в | 12 | 24 |
| 5. | Ф-в | 10 | 21 |
| 6. | П-в | 9 | 17 |
| 7. | К-н | 11 | 21 |
| 8. | К-р | 9 | 23 |
| 9. | Б-х | 9 | 19 |
| 10. | Сп-в | 12 | 21 |
| М±m | 10,4±0,5 | 21,2±0,8 | |
| p | <0,001 |
Из таблиц видно, что включение в структуру маркера человеческого альбумина повышает его чувствительность, что проявляется выявлением в крови большего числа (р<0,001) лимфоцитов, чувствительных к цезию, как у необлученных, так и облученных людей.
Способ позволяет выявлять радионуклид в организме людей, облученных малыми дозами и констатировать через длительный срок факт облучения. Заявленный маркер значительно чувствительнее прототипа, специфичен, дает возможность выявлять наличие цезия нуклида в организме облученных малыми дозами и через длительный срок после облучения. Может применяться в любой клинической лаборатории, не требует специального оборудования, безопасен, т.к. в исследованиях применяется стабильный цезий.
Способ приготовления маркера для прижизненной индикации малых доз радионуклида в организме с помощью последовательной обработки эритроцитов барана глютаровым альдегидом и аналогом радионуклида с последующей инкубацией и отмыванием суспензии эритроцитов, отличающийся тем, что к глютаровому альдегиду добавляют 0,2%-ный раствор альбумина сыворотки крови человека, смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин, центрифугируют, добавляют раствор хлорида натрия с рН 7,2, перемешивают, центрифугируют с последующим добавлением 0,1%-ного раствора цезия хлорида.
