Способ получения биологически активного вещества для регуляции энергетического баланса

Изобретение относится к получению биологически активных веществ белковой природы из злаковых растений. Способ получения биологически активного вещества для регуляции энергетического баланса организма, включающий использование проростков злаков и получение экстракта, причем из проростков выделяют стрессовый разобщающий белок БХШ 310 и/или белок, иммуннохимически родственный ему в виде грубо- и/или высокоочищенного экстракта целевого продукта, для этого разрушают клеточные стенки 3-7 суточных проростков гомогенизированием и выделяют бесклеточный экстракт центрифугированием, к которому на первой стадии воздействия добавляют реагент-осадитель при определенных условиях для образования осадка с последующим выделением жидкой фазы, которую подвергают второй стадии воздействия реагентом-осадителем при определенных условиях, затем осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием, а получаемый грубоочищенный экстракт целевого продукта отделяют от реагента-осадителя диализом, подвергая его при необходимости тонкой очистке гель-фильтрацией, при этом выделение экстракта целевого продукта проводят при определенном температурном режиме, при необходимости экстракт целевого продукта высушивают лиофильно. Биологически активное вещество способствует эффективной регуляции энергетического баланса организма. 8 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ белковой природы из растений и применению их дляфегуляции энергетического метаболизма живых организмов.

Известны способы извлечения действующих веществ из растений, обладающих противогипоксической и антиоксидантной активностью, путем приготовления из них препаратов в виде настоев, отваров, соков и настоек. Известен способ укрепления иммунной системы и регулирования обмена веществ путем приема этих препаратов [Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е. Растения- антигипоксанты (фитотерапия) / С.-Петербургский химико-фармацевтический институт. - С.Пб., 1991. - 96 с.] [1].

Недостатком известного способа является присутствие в получаемом препарате попутно извлекаемых веществ, которые могут препятствовать необходимому активному действию нужного компонента.

Известен способ выделения экстракта из листа розмарина, обладающего свойствами природного антиоксиданта, для его применения в косметической дерматологии [Biochemical studies of natural antioxidant isolated from rosemary and its application in cosmetic dermatology / Calabrese V. et.al.// Int. J. Tissue React. - 2000. - V. 22. - N 1. - 5-15.] [2].

Известен способ получения действующего вещества в виде экстракта проростков пшеницы и других растений и возможность использования его в качестве ингредиента в косметических препаратах [Effect of germinated seeds extract on the respiratory activity of human skin fibroblasts and sheep liver mitochondria. Influence on cell viability and proliferation and their usefulness as active cosmetic ingredient / Benaiges A., Armengol R. et.al. // International Journal of Cosmetic Science. - 2001. - V.23. - P.243-255.] [3].

Известные способы применения экстрактивных веществ антиоксидантного действия ограничены одним направлением и решают узкоспецифическую задачу в области косметической дерматологии.

Неблагоприятные экологические и климатические условия, недостаточно качественное и несбалансированное питание вызывают ослабление защитных сил организма, быстрое развитие различных патологических изменений в организме, нарушение нормальных физиологических процессов. Достигнуть увеличения переносимости организмом неблагоприятных факторов, устранить снижение функциональной активности организма в существующих условиях является сложной задачей. На ее решение направлено создание биологически активных веществ, содержащих, как правило, витамины, микроэлементы, комплексы аминокислот, флавоноиды и другие вещества низкомолекулярной природы. Известные биологически активные вещества позволяют в той или иной степени скорректировать физиологические процессы, повысить защитные силы организма к действию неблагоприятных факторов, но они требуют длительного применения и во многих случаях бывают неэффективными.

В настоящее время практически отсутствуют препараты для выведения из угнетенного состояния растений, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов, таких как кратковременное снижение температуры во время вегетационного периода, отсутствие или недостаточное поступление влаги для питания растений и др.

Задачей изобретения является получение активного вещества качественно нового уровня, эффективно влияющего на восстановление функционирования компенсаторных механизмов с целью обеспечения нормального течения энергетических процессов в организме в экстремальных условиях.

Техническим результатом изобретения является выделение вещества в количествах, достаточных для использования его в качестве действующего вещества, влияющего на динамику энергетических процессов, снижающего повреждения, вызываемые окислительным стрессом в организме, и для восстановительной регуляции необходимых жизненных процессов организма.

Технический результат обеспечивает выделение из растений стрессового разобщающего белка БХШ 310 и/или иммуннохимически родственного ему белка и его применение.

Стрессовый разобщающий белок БХШ 310 или иммуннохимически родственные ему белки выделяют из проростков злаковых культур в виде грубо- и/или высокоочищенного экстракта целевого продукта.

Целевой продукт в виде белка БХШ 310 и/или иммуннохимически родственного ему белка получают, разрушая клеточные стенки 3-7 суточных проростков, с последующим разделением сред и выделением бесклеточного экстракта. Выделение целевого продукта ведут с использованием реагента-осадителя в две стадии. К бесклеточному экстракту на первой стадии воздействия добавляют реагент-осадитель для образования осадка с последующим выделением жидкой фазы. Выделенную жидкую фазу подвергают второй стадии воздействия реагентом-осадителем. Образовавшийся осадок отделяют от жидкой фазы и затем от реагента-осадителя, получая грубоочищенный экстракт целевого продукта.

Выделение экстракта целевого продукта проводят при температурном режиме от 0 до +4°С.

Высокоочищенный экстракт стрессового белка получают, подвергая тонкой очистке грубоочищенный экстракт целевого продукта.

Получаемый целевой продукт при необходимости высушивают.

Разрушение клеточных стенок проростков осуществляют, в частности, гомогенизированием.

Реагент-осадитель на первой стадии воздействия добавляют к бесклеточному экстракту до концентрации его 30%, с выдерживанием в течение 6-18 часов.

Реагент-осадитель во второй стадии воздействия добавляют к выделенной жидкой фазе до концентрации его (в растворе), равной 50%, с выдерживанием в течение 4-24 часов.

Разделение сред и выделение бесклеточного экстракта после разрушения клеточных стенок проростков и дальнейшее отделение жидкой фазы от осадка осуществляют центрифугированием при 10000 g и выше.

Грубоочищенный экстракт целевого продукта отделяют от реагента-осадителя. Отделение целевого продукта от реагента-осадителя осуществляют диализом.

Тонкую очистку экстракта целевого продукта для получения высокоочищенного экстракта проводят при помощи гель-фильтрации на колонке с сефадексом марок G-100 - G-200.

В качестве реагента-осадителя применяют сульфат аммония.

Сушку целевого продукта осуществляют лиофильно.

Получаемый в результате грубоочищенный и/или высокоочищенный экстракт стрессового белка БХШ 310 и/или иммунохимически родственного ему белка используют для регуляции энергетического баланса организма.

Впервые стрессовый белок БХШ 310 выделен из проростков озимой ржи.

Выделенный белок имеет молекулярную массу около 310 кД и состоит из двух типов субъединиц с молекулярной массой 66 и 56 кД. [Колесниченко А.В. и др. Характеристика белка из озимой ржи, накапливающегося при гипотермии // Физиология растений. - 1996. - Т.43. - №6 - С.894-899] [4].

Высокоочищенный экстракт стрессового белка обладает более высокой степенью активности. Инфильтрация ткани организма формой на основе высокоочищенного стрессового белка вызывает значительное увеличение скорости потребления кислорода тканью, увеличение скорости потребления субстрата окисления и термогенез, значительное снижение уровня перекисного окисления биологических макромолекул.

Получаемый в результате осуществления изобретения целевой продукт обладает сильно выраженной антиоксидантной активностью и может быть использован для снижения повреждений, вызываемых окислительным стрессом, посредством активной регуляции степени сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях при проникновении в ткань организма.

Целевой продукт в виде грубоочищенного или высокоочищенного экстракта белка применяют в виде порошка, различного вида растворов, эмульсии, гранул, суспензии, взвеси, мази, с пищевым и/или с фармакологически обоснованным наполнителем, а также в качестве составной части комплексного препарата.

Комплексный препарат может содержать целевой продукт в различных процентных соотношениях в зависимости от вида лекарственной, пищевой, косметологической, агрохимической и других форм применения препарата.

Препарат на основе стрессового разобщающего растительного белка БХШ 310 или на основе иммуннохимически родственных ему белков вызывает в ткани регулируемое разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях. В результате восстанавливается и улучшается энергетический баланс клетки, организм приобретает устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов.

При воздействии препарата происходит усиление дыхания клеток ткани, не связанное с фосфорилированием, и как следствие уменьшение образования активных форм кислорода в митохондриях, снижение уровня перекисного окисления биологических макромолекул.

Препараты хорошо проникают внутрь ткани через клеточные стенки и не оказывают токсичного действия даже при концентрации 10 мг/мл.

На основе высокоочищенного и/или грубоочищенного экстракта стрессового белка возможно создание качественно новой линии действующих форм, в том числе пищевых, лекарственных, косметических, агрохимических и др. Их действие обусловлено избирательным влиянием получаемого биологически активного вещества на энергетические процессы в клетке. Они оказывают положительный эффект при стрессовых состояниях организма человека, животного, растения и не вызывают нежелательных побочных действий.

На основе изобретения можно получать препараты с различной степенью воздействия на живые организмы для выведения их из стрессового состояния.

Изобретение дает возможность получать биологически активные вещества различной степени воздействия для регуляции энергетического обмена организма при нарушении обмена веществ.

Способ получения биологически активного вещества осуществляют следующим образом.

Пример 1

Для получения экстракта стрессового белка БХШ 310 трехсуточные проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) гомогенизируют для разрушения клеточных стенок и затем центрифугируют при скорости 10000 g, получая бесклеточный экстракт проростков. Вначале осуществляют первую стадию воздействия реагентом-осадителем с целью фракционирования экстракта проростков. Для этого к полученному экстракту добавляют реагент-осадитель в виде, например, сульфата аммония, доводя концентрацию раствора до 30% насыщения. После 6-часового выдерживания образовавшийся осадок разделяют на центрифуге при 10000 g с выделением жидкой фазы - супернатанта. Во второй стадии воздействия к супернатанту добавляют сульфат аммония до достижения концентрации его в растворе, равной 50%. После выдерживания в течение 12 часов образовавшуюся субстанцию центрифугируют, получая в осадке грубоочищенный экстракт стрессового белка БХШ 310. Полученный экстракт отделяют от реагента-осадителя диализом. Все технологические операции от разрушения клеточных стенок проростков до выделения целевого продукта в виде грубоочищенного экстракта стрессового белка проводят при температурном режиме от 0 до +4°С.

Пример 2

Выделение целевого продукта в виде грубоочищенного экстракта стрессового разобщающего белка БХШ 310 проводят следующим образом. Пятисуточные проростки ржи растирают до получения однородной массы для разрушения клеточных стенок. Жидкий экстракт отделяют от клеточных оболочек при помощи центрифуги.

Вначале к полученному экстракту проростков добавляют реагент-осадитель в виде сульфата аммония, обеспечивая при этом концентрацию реагента-осадителя в экстракте проростков, равной 30%. Реакцию осаждения на первой стадии воздействия ведут 18 часов. Осадок отделяют на центрифуге таким образом, как описано в примере 1. К отделенной жидкой фазе снова добавляют реагент-осадитель, доводя концентрацию его в растворе до 50%. Затем производят выдерживание в течение 24 часов.

Увеличение времени выдерживания более 24 часов не рационально, так как не обеспечивает большего осаждения целевого продукта.

Далее получают грубоочищенный экстракт целевого продукта как в примере 1. Полученный экстракт лиофильно высушивают.

Пример 3

Целевой продукт получают способом, описанным в примере 1, используя для этого трехсуточные проростки озимой ржи (Secale cereale L.). При проведении первой стадии осаждения, при добавлении реагента-осадителя в виде сульфата аммония к бесклеточному экстракту проростков реакцию осаждения ведут 12 часов при концентрации реагента-осадителя, равной 30%. На второй стадии введения реагента-осадителя к получаемому супернатанту в концентрации, равной 50%, реакцию осаждения ведут в течение 15 часов.

Полученный грубоочищенный экстракт подвергают тонкой очистке при помощи гель-фильтрации на колонке с сефадексом марки G-200, выделяя высокоочищенный экстракт целевого продукта в виде иммунохимически чистого стрессового разобщающего белка БХШ 310 или иммунохимически родственного ему белка.

Авторами проведен ряд исследований по изучению влияния стрессового разобщающего белка БХШ 310 на перекисное окисление липидов и дыхательную активность митохондрий растений.

Исследованиями отмечено, что применение выделенного целевого продукта в виде водного раствора для обработки проростков злаков увеличивает холодостойкость растений.

Например, выдерживание в водном растворе белка проростков злаковых увеличивает количество стрессового белка БХШ 310 в тканях проростков. Скорость потребления кислорода возрастает до 533,39 нмоль O₂/(мин г ткани), что на 40% больше по сравнению с инфильтрацией их водой (391,61 нмоль О₂/(мин г сырой ткани). Разница температуры живых и убитых проростков при их охлаждении составляла 2°С. После инфильтрации этих проростков полученным активным веществом эта величина возрастает и составляет 2,5°С.

Во время низкотемпературного стресса инфильтрация ткани препаратом приводит к снижению уровня перекисного окисления липидов, т.е. проявляется выраженная антиоксидантная активность белкового препарата [J. Immunoassay Immunochem. - 2003. - V.24. - N 1. - Р.41-55.] [5].

Выживаемость предварительно инфильтрованных проростков злаков после воздействия холода увеличивается на 20%.

В результате воздействия получаемого целевого продукта повышается сегрегационная функция клетки, т.е. ее способность защищаться от разрушающего воздействия враждебных факторов.

Получаемый в результате осуществления способа целевой продукт может быть широко использован в медицинской практике для профилактики и лечения нарушений обмена веществ.

Предлагаемое изобретение открывает возможность создания нового класса избирательно действующих активных веществ качественно иного уровня. Получаемый в результате осуществления изобретения целевой продукт может быть широко использован в различных областях, связанных с обеспечением оптимальной работы жизненно важных функций живых организмов в неблагоприятных условиях.

Способ обеспечивает выделение вещества в количествах, достаточных для использования его в качестве основы для создания новой линии веществ, влияющих на динамику энергетических процессов, для восстановительной регуляции необходимых жизненных процессов организма.

Источники информации

1. Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е. Растения - антигипоксанты (фитотерапия) / С.-Петербургский химико-фармацевтический институт. - СПб., 1991. - 96 с.

2. Biochemical studies of natural antioxidant isolated from rosemary and its application in cosmetic dermatology / Calabrese V. et. al.// Int. J. Tissue React. - 2000. - V.22. - N 1. - 5-15.

3. Effect of germinated seeds extract on the respiratory activity of human skin fibroblasts and sheep liver mitochondria. Influence on cell viability and proliferation and their usefulness as active cosmetic ingredient / Benaiges A., Armengol R. etc. // International Journal of Cosmetic Science. - 2001. - V.23. - P.243-255.

4. Колесниченко А.В. и др. Характеристика белка из озимой ржи, накапливающегося при гипотермии // Физиология растений. - 1996. - Т.43. - №6. - С.894-899.

5. Influence of stress protein CSP 310 and antiserum against this protein on oxygen uptake, lipid peroxidation and temperature of winter wheat seedling shoots during cold stress/ Kolesnichenko A.V., Grabelnych O.I., Tourchaninova V.V., Zykova V.V., Koroleva N.A., Pobezhimova T.P., Voinikov V.K. //J. Immunoassay Immunochem. - 2003. - V.24. - N 1. - P.41-55.

1. Способ получения биологически активного вещества для регуляции энергетического баланса организма, включающий использование проростков злаков и получение экстракта, отличающийся тем, что из проростков выделяют стрессовый разобщающий белок БХШ 310 и/или белок, иммуннохимически родственный ему в виде грубо и/или высокоочищенного экстракта целевого продукта, для этого разрушают клеточные стенки 3-7 суточных проростков и выделяют бесклеточный экстракт, к которому на первой стадии воздействия добавляют реагент-осадитель для образования осадка с последующим выделением жидкой фазы, которую подвергают второй стадии воздействия реагентом-осадителем, затем осадок отделяют от жидкой фазы, а получаемый грубоочищенный экстракт целевого продукта отделяют от реагента-осадителя, подвергая его при необходимости тонкой очистке, при этом выделение экстракта целевого продукта проводят при температурном режиме от 0 до +4°С, при необходимости экстракт целевого продукта высушивают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточные стенки разрушают гомогенизированием.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реагент-осадитель на первой стадии воздействия добавляют к бесклеточному экстракту до концентрации его 30%, с выдерживанием в течение 6-18 ч.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реагент-осадитель во второй стадии воздействия добавляют к выделенной жидкой фазе до концентрации его в растворе, равной 50%, с выдерживанием в течение 4-24 ч.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве реагента-осадителя используют сульфат аммония.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделение бесклеточного экстракта после разрушения клеточных стенок проростков и дальнейшее отделение жидкой фазы от осадка осуществляют центрифугированием при 10000g и выше.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что грубоочищенный экстракт целевого продукта отделяют от реагента-осадителя диализом.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что тонкую очистку экстракта целевого продукта проводят при помощи гель-фильтрации на колонке с сефадексом марок G-100 - G-200.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракт целевого продукта высушивают лиофильно.