Способ получения толерантных к засолению газонных трав in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии для получения солеустойчивых растений. Культивируют семена газонных трав овсяницы и полевицы до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга от 3 до 10 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой, проводят пассирование каллуса в течение 2-4 пассажей, на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 1% хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов. Далее проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 1% хлорида натрия. Изобретение позволяет быстро и эффективно получать растения овсяницы и полевицы со стабильной и наследуемой устойчивостью к засолению. 3 табл.

 

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

В последние годы из-за использования противогололедных смесей, в частности хлорида натрия, в почву весной, наряду с тяжелыми металлами, в значительном количестве поступают соли. Это приводит к неблагоприятному для роста и развития растений изменению химических и физико-химических свойств почвы. Весной около многих автомагистралей и на улицах города засоление почв достигает среднего и сильного значения от 0,4 до 1% (Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В., Карпачевских Л.О. Причины и механизмы гибели зеленых насаждений при действии техногенных факторов городской среды и создание стресс-устойчивых фитоценозов. // Лесной вестник, 2000, №6 (15), с.15-18). Такое засоление является пределом для нормального роста и развития большинства видов древесно-кустарниковых растений и газонных трав. Характерное действие загрязняющих веществ на городские газоны - "краевой эффект", состоящий в образовании не покрытых растительностью участков придорожных газонов вдоль проезжей части.

Данные экологические проблемы решаются неэффективно, погибшие от засоления виды растений заменяются теми же видами, которые ждет та же участь. Решение данной проблемы - создание растений, устойчивых к неблагоприятным факторам мегаполиса.

Наряду с традиционными методами селекции перспективно использовать современные биотехнологические подходы, которые уже хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам: засухе, засолению, низким и высоким температурам и др. (Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Гладкова О.Н., Гладкова О.В., Глушецкая Л.С. Экологические стрессы у растений. М.: Пасьва, 24 стр., 2004). Применительно к газонным травам подобные работы отсутствуют, хотя нет принципиальных показаний против их использования.

Известно несколько способов получения солеустойчивых растений.

Путем прямой одноступенчатой селекции были получены каллусные линии манго: отбор на среде с NaCI велся в течение одного пассажа, затем 3 пассажа в неселективных условиях и снова на соль (Kumar, Sharma. Isolation and characterization of sodium chloride resistant callus culture of Vigna radiata (L) Wilczek var. radiata // Plant cell Rep, 7(8), 648-651, 1989).

Солеустойчивые клеточные культуры сахарной свеклы были получены при селекции на среде с 1,5% хлорида натрия в течение 3 пассажей. Однако информации о получении солеустойчивых растений нет (Губанова Н.Я., Дубровная О.В., Чугункова Т.В. Отбор и сравнительный анализ устойчивых к солевому стрессу каллусных культур кормовой свеклы, полученных из эксплантов различной плоидности // Физиология и биохимия культурных растений, 2000, Т.32, №5, с.362-369).

Путем ступенчатой селекции получены клеточные линии риса, устойчивые к NaCl (By Дык Куанг, Нгуен Хыу Донг. Мутагенез и прямой отбор солеустойчивых клонов в культуре пыльников риса. Тезисы Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" // Новосибирск, 1988, с.181), люцерны, устойчивые к аналогу пролина (Новожилов О.В., Левенко Б.А. Изолирование к анализу клеточных линий люцерны, устойчивых к аналогах метионика пролина, и регенерантов из них. Тезисы Междунар. конфер. "Биология культив. клеток и биотехнология // Новосибирск, 1988, с.176) и к хлориду натрия (McCoy T.J. Charakterization of alfalfa (Medicago sativa ) plants regenerated from selected NaCI tolerant cell lines // Plant Cell Rep., 6(6), 417-422, 1987). Ступенчатая селекция проводилась сначала на 0,5%, а затем на 1% NaCl. Для получения солеустойчивых растений кукурузы использовали двухступенчатую схему селекции, повышая концентрацию хлорида натрия с 1% до 1,5% (Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б. Селекция на осмоустойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов. // Физиол. Раст., 1994, т.41, №1. С.114-120).

В качестве недостатков данных методов следует отметить, что при длительном культивировании может наблюдаться потеря регенерационной способности культивируемых солеустойчивых клеток.

Известен еще способ получения солеустойчивых растений кукурузы, заключающийся в культивировании до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга (МС), пассировании каллуса по ступенчатой селекции при увеличении концентрации хлорида натрия от 1 до 1,5% до получения регенерирующих каллусов регенерации и укоренения растений при концентрации хлорида натрия - 1,5% (Ларина С.Н. Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 1995).

Однако использование ступенчатой селекции так же, как и длительное культивирование, приводит к значительному уменьшению процента регенерирующих каллусов.

Задачей нашего метода было исключить вышеуказанные недостатки и получить солеустойчивые растения.

Раскрытие изобретения

Данная задача была решена созданием нового способа толерантных к засолению газонных трав in vitro, отличающегося тем, что семена газонных трав овсяницы и полевицы культивируют до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга от 3 до 10 мг/л с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), далее проводили пассирование каллуса в течение 2-4 пассажей, на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 1% хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 1% хлорида натрия.

По мнению авторов, сущность изобретения состоит в уменьшенном периоде культивирования и в использовании хлорида натрия на каждом этапе культивирования. При концентрации ниже 3 мг/л у полевицы и овсяницы наблюдали интенсивное прорастание семян, процент образования каллуса был невысок. Способ иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах обеих трав при концентрации 2,4-Д 3; 5 и 10 мг/л (графа индукция каллуса, табл.1). Затем каллус пересаживали вновь на питательную среду. Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д вело к быстрой потере способности к морфогенезу.

Таблица 1 Влияние концентрации 2,4-Д на каллусообразование у овсяницы и полевицы
Концентрация 2,4-Д, мг/л	% каллусогенеза	% регенерирующих каллусов
Индукция каллуса	Культивирование каллуса
Овсяница	Полевица	Овсяница	Полевица
1	-	23	33	-	-
3	1	50	80	80	95
3	3	50	80	65	73
5	1	50	78	70	82
5	3	50	78	65	70
10	1	43	56	40	45
10	3	43	56	40	43
Доверительный интервал различий (% от измеряемой величины)	7,8	5,6	6,1	4,0

Пример 2. При снижении концентрации 2,4-Д до 1-3 мл удалось повысить частоту регенерирующих растения каллусов до 80% у овсяницы и до 95% у полевицы (графа культивирование каллуса, табл.1).

Для отбора солеустойчивых клонов первичный каллус культивировали на средах с 1 и 2% NaCl в течение 2-4 пассажей.

В ходе отбора происходило изменение выживающих эксплантов: уменьшалась эмбриогенная способность ткани, нерастущие экспланты приобретали темный цвет, некротизировались. Светлые экспланты, увеличившиеся в размере, отбирали для дальнейшей пересадки. Отобранные экспланты помещали вновь на селективную среду с 1% и 2% NaCl.

Пример 3. После двух пассажей на среде с 1% NaCl и у овсяницы, и у полевицы выжило около 30% каллусов. При культивировании в течение трех пассажей выживало 23% каллусов у овсяницы и 21% у полевицы, в течение 4 пассажей выжило 18% каллусов у овсяницы и 16% у полевицы, дальнейшее увеличение пассажей вело к полной потере регенерационной способности каллусной ткани. Для повышения вероятности отбора только устойчивых мутантных вариантов регенерацию растений из отобранных клонов и укоренение также проводили на среде с 1% NaCl. Только 60 каллусов овсяницы и 200 каллусов полевицы сформировали растения, более половины которых погибла при пересадке в почву (табл.2).

При проведении селекции в более жестких условиях (среда с 2% NaCl) значительная часть каллусной ткани теряла жизнеспособность в течение 2 недель. Лишь некоторые клоны сохраняли эмбриогенную способность и имели прирост биомассы. Из них были получены растения-регенеранты, однако с меньшей частотой, чем при проведении селекции на среде с 1% соли. Полученные растения хуже приживались в почве и не дали семян. По-видимому, культивирование клеток на среде с 2% соли вызывает неспецифические повреждения, которые впоследствии снижают выживаемость регенерантов.

Таблица 2 Отбор толерантных к NaCl растений овсяницы и полевицы
Концентрация NaCl, %	Общее число каллусов	Число устойчивых клонов	Число регенерантов in vitro	Число регене-рантов в почве
Полев.	Овсян	Полев.	Овсян.	Полев.	Овсян.	Полев.	Овсян.
1	1500	450	590	180	200	60	132	26
2	600	300	150	86	50	25	18	9

Выжившие растения-регенеранты полевицы и овсяницы первоначально выращивали в почве без соли. Затем для проверки солеустойчивости в сосуды с частью растений вносили NaCl. Прирост растений в почве без соли за месяц был одинаковым у исходных растений и регенерантов. В варианте с засолением выживаемость регенерантов была выше выживаемости исходных растений при всех концентрациях NaCl. Средний прирост за месяц у растений, полученных из солеустойчивых клонов, был в 2 раза больше при уровне соли 1% и в три раза при полуторапроцентном засолении. В отличие от пожелтевших исходных растений большая часть регенерантов сохраняла высокие декоративные качества при концентрации NaCl 1%. При дозе NaCl 2% выжили только отдельные регенеранты, для них были характерны пожелтение листьев и заметное отставание в росте.

Семена регенерантов полевицы высаживали в почву с содержанием NaCl - 0,7%. Семена контрольных растений в этих условиях не проросли, хотя в почве без соли они имели всхожесть 95%. Всхожесть семян регенерантов составила около 50%. По степени кустистости и высоте потомки регенерантов на соли не уступали растениям, выращенным в нормальной почве. У отселектированных растений отмечено обильное цветение и завязывание семян в стрессовых условиях.

Таблица 3 Эффективность способа получения толерантных к засолению газонных трав (для полевицы)
Селективный фактор	Концен-трация, %	Кол-во семян, шт.	Кол-во растений, %	Кол-во растений, давших семена, %	Кол-во растений, у которых устойчивость наследу-ется в следующем поколении, %
NaCl	1,0	1875	7,04	1,06	0,74

Технический результат

Результаты табл.1, 2, 3 показывают, что предлагаемый метод является эффективным, особенно для полевицы (табл.3).

По частоте выделения форм с наследуемой толерантностью предлагаемый способ клеточной селекции не уступает индуцированному мутагенезу, но количество нежелательных генетических изменений в предлагаемом способе было меньше.

Процесс получения растений со стабильной и наследуемой устойчивостью при использованной в данной работе биотехнологии занимает два года. Это намного меньше, чем проведение селекции традиционным методом с применением отдаленной гибридизации.

Кроме того, оказалось, что полученные по предлагаемому методу растения устойчивы к бишофиту. По мнению авторов, устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды нередко носит неспецифический характер, то есть формы, толерантные к одному фактору могут быть менее чувствительны и к другим. Исходные растения при концентрации бишофита 1% значительно отставали в росте от контрольных, а рост растений, выращенных из семян регенеранта, почти не уступал росту в почве без соли. В следующем поколении 90% проверенных NaCl-устойчивых растений также росли на бишофите лучше, чем контрольные.

Способ получения толерантных к засолению газонных трав in vitro, заключающийся в том, что семена растений культивируют до получения каллуса на среде Мурасиге-Скуга, далее проводят пассирование каллуса на среде Мурасиге-Скуга с добавлением хлорида натрия до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с хлоридом натрия, отличающийся тем, что в качестве семян растений используют семена газонных трав овсяницы и полевицы, культивируют их до получения каллуса на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 3-10 мг/л, далее проводят пассирование каллуса в течении 2-4 пассажей на среде с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 1-3 мг/л и с хлоридом натрия в концентрации 1% до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию и укоренение растений на среде с хлоридом натрия в концентрации 1%.