Белок, обладающий свойством аспартатной внутримембранной протеазы, способ его получения

Изобретение относится к биологии, научно-практической фармакологии, биохимии и касается выделенного фрагмента ДНК с указанной последовательностью нуклеотидов, кодирующего белок, обладающий свойством внутримембранной эндопротеазы (IMPAS), а также способа получения указанного белка. Изобретение обеспечивает возможность разработки препаратов для диагностики болезней, связанных с протеолизом внутриклеточных рецепторов, а также позволяет расширить арсенал средств, полезных при лечении различных неврологических, сердечно-сосудистых и других заболеваний, связанных с нарушенным протеолизом белков. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, научно-практической фармакологии и биохимии и касается новых препаратов, полезных при нарушении эндопротеолиза белков. Эндопротеолиз белков - универсальный механизм, вовлеченный во многие клеточные процессы, наследственные болезни, клеточную смерть (некроз и апоптоз), регенерационные процессы и ответ клеток и организма на инфекции, онкологическую трансформацию клеток, нейродегенерацию и стрессовые факторы. Недавно были обнаружены два неизвестных ранее гомологичных гена: пресенилин 1 и пресенилин 2 (PS1 и PS2) (Sherrington and Rogaev et al., Nature, 1995; Rogaev et al., Nature, 1995; Rogaev et al., Genomics, 1997), - кодирующие белки с множественными трансмембранными доменами, мутации в которых ведут к развитию ранней семейной формы Болезни Альцгеймера, абнормальному протеолизу АРР-белка (предшественника β-амилоида), накоплению в мозге больных нерастворимых комплексов амилоидных бляшек. Мутации в генах PS1 и PS2 усиливали эндопротеолиз (γ-секретазную активность) в трансмембранном домене АРР (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Lemere et al., 1996; Citron et al., 1997). Был сделан первый шаг в обнаружении генов, кодирующих аминокислотную последовательность, сходную с пресенилинами, без определения их функций (Grigorenko et al., 2002). Отсутствие каких-либо гомологий PS1 и PS2 с известными протеазами или сайтами протеаз, беспрецедентный характер возможного процесса эндопротеолиза внутри мембран (не описанный у эукариот), не позволяли сделать однозначный вывод о том, являются ли пресенилины γ-секретазами с внутримембранной эндопротеазной активностью, или данные белки с множественными трансмембранными доменами являются кофакторами, необходимыми для эндопротеолиза. Дальнейшее обнаружение IMPAS (IMP) генов, кодирующих IMPAS (IMP) белки со сходной пресенилинам структурой и также обладающих внутримембранной (т.е. сайт протеолиза располагается внутри гидрофобного домена предсказанной локализации в мембранных структурах клетки субстрата) протеолитической активностью, позволяет выделить особый класс аспартатных внутримембранных эндопротеаз и изучить универсальные молекулярно-генетические механизмы внутримембранного протеолиза у млекопитающих и других эукариот.

Следующие свойства определяют сходные последовательности аспартатных трансмембранных белков различных семейств (пресенилинов, IMPAS и препилиновых пептидаз IV типа):

1) трансмембранная структурная организация (т.е. наличие множественных гидрофобных, пронизывающих мембрану доменов);

2) наличие эволюционно-консервативных аспартатных остатков внутри мембранных доменов;

3) наличие по меньшей мере трех консервативных функционально-критичных сайта, которые нами определены как:

а) D - GxGD - PxL (широкое определение для аспартатных внутримембранных белков различных семейств);

б) ^Y/_FD^v/_I F ^W/_F V FX3 - 6LG ^I/_F GD^I/_V 66 P GxxxxxxxR ^Y/_F D - Q P A L L Y LV (узкое определение для IMPAS белков человека (hIMP1- hIМР5), обладающих 10-92% гомологией по полной последовательности белка),

где х - любая аминокислота, - - аминокислотный участок между сайтами; выделение групп сходных аминокислот: 1-DN, 2-EQ, 3-ST, 4-KR, 5-FYW, 6-LIVM.

Технический результат заявленного изобретения - расширение арсенала средств, которые могут быть полезны при лечении различных неврологических, сердечно-сосудистых и других заболеваний, связанных с нарушенным протеолизом белков.

Были получены конструкции в экспрессирующих эукариотических векторах, содержащие человеческие IMPAS гены - hIMP1-hIMP5. Конструкции были использованы для получения стабильных и транзиентно-трансфицированных культур ряда клеток млекопитающих. Функциональный анализ IMPAS генов и белков включал in vitro и in vivo анализ. На модели in vitro показано, что IMPAS белки участвуют во внутримембранном протеолитическом расщеплении, которое регулируется ингибиторами внутри мембранного протеолиза, а также мутациями в инвариантных аминокислотах - потенциальных каталитических сайтах IMPAS белков или сайтов, регулирующих протеолиз. In vitro, на модели круглого червя нематоды, было показано участие IMPAS генов в эмбриональном и постэмбриональном развитии и возможных липид-липопротеин зависимых процессов метаболизма или клеточных сигналов метаболических путях, связанных с липидным обменом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Последовательности, конструкции и свойства IMPAS генов.

1) Получение и клонирование полноразмерных копий кДНК человека семейства IMPAS.

Нами были клонированы и проанализированы пять IMPAS генов человека:

(1) ген hIМР1, изоформа 1 (SEQ NO1), кодирующий белок SEQ NO8;

(2) ген hIMP1, изоформа 2 (SEQ NO2), кодирующий белок SEQ NO9;

(3) ген hIMP1, изоформа 3 (SEQ NO3), кодирующий белок SEQ NO10;

(4) ген hIМР2 (SEQ NO4), кодирующий белок SEQ NO11;

(5) ген hIMP3 (SEQ NO5), кодирующий белок SEQ NO12;

(6) ген hIМР4 (SEQ NO6), кодирующий белок SEQ NO13;

(7) ген hIMР5 (SEQ NO7), кодирующий белок SEQ NO14.

Для клонирования полноразмерных копий кДНК генов IMPAS человека использовали следующие праймеры:

Нуклеотидные последовательности альтернативных транскриптов гена hIМР1 (изоформы 1-3) определяли с помощью секвенирования клонированных ОТ-ПЦР продуктов из гиппокампа человека (Clontech, кДНК). ПЦР-продукты для клонирования полноразмерных копий кДНК генов hIMP2-hIMP4 человека получали из кДНК крови человека. Для клонирования гена hIMP5 использовали геномную ДНК человека.

Для клонирования использовали векторы pcDNA3, pcDNA4/myc-His В и pcDNA6/V5-HisA (Invitrogen), предназначенные для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученные ПЦР-фрагменты и вектор для клонирования рестрицировали соответствующими эндонуклеазами, лигировали между собой по следующим схемам и секвенировали (фиг. 1А-Ж):

(1) hIMP1 (изоформа 1):

1) ПЦР продукт (с кДНК лейкоцитов крови человека):

20.1.2 dir - 20.3 rev, рестрицированный по EcoRI, XhoI;

клонировали в вектор pcDNA3, рестрицированный по EcoRI, XhoI

2) ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 1)):

20.1 dir - pcDNA4B-20, рестрицированный по EcoRI, XhoI клонировали в вектор pcDNA4/myc-HisB, рестрицированный по EcoRI, Xhol.

3) ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 1)):

20.1.2dir - R-XHO20, рестрицированный по EcoRI, XhoI клонировали в вектор pcDNA6/V5-HisA, рестрицированный по EcoRI, XhoI.

(2, 3) hIМР1 (изоформы 2, 3):

ПЦР продукты (с кДНК лейкоцитов крови человека):

20.1 dir - 20.3 rev, рестрицированные по EcoRI, XhoI;

клонировали в вектор pcDNA3, рестрицированный по EcoRI, XhoI

(4) hIМР2

1) ПЦР продукты (с кДНК лейкоцитов крови человека ):

12.1 dir - 12.2 rev, рестрицированный по EcoRI, SphI;

12.3 dir - 12.3 rev, рестрицированный по SphI, XhoI;

клонировали в вектор pcDNA3, рестрицированный по EcoRI, XhoI

2) ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 1)):

12NotIdir- 12XbaIrev, рестрицированный по NotI, XbaI клонировали в вектор pcDNA4/myc-HisB, рестрицированный по NotI, XbaI.

(5) hIМР3

1) ПЦР продукты (с кДНК лейкоцитов крови человека):

15.1 dir - 15.2 rev, рестрицированный по NotI, Bsp 1407I;

15.3 dir - 15.3 rev, рестрицированный по Bsp1407I, XbaI;

клонировали в вектор pcDNA3, рестрицированный по NotI, XbaI.

2) ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 1)):

15.1 dir - pc4B-15, рестрицированный по NotI, XhoI клонировали в вектор pcDNA4/myc-HisB, рестрицированный по NotI, XhoI.

3) ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 1)):

15.1 dir - рс6А-15, рестрицированный по NotI, XhoI клонировали в вектор pcDNA6/V5-HisA, рестрицированный по NotI, XhoI.

(6) hIМР4

1) ПЦР продукт (с к ДНК лейкоцитов крови человека):

19.1 dir - 19.2 rev клонировали в вектор pGEM-T easy (Promega).

2) ПЦР продукт (с кДНК лейкоцитов крови человека):

19.4 dir - 19.4 rev клонировали в вектор pGEM-T easy (Promega).

3) EcoRI-MluI фрагмент из 1);

ПЦР продукт (с кДНК лейкоцитов крови человека): 19.3 dir - 19.3 rev, рестрицированный по MluI, BamHI;

BamHI-NotI фрагмент из 2);

клонировали в вектор pcDNA3, рестрицированный по EcoRI,NotI.

4) EcoRI-MluI фрагмент из 1);

ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 3)): 19.3 dir - pc4B-19, рестрицированный по MluI, XhoI;

клонировали в вектор pcDNA4/myc-HisB, рестрицированный по EcoRI, XhoI.

5) EcoRI-MluI фрагмент из 1);

ПЦР продукт (с плазмидной матрицы 3)): 19.3 dir - рс6А-19, рестрицированный по MluI, XhoI;

клонировали в вектор pcDNA6/V5-HisA, рестрицированный по EcoRI, XhoI.

(7) hIМР5

ПЦР продукт (с геномной ДНК человека):

17NotIdir-17XbaIrev, рестрицированный по NotI, XbaI клонировали в вектор pcDNA4/myc-HisB, рестрицированный по NotI, XbaI.

Обработку плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили в рекомендуемых фирмой-производителем (MBI Fermentas) буферах в течение 3 часов при температуре 37°С. Фермент инактивировали нагреванием до 65°С в течение 15 мин или очищали рестрикционную смесь на колонках QIAGEN согласно рекомедациям фирмы производителя. Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (MBI Fermentas) в 1х лигазном буфере (MBI Fermentas) в течение ночи при 4°С. Пробирку с 50 мкл компетентных клеток Е. coli, штамма XL-Blue, хранящихся при -70°С, инкубировали в ледяной бане до полного оттаивания. В оттаявшие клетки добавляли лигазную смесь и инкубировали клетки в ледяной бане в течение 30 мин. Далее проводили температурный шок, погружая клетки в водяную баню 42°С на 60 сек и затем сразу в лед на 2 мин. Добавляли 500 мл среды LB и подращивали культуру в течение часа при 37°С. Рассевали суспензию клеток на чашки с агаризованной средой LB, содержащей селектирующий антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Ген устойчивости к данному антибиотику, находился в плазмидном векторе, который использовался для клонирования и содержался в лигазной смеси. Чашки помещали в термостат на 37°С на ночь.

На следующий день клоны проверяли на наличие вставки с помощью ПЦР с соответствующими праймерами. 3-4 клона, позитивных по ПНР-анализу, засевали по отдельности в пробирки с жидкой LB средой, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Пробирки инкубировали при 37°С с аэрацией в течение ночи. Плазмидную ДНК из клеток Е. coli выделяли, используя набор QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), согласно инструкции фирмы-производителя. Размер вставки подтверждали с помощью рестрикции по сайтам клонирования.

Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов проводили в горизонтальных 1% агарозных гелях в 1х ТАЕ-буфере в течение 1 часа при напряжении 100V. В гель добавляли бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл. Величину линейных фрагментов ДНК определяли с помощью сравнения с маркерными полосами ДНК известного размера, полученными рестрикцией ДНК фага λ рестриктазой PstI. Клонированную последовательность секвенировали.

2) Свойства IMPAS генов человека (исследование экспрессии на уровне транскрипции).

Показана широкая представленность полиА+РНК hIМР1-hIМР4 в разных тканях человека, повышенная экспрессия в поджелудочной железе и пониженная в мышцах и тканях сердца по сравнению с клетками мозга и другими тканями (фиг.2).

ПолиА+ РНК hIMP5 представлена преимущественно в поджелудочной железе. Высокая вариабельность сплайсированных изоформ hIMP1 детектирована в гиппокампе мозга человека. Три наиболее представленные изоформы клонированы в плазмидные векторы pcDNA3, pcDNA4/myc-His В и pcDNA6/V5-HisA (Invitrogen). Экспрессия hIMP1- hIMP4 генов идентифицирована в лейкоцитах крови и клетках мозга пациентов с болезнью Альцгеймера (БА), шизофренией и здоровых людей. Сниженную экспрессию hIMP1 детектировали в неокортексе пациентов с БА.

В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали панель кДНК из разных тканей и органов человека (Clontech).

Для ПЦР анализа экспрессии генов были использованы следующие пары праймеров:

Пример 2.

Получение белка. Трансформированные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующие белки hIМР1-hIМР5.

Для экпрессии белка, полученные рекомбинантные конструкции с IMPAS генами в векторах pcDNA3, pcDNA4/myc-His В и pcDNA6/V5-HisA (Invitrogen) были использованы для получения стабильных и транзиентно-трансфицированных культур ряда клеток млекопитающих (клеток СНО, яичников китайского хомячка, PC 12 феохромоцитомы крысы и эмбриональных клеток почки человека НЕК293).

Мы показали, что:

1) Белки hIMP1-hIMP5 встречаются в клетке как в виде отдельных полноразмерных белков (30-80 кД), так и в составе высокомолекулярных комплексов (от 80 кД и более 150 кД). Фиг.3 иллюстрирует экзогенную и эндогенную экспрессию IMPAS белков в клетках млекопитающих на примере белков hIМР1, hIMP4, hIМР5. На фиг.3А представлена Вестерн-гибридизация с антителами к V5-эпитопу на лизатах клеток яичников китайского хомячка СНО, 3Б - клеток PC 12 (дорожка 1) и человеческих эмбриональных клеток почки НЕК293 (дорожка 3), трансфицированных плазмидой, содержащей кДНК гена hIМР1 (изоформа 1) в векторе pcDNA6/V5-His A (Invitrogen) (контроли - фиг.3А, дорожка 3; фиг.3Б, дорожки 2, 4). Фиг.3В иллюстрирует экспрессию белка hIMP4 с помощью Вестерн-гибридизации с антителами к с-myc-эпитопу на лизатах клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой, содержащей hIMP4 в векторе pcDNA4/myc-HisB. На фиг.3Г показана Вестерн-гибридизация с антителами к с-myc-эпитопу на лизатах клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой, содержащей hIМР5 в векторе pcDNA4/myc-HisB (дорожка 3 - контроль). Эндогенная экспрессия hIМР1 белка в клетках млекопитающих (PC 12, Н4, НЕК283, клетках мозга) детектируется с помощью антител к N-концевому участку гена hIMP1 (фиг.3Д).

2) Высокомолекулярные формы IMPAS белков представляют гомодимерные комплексы, SDS-устойчивые в условиях электорфореза. Для доказательства существования IMPAS белков в виде гомодимерных комплексов проводили котрансфекцию культур клеток млекопитающих плазмидами, экспрессирующими hIMP1 белок, слитый с с-myc и с V5-эпитопами. При этом показано, что hIMP1-V5 белок можно иммунопреципитировать с помощью антител на с-myc и, наоборот, hIMP1- c-myc белок с помощью антител на V5. На фиг.3Е показана Вестерн-гибридизация с антителами к V5-эпитопу на лизатах клеток млекопитающих, трансфицированных плазмидами, содержащими hIMP1 в векторах pcDNA4/myc-HisB и pcDNA6/V5-HisA (1 - иммунопреципитат с антителами к V5-эпитопу, 2 - клеточный лизат, 3 - иммунопреципитат с антителами к c-myc-эпитопу, 4 - контрольная сыворотка.) hIMP1-c-myc белок иммунопреципитируется с помощью антител на V5 (дорожка 3).

3) Экзогенная экспрессия hIМР1-hIMP5, в более чем 10 раз превышающая уровень эндогенной экспрессии данных генов в клетках млекопитающих, не обладала выраженным токсичным эффектом, т.к. стабильно и транзиентно трансфицированные клетки выживали и пролиферировали.

Клетки PC 12 феохромоцитомы крысы выращивали при 37°С и 5% CO₂ на среде RPMI-1640 (ICN, США) с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Клетки СНО, яичников китайского хомячка, эмбриональные клетки почки человека НЕК293 культивировали на среде DMEM (GibcoBRL, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (GibcoBRL, США) и 100 ед. акт пенициллина/стрептомицина.

Трансфекцию клеток млекопитающих осуществляли с помощью набора LipofectAMINE PLUS (Gibco BRL), по методике фирмы-производителя. Через 24-48 ч клетки лизировали (для изучения транзиентной экспрессии) или добавляли в культуру клеток селектирующий антибиотик (зеоцин 0.1 мкг/мл или бластицидин 5 мкг/мл) для получения стабильно-трансфицированных линий. Для сохранения полученных линий, клетки замораживали. Клетки снимали с поверхности чашки или флакона в сыворотке и добавляли 7% DMSO (Serva), после чего аликвоты клеток по 1 мл охлаждали в холодильнике при +4°С, затем переносили в кельвинатор на -70°С и, наконец, в жидкий азот.

Для выделения тотального белка, трансформированные клетки перед лизисом два раза промывали холодным PBS-буфером, лизировали в модифицированном RIPA-буфере (50 мМ трис-HCl, рН 7.4, 1% NP-40, 0.25% дезоксихолата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 1 мМ EDTA, 1 таблетка «коктейля» ингибиторов Complete, Mini, EDTA-free на 10 мл буфера (Roche)) в течение одного часа при 4°С, центрифугировали при > 10.000 об/мин в течение 15 минут при 4°С. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, определяли концентрацию белка и использовали для нанесения на гель. Электрофорез осуществляли в 6-10% SDS полиакриламидных гелях. После электрофоретического разделения белки переносили на мембрану PVDF. Для детекции белков на блоте использовали набор реактивов ECL (Amersham Pharmacia Biotech), первичные антитела к N-концевой части PS1 (ак. 1-92), антитела к первым 17 ак. N-концевого участка гена hIMP1, коммерческие антитела к эпитопам V5, с-myc, и соответствующие вторичные антитела.

Пример 3.

Свойства IMPAS белков:

1) Свойство IMPAS белков как аспартатных внутримембранных эндопротеаз было показано на примере связывания и внутримембранного протеолитического расщепления белком hIMP1 субстрата PS1.

Было показано, что

1) hIМР1 прочно связывается с полноразмерной непроцессированной формой PS1 (PSIholo) и С-концевым процессированным фрагментом PS1 (PS1 CTF). На фиг.4А представлена иммунопреципитация антителами (I.P. АВ) к hIMPI (к N-концевой части hIMP1 или к С-концевому эпитопу с-myc) полноразмерной непроцессированной формы PS1 (PS1 holo) и С-концевого процессированного фрагмента PS1 (PS1 CTF). В обратных экспериментах hIMP1 связывается антителами к N-концевой части пресенилина 1 (PS1 NTF). PI1, PI2 - контрольные сыворотки.

2) Полноразмерные белки PS1, при котрансфекции с hIMP1 дикого типа, подвергаются протеолитическому расщеплению с образованием продуктов протеолиза (фиг.4Б, 1 - полноразмерный белок PS1 (PS1 holo); 2 - продукт протеолитического расщепления), сайт протеолиза локализован в Х гидрофобном домене PS 1 дикого типа человека. На фиг.4Б представлена Вестерн-гибридизация с антителами к N-терминальной части PS1 (PS1 NTF) на лизатах клеток НЕК293, трансфицированных различными формами PS1 и hIMP1 или PS1 и pcDNA4 (контрольным вектором).

3) Для доказательства того, что IMPAS гены являются аспартатными протеазами:

а) вводились мутации в каталитически активные сайты hIMP1 - аспартатные остатки (D219A, D265A), а также в консервативный пролиновый остаток (P317L). Эти мутации ингибировали протеолитическое расщепление PS1 hIMP1 белком (фиг.4Б);

б) Мутация в не каталитически активном сайте hIMP1 G264A, не изменяла протеолитическую активность hIMPI в отношении субстрата PS1 (фиг.4Б);

в) Известный ингибитор внутримембранных аспартатных протеаз L-685,458 прекращал протеолитическое расщепление PS1 hIMP1 белком. В контрольные клетки (без L-685,458) добавляли DMSO, который был использован для разведения ингибитора (фиг.4Б).

Клетки НЕК293 трансфицировали конструкциями, содержащими различные формы генов hIMP1 и PS1, лизировали через 48 часов и наносили на электрофорез в условиях, описанных выше. L-685,458 ингибитор использовали в концентрации 7.5 мкм/мкл и добавляли в среду при смене среды после трансфекции добавляли на 24 часа. Вестерн-гибридизацию проводили с антителами к N-терминальной части PS1.

Для изучения связывания hIMP1 и PS1 белков проводили котрансфекцию hIMP1 в плазмидном векторе pcDNA4/myc-HisB и PS1. Клеточные лизаты иммунопреципитировали с различными антителами к hIMP1 (к N-концевой части hIMP1 или к С- концевому эпитопу hIMP1 c-myc) или антителами к N-концевой части PS1 с помощью ProteinA-Sepharose CL-4B по протоколу фирмы производителя (Amersham Pharmacia). Иммунопреципитаты использовали для проведения Вестерн-гибридизации с антителами к PS1 и hIMP1.

2) Участие IMPAS белков в эмбриональном развитии и метаболических путях, связанных с липидным обменом.

Для определения функций IMPAS генов и кодируемых ими белков в целом организме проводили инактивацию ортолога hIМР1 гена в круглом черве Caenorhabditis elegans и изучали полученные фенотипы. Ингибирование гена ортолога hIMP1 (imp-2) вызывало эмбриональную гибель, задержку роста личинок, нарушение координации движения, а также гибель червей на всех стадиях морфогенеза в результате нарушения процессов линьки. (Табл. 1). Наблюдаемые изменения фенокопировали дефекты развития С. elegans при недостатке холестерола в среде, а также при ингибировании ряда генов, связанных с обменом липидов или стероидо-зависимой сигнальной трансдукцией. Так, наиболее сходный фенотип мы наблюдали в параллельных экспериментах по инактивации гомолога гена мегалина/gр330 у нематоды (lrp-1) (Табл. 1).

Активность IMPAS ингибировали с помощью интерференции двуспиральной РНК (дсРНКи, dsRNAi) путем микроиньекций двуспиральной РНК (дсРНК) в полость тела червя, а также с использованием в качестве корма клеток Е. coli, продуцирующих дсРНК. Культивирование червей осуществляли по стандартной методике (Brenner, 1974). Конструкции, содержащие кДНК imp-2 (yk671a5), а также lrp-1 (yk260f8) генов, в pBluescriptSK(-) векторе были получены от Y. Kohara (Genome Biology Lab, National Institute of Genetics, Mishima). ДсРНК для инъекций синтезировали с помощью набора реактивов Ambion MEGAscript® T7 Transcription Kit no методике фирмы производителя. В качестве матрицы использовали очищенный ПЦР продукт кДНК гена imp-2, с обоих концов имеющий последовательность праймера T7. Полученную дсРНК разводили до нужной концентрации (1-5 мкг/мкл) и инъецировали в полость тела червя. Через 4-6 часов после иньекции червей индивидуально переносили на свежие чашки. В течение двух-трех последующих дней проводили анализ F1 потомства.

Для дсРНКи с использованием в качестве корма клеток Е. coli, продуцирующих дсРНК, кДНК imp-2 переклонировали по EcoRI, XhoI сайтам в вектор L4440. Этот вектор содержит два промотора Т7, расположенных на разных цепях ДНК и с разных концов последовательности полилинкера, что позволяет использовать L4440 вектор, с клонированным в него геном, для наработки дсРНК в клетках Е. coli. ПЦР-продукт соответствующий фрагменту к ДНК lrp-1, полученный на матрице yk260f8 с праймерами gpRNAdir-TTTTGGATCC-GCCGTACTTGCTCTCCATTC и gpRNArev-TTTTCTCGAG-CCATCCAATCGACATTTTCC, клонировали в вектор L4440 по сайтам BamHI, XhoI. Клетки Е. coli HT115, трансформировали конструкциями imp-2/L444Q и lrp-11 L4440, подращивали в 1 л среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл тетрациклина, до плотности OD(600)˜1. Затем бактерии центрифугировали при 4°С, 7.000-10.000 об/мин в течение 15 мин. Осадок растворяли в 50 мл среды LB, содержащей 60 мкг/мл ампициллина, 7% DMSO, расфасовывали по 5 мл и хранили аликвоты при -70°C. Для использования в эксперименте каждый раз брали свежую аликвоту, размораживали при комнатной температуре, добавляли 100 мкл IPTG (200 мг/мл), 200 мкл ампициллина (50 мг/мл) и засевали бактериями чашки с агаром. Синхронизированную популяцию червей на стадии L1, помещали на чашки с Е. coli, продуцирующими дсРНК. Фенотип червей и F1 потомства анализировали последующие 2-3 дня. Исследуемых червей помещали на стекла с агаром в буфере М9 и накрывали покровным стеклом. Фенотип анализировали на микроскопе с оптикой Номарского при увеличении х 1000-2000.

Показано, что IMPAS белки необходимы для нормального развития эукариот и вовлечены в важные метаболический пути, связанные с липидным обменом, пластичностью мембран.

Таким образом, рекомбинантные векторные системы, содержащие IMPAS гены, белок, кодируемый ими очищенные или синтезированные антитела, пептиды или полипептиды могут использоваться для исследования новых протеолитических механизмов in vivo и in vitro, для разработки диагностики и лечения болезней, связанных с протеолизом внутриклеточных рецепторов или белков с гидрофобными доменами, накоплением труднорастворимых пептидов, содержащих гидрофобные участки (например, при Болезни Альцгеймера) или продуктов протеолиза белков, влияющих на липидный обмен, структурные свойства мембран, передачу сигналов между клетками, например, при нейропсихиатрических, сердечно-сосудистых заболеваниях и раке.

Список литературы

1. Borchelt, D. R., Thinakaran, G., Eckman, С. В., Lee, M. K., Davenport, F., Ratovitsky, Т., Prada, C. M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H. H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A. I., Gandy, S.E., Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Price, D.L., Younkin, S.G., & Sisodia, S.S. 1996. Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta 1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo. Neuron. 17(5): 1005-1013.

2. Duff, К., Eckman, С., Zehr, С., Yu, X., Prada, С. M., Perez-tur, J., Hutton, M., Buee, L., Harigaya, Y., Yager, D., Morgan, D., Gordon, M. N., Holcomb, L., Refolo, L., Zenk, В., Hardy, J., & Younkin, S. 1996. Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nature, 383(6602): 710-713.

3. Citron, M., Westaway, D., Xia, W., Carlson, G., Diehl, Т., Levesque, G., Johnson-Wood, K., Lee, M., Seubert, P., Davis, A., Kholodenko, D., Motter, R., Sherrington, R., Perry, В., Yao, H., Strome, R., Lieberburg, I., Rommens, J., Kim, S., Schenk, D., Fraser, P., St George, H. P., & Selkoe, D. J. 1997. Mutant presenilins of Alzheimer's disease increase production of 42-residue amyloid beta-protein in both transfected cells and transgenic mice. Nat. Med., 3(1): 67-72.

4. Lemere, С. A., Lopera, F., Kosik, K. S., Lendon, С. L., Ossa, J., Saido, T. C., Yamaguchi, H., Ruiz, A., Martinez, A., Madrigal, L., Hincapie, L., Arango, J. C., Anthony, D. C., Koo, E. H., Goate, A. M., Selkoe, D. J., & Arango, J. C. 1996. The E280A presenilin 1 Alzheimer mutation produces increased A beta 42 deposition and severe cerebellar pathology. Nat. Med.. 2(10): 1146-1150.

5. Rogaev, E. I., Sherrington, R., Rogaeva, E. A., Levesque, G., Ikeda, M., Liang, Y., Chi, H., Lin, C., Holman, K., Tsuda, Т.,., Mar, L., Sorbi, S., Nacmias, В., Piacentim, S., Amaducci, L., Chumakov, I., Cohen, D., Lannfelt, L., Fraser, P., Rommens, J., & St. George-Hyslop, P. 1995. Familial Alzheimer's disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer's disease type 3 gene. Nature, 376(6543): 775-778.

6. Rogaev, E.I., Sherrington, R., Wu, C., Levesque, G., Liang, Y., Rogaeva, E.A., Ikeda, M., Holman, K., Lin, C., Lukiw, W.J., de Jong, P.J., Fraser, P.E., Rommens, J. M., & George-Hyslop, P. 1997. Analysis of the 5' sequence, genomic structure, and alternative splicing of the presenilin-1 gene (PSEN1) associated with early onset Alzheimer disease. Genomics. 40(3): 415-424.

7. Sherrington, R., Rogaev, E.I., Liang, Y., Rogaeva, E.A., Levesque, G., Ikeda, M., Chi, H., Lin, C., Li, G., Holman, K., Tsuda, Т., Mar, L., Foncin, J.-F., Bruni, A.C., Montesi, M.P., Sorbi, S., Rainero, I., Pinessi, L., Nee, L., Chumakov, I., Pollen, D., Brookes, A., Sanseau, P., Polinsky, R.J., Wasco, W., Da Silva, H.A.R., Haines, J.L., Pericak-Vance, M.A., Tanzi, R.E., Roses, A.D., Fraser, P.E., Rommens, J.M., & St. George-Hyslop, P.H. 1995. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 375(6534): 754-760.

8. Grigorenko, A. P., Moliaka, Y. K., Korovaitseva, G. I., and Rogaev, E. I. 2002. Novel class of polytopic proteins with domains associated with putative protease activity. Biochemistry (Mosc.) 67(7): 826-835.

9. Brenner, S. 1974. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics, 77(1): 71-94.

1. Выделенный фрагмент ДНК, кодирующий белок, обладающий свойством аспартатной внутримембранной эндопротеазы, при этом фрагмент ДНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO1-NO7.

2. Белок, обладающий свойством аспартатной внутримембранной эндопротеазы, кодируемый фрагментом ДНК по п.1 и характеризующийся аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO8-NO14.

3. Способ получения белка по п.2, включающий в себя культивирование хозяйских клеток млекопитающих, содержащих рекомбинантную ДНК с фрагментом по п.1, в условиях, допускающих экспрессию указанной ДНК и выделение экспрессируемого белка, обладающего свойствами аспартатной внутримембранной эндопротеазы.