Фракция геля, полученная из шелухи семян подорожника блошиного
Изобретение относится к созданию средств растительного происхождения в качестве слабительного средства. Предложена очищенная форма гелеобразующего компонента шелухи семян подорожника блошиного, а также способ получения гелеобразующей фракции из шелухи семян подорожника блошиного. Предложены также способы использования этой гелеобразующей фракции в качестве слабительного средства. Предложенные композиции могут быть выполнены в различных лекарственных формах. Композиции приятны на вкус и безопасны. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 табл.
Настоящее изобретение относится к слабительным средствам, к лечению для понижения содержания холестерина в сыворотке крови, к низкокалорийным пищевым загустителям (сгустителям) и к заменителям жира. В частности, настоящее изобретение имеет отношение к несброженным гелеобразующим полисахаридам, полученным из шелухи семян подорожника блошиного, и к способам их выделения.
Шелуху семян подорожника блошиного (Plantago ovata, известный также как испагула) обычно используют в качестве слабительного, а также для содействия регулярной функции кишечника. Шелуха семян подорожника блошиного (далее в тексте для упрощения восприятия определение «блошиный» опущено) содействует перистальтике кишечника, частично за счет увеличения массы и влажности содержимого стула (Marteau et al., 1994, Gut 35:1747-1752). Кроме того, испражнения животных и людей, которые потребляли пищу, содержащую шелуху семян подорожника, являются гелеобразными (студенистыми). Эта студенистость повышает слабительные свойства шелухи семян подорожника за счет снижения трения в кишечнике. Наблюдавшееся увеличение фекальной массы и удержания воды также может быть объяснено указанными гелеобразными свойствами материала (Marteau et al., 1994, см. выше). Гель образован в основном из не подвергавшихся брожению полисахаридов подорожника (Cabotaje et al., 1994, 1302-1307).
Используемые обычно препараты из шелухи семян подорожника имеют некоторые недостатки. Слабительные препараты из шелухи семян подорожника обычно содержат размолотую шелуху, которая является грубой и неприятной на вкус, если ее назначать для питья. Уже известно введение шелухи семян подорожника в выпечку, крекеры (галеты, печенья) и другие аналогичные продукты, однако эти продукты имеют тенденцию к неприятному на вкус образованию геля уже во рту. Однако более существенным является то, что шелуха семян подорожника может разбухать в пищеводе, что может приводить к его непроходимости. По указанным причинам препараты из шелухи семян подорожника не рекомендуются для приема внутрь пациентам, которые имеют трудности при глотании (например, пожилым людям). Наконец, рекомендуемая дневная доза шелухи семян подорожника, составляющая 3,5-11 г в день, является неудобной для проглатывания в любом виде. Таким образом, существует необходимость в такой форме препарата из шелухи семян подорожника, которая является удобной и приятной для использования.
Шелуха семян подорожника обладает многими свойствами различных видов растворимой пищевой клетчатки. Среди обычно используемых видов растворимой пищевой клетчатки можно указать пектин, камедь и овсяные отруби. Растворимая пищевая клетчатка (SDF) широко используется в пищевой промышленности и в медицине. Растворимые волокна являются компонентами таких потребляемых с минимальной обработкой источников пищи, как овес, овсяные отруби и ячмень, или же эти волокна используют как концентраты, такие как пектин, камедь и растительный клей. Камедь и растительный клей представляют собой углеводные (углеводородные) полимеры, которые обычно выделяют из растений. Растительные клеи, в частности, образуют склизкие или гелеобразные растворы в воде. Пектины имеют полимерные цепи частично метилированных галактуроновых кислот, которые также обладают способностью образовывать гель в воде. Большинство растворимых волокон быстро и полностью ферментируется и не имеет слабительных свойств.
Источником растворимой пищевой клетчатки является также вязкий холестерин сыворотки крови животных и человека (Marlett, 1997, pp.109-121, Dietary Fiber and Health. Plenum Press, New York, ed. Kritchevsky and Bonfield). Вязкость SDF скорее, чем ее ферментация (брожение) в желудочно-кишечном тракте, является ключевой в ее действии на снижение содержания холестерина (Marlett et al., 1994, Hepatology 20:1450-1457). Вязкость в просвете нижней тонкой кишки препятствует абсорбции желчных кислот и приводит к увеличению вывода желчных кислот со стулом. Можно полагать, что содержание холестерина в крови понижается в первую очередь из-за того, что он расходуется в печени для синтеза желчных кислот, необходимых для восполнения их потери (вывода). Синтез желчных кислот в печени является причиной ежедневного удаления от 40 до 50% холестерина из крови. Однако добавление в диету источника растворимого волокна, такого как овсяные отруби, приводит также к увеличению пропорции дезоксихолевой кислоты в объеме желчных кислот, что снижает абсорбцию экзогенного пищевого холестерина. Добавление в диету шелухи семян подорожника также увеличивает выведение желчных кислот ориентировочно на 50% (Gelissen et al., 1994, Am. J. Clin. Nutr. 59:395-400).
Концентраты растворимой пищевой клетчатки часто используют в пищевой промышленности в качестве загустителей и низкокалорийных заменителей жира по причине их гидроколлоидных свойств (Ward, 1997, Cereal Foods World, 42:386-390). Имеющие низкую вязкость камеди, такие как аравийская камедь, имеют как гидрофильные, так и липофильные свойства, что делает их идеальными для использования в качестве эмульгаторов, поверхностно-активных веществ и стабилизаторов. Пектины и растительные клеи обладают гелеобразующими свойствами, что делает их идеальными загустителями пищевых продуктов. Пектины традиционно экстрагируют из яблок и цитрусовых. Обычно используемые растительные клеи, как правило, экстрагируют из морских водорослей, таких как караген, агар и альгинат. Заменитель жира может быть приготовлен при комбинировании камеди с растительным клеем и/или с пектином для создания соединения, имеющего эмульсионные свойства и мягкость жира.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается гелеобразующий компонент из шелухи семян подорожника в очищенном виде. Эта гелевая фракция (фракция геля) обладает слабительными свойствами и гипохолестериновыми свойствами (свойствами снижения содержания холестерина), присущими целой (непереработанной) шелухе семян подорожника, однако имеет форму, которая легко может быть назначена в виде таблетки, капсулы или жидкости без некоторых неприятных или небезопасных моментов, связанных с приемом нетронутой шелухи семян подорожника. Эта гелевая фракция может также найти применение при лечении других кишечных расстройств или для поддержания нормальной функции кишечника, а также в качестве пищевого загустителя или заменителя жира.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается гелеобразующая фракция шелухи семян подорожника, которая выдерживает микробную ферментацию (является стойкой к ней) при проходе через моножелудочный желудочно-кишечный тракт млекопитающих. Среди других компонентов гелевая фракция содержит преимущественно ксилозу и арабинозу при весовом отношении в сухом состоянии (при отношении сухих масс), составляющем преимущественно около 3,5). Фракция содержит также существенно ограниченные количества других сахаров, например всего около 2,5%-13,5% рамнозы, галактозы, глюкозы и уроновых кислот. Более конкретно, гелеобразующая фракция имеет следующий состав сахара, выраженный в процентах полного содержания сахаров:
ориентировочно от 0,5% до 4% рамнозы;
ориентировочно от 19% до 22% арабинозы;
ориентировочно от 68% до 76% ксилозы;
ориентировочно от 0% до 0,5% маннозы;
ориентировочно от 1% до 2% галактозы;
ориентировочно от 0% до 1% глюкозы;
ориентировочно от 1% до 6% уроновых кислот
При последующей очистке гелеобразующая фракция еще более обедняется в отношении рамнозы, глюкозы и уроновых кислот.
Гелеобразующая фракция обладает также высокой вязкостью и при 0,2% концентрации в формамиде имеет кажущуюся вязкость по меньшей мере 500 с, преимущественно 750 с, а еще лучше 850 с. Фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и образует гель при подкислении раствора до достижения конечного рН, составляющего около 4,5.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается в преимущественном способе получения гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника получение также отдельной углеводной фракции. Эта фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и остается растворимой при подкислении раствора до рН, составляющего около 4,5. Эта фракция содержит ксилозу и арабинозу при их отношении по меньшей мере около 4:1, а также содержит по меньшей мере около 12% (по весу) рамнозы и по меньшей мере около 15% (по весу) уроновых кислот.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ фракционирования шелухи семян подорожника для получения гелеобразующей фракции и дополнительной углеводной фракции. Этот способ предусматривает: (а) перемешивание шелухи в присутствии химического восстановителя в водном щелочном растворе, который содержит ориентировочно от 0,15 до 1,0 М (преимущественно 0,15-0,5 М, предпочтительно 0,15-0,4 М, еще лучше 0,15-0,3 М, а еще лучше 0,15-0,2 М) гидроксильных ионов, за счет чего осуществляется фракционирование шелухи на растворимую в щелочи фракцию и на не растворимую в щелочи фракцию; (b) удаление не растворимой в щелочи фракции; (с) подкисление растворимой в щелочи фракции до рН, составляющего ориентировочно от 3 до 6 (преимущественно ориентировочно от 4 до 5, а еще лучше около 4,5), что приводит к загущению гелеобразующей фракции; и (d) отделение гелевой фракции, например, при помощи центрифугирования или иных средств от дополнительной углеводной фракции, которая находится в подкисленном растворе. В соответствии с предпочтительными вариантами способ дополнительно предусматривает промывку гелевой фракции водным или забуференным раствором и обезвоживание промытой гелевой фракции.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается гелеобразующая фракция из шелухи семян подорожника, которая получена при помощи указанного выше способа. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предлагается также дополнительная углеводная фракция.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются альтернативные способы получения полисахаридной фракции, которая содержит упомянутую выше гелеобразующую фракцию. Такую фракцию получают за счет жидкостной экстракции с использованием формамида, диметилсульфоксида или 4-метилморфолин N-оксида (50% раствор в воде). Обработанный растворителем материал центрифугируют для выделения растворимых материалов, которые затем вливают в этанол до достижения концентрации 80% этанола. Образующийся осадок аналогичен по составу растворимой в щелочи гелеобразующей фракции.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются фармацевтические препараты для лечения запоров или других расстройств кишечника, а также для снижения уровней холестерина в сыворотке крови пациентов. Эти препараты имеют состав с эффективными дозами гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением. Предлагаются также способы лечения пациентов с указанными заболеваниями, которые предусматривают назначение (прием) фармацевтических препаратов в соответствии с настоящим изобретением.
Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующего детального описания и приведенных далее примеров.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается высокополимеризованная гелеобразующая фракция из шелухи семян подорожника, которая в высшей степени полезна при лечении и профилактике запоров, а также в качестве средства для снижения содержания холестерина. Эта гелевая фракция остается главным образом неферментированной (несброженной) во время прохождения по желудочно-кишечному тракту (Пример 6 и Пример 7) и способствует работе перистальтики кишечника за счет различных средств, в том числе за счет повышения влажности содержимого и общей массы стула, а также за счет придания стулу характеристики склизкости, которая облегчает прохождение стула (Пример 6).
Было обнаружено, что гелеобразующая фракция из шелухи семян подорожника может быть использована в качестве средства для снижения содержания холестерина. В связи с этим указанная гелеобразующая фракция может быть использована изолированно или в сочетании с другими активными веществами для терапевтического лечения для снижения содержания холестерина в сыворотке крови.
Стул крыс и людей, которые получали шелуху семян подорожника, иногда является гелеобразным (Cabotaje et al., 1994, см. выше; Пример 6). Однако попытки очистки и характеризации (описания) гелеобразующего материала (Kennedy et al., Carbohydrate Res. 75:265-274, 1979; Sandhu et al., Carbohydrate Res. 93:247-259, 1981) не были успешными, причем никто не доказал, что имеющая высокую степень очистки гелеобразующая фракция имеет характеристики, описанные в соответствии с настоящим изобретением. Способ фракционирования шелухи семян подорожника, разработанный в соответствии с настоящим изобретением, ведет к получению неожиданных результатов, которые противоречат ранее опубликованным (например, Kennedy et al., 1979, см. выше), причем растворимая в щелочи фракция шелухи семян подорожника может быть дополнительно фракционирована для получения имеющей высокую вязкость гелевой фракции (которая именуется здесь как «Фракция В») и второй углеводной фракции (которая именуется здесь как «Фракция С»), имеющей другой состав, что далее объясняется более подробно. Как вязкая гелеобразующая Фракция В, так и дополнительная Фракция С являются растворимыми в различных растворах, в том числе в разбавленной и концентрированной щелочи, в формамиде, диметилсульфоксиде и в 4-метилморфолин N-оксиде (50% раствор в воде); следовательно, эти две фракции могут быть разделены на основании их характеристик растворимости. Однако дальнейшее разделение фракций ранее осуществить или не удалось (например, не удалось осуществить дальнейшее разделение экстрагируемой крепкой щелочью гелеобразующей фракции, Kennedy et al., 1979; см. выше), или это осталось неисследованным. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании соответствующей методики первой экстракции для получения продукта, который содержит фракции В и С вместе, эти фракции могут быть разделены за счет подкисления раствора, который содержит смесь указанных фракций. Фракцию В сгущают для последующего выделения из подкисленной смеси при помощи центрифугирования, в то время как Фракция С остается растворимой в кислоте.
Описание углеводных полимеров
Вязкая гелеобразующая фракция шелухи семян подорожника (Фракция В) в соответствии с настоящим изобретением в первую очередь содержит ксилозу и арабинозу. В соответствии с предпочтительным вариантом гелеобразующая фракция содержит по меньшей мере 50% ксилозы и арабинозы по весу, преимущественно по меньшей мере 75% ксилозы и арабинозы по весу, а еще лучше по меньшей мере 85% ксилозы и арабинозы по весу. Гелеобразующая фракция имеет кажущуюся вязкость, определяемую в соответствии с методом Примера 3, которая составляет по меньшей мере 500 сек, преимущественно по меньшей мере 750 сек, а еще лучше по меньшей мере 850 сек. Гелеобразующая фракция дополнительно имеет дефицит рамнозы, галактозы и уроновых кислот по сравнению с ксилозой. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к рамнозе превышает 50, преимущественно это отношение превышает 60, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 65. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к галактозе превышает 25, преимущественно это отношение превышает 35, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 42. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к уроновой кислоте превышает 15, преимущественно это отношение превышает 25, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 35. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к арабинозе во Фракции В составляет от 2,5 до 4,5, преимущественно это отношение составляет от 3,0 до 4,0, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение составляет от 3,25 до 3,75.
Растворимая в кислоте фракция шелухи семян подорожника (Фракция С) также имеет высокое содержание ксилозы и арабинозы. В соответствии с предпочтительным вариантом растворимая в кислоте фракция имеет по меньшей мере 25% ксилозы и арабинозы по весу, преимущественно по меньшей мере 40% ксилозы и арабинозы по весу, а еще лучше по меньшей мере 45% ксилозы и арабинозы по весу. Несмотря на то, что Фракция С имеет кажущуюся вязкость, аналогичную вязкости Фракции В, она не имеет гелеобразующего свойства Фракции В. Фракция С дополнительно имеет высокое содержание рамнозы, галактозы и уроновых кислот по сравнению с ксилозой. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к рамнозе составляет менее 6,0, преимущественно менее 4,5, а еще лучше, если указанное весовое отношение составляет менее 3,0. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к галактозе составляет менее 40, преимущественно указанное отношение составляет менее 30, а еще лучше, если указанное отношение составляет менее 25. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к уроновой кислоте составляет менее 30, преимущественно указанное отношение составляет менее 10, а еще лучше, если указанное отношение составляет менее 5,0. В соответствии с предпочтительным вариантом весовое отношение ксилозы к арабинозе во Фракции С составляет более 3,0, преимущественно указанное отношение составляет более 4,0, а еще лучше, если указанное отношение составляет более 4,5.
Приготовление фракций шелухи семян подорожника
В соответствии с настоящим изобретением предлагаются также способы фракционирования шелухи семян подорожника для получения описанных здесь выше очищенных и разделенных фракций. В своей наиболее основной форме способ включает в себя следующие операции:
1. Образование суспензии шелухи семян подорожника в разбавленном щелочном водном растворе (содержащем преимущественно 0,15-0,2 М гидроксильных ионов), содержащем восстановитель, в котором некоторые порции материала шелухи семян подорожника будут растворяться, в то время как некоторые другие порции останутся нерастворимыми.
2. Удаление не растворимого в щелочи материала (который именуется здесь как «Фракция А»), например, за счет центрифугирования.
3. Подкисление растворимой в щелочи фракции операции 1 до рН в диапазоне от 3 до 6, а преимущественно до значения 4,5, чтобы получить гель (Фракция В) и растворимую в кислоте фракцию (Фракция С).
4. Выделение геля из подкисленного раствора, например, при помощи центрифугирования.
Один из примеров этого способа описан в Примере 1. Существует множество вариантов указанного способа, которые однако существенно не изменяют природу выделенного продукта. Эти варианты подробно описаны ниже.
Операция растворения (солюбилизации) в щелочи имеет множество вариаций. Описанный в Примере 1 способ является усовершенствованием известных ранее способов растворения. Прежде для растворения в щелочи полисахаридов шелухи семян подорожника использовали концентрированные щелочные растворы (например, 1,2 М NaOH, Kennedy et al., 1979, см. выше) без восстановителя. Учитывая жесткую природу такой обработки, приводящую к частичной деградации цепей полисахаридов в гелеобразующей фракции, авторы настоящего изобретения показали, что может быть получена гелеобразующая фракция, предположительно в более подходящей для последующего фракционирования форме, с использованием намного менее концентрированного щелочного раствора и подходящего химического восстановителя, такого как борогидрид. Несмотря на то, что может быть использован щелочной раствор до 4 N, концентрация основания при щелочном растворении преимущественно составляет по меньшей мере 0,15 N и не более чем 1,0 N; предпочтительно по меньшей мере 0,15 N и не более чем 0,5 N; а еще лучше по меньшей мере 0,15 N и не более чем (0,2-0,3) N. При щелочной экстракции может быть использовано любое стандартное основание, в том числе (но без ограничения) гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, гидроксид аммония и тетраметил гидроксид аммония.
Химический восстановитель, такой как борогидрид, должен быть добавлен при проведении операции щелочного растворения для сведения к минимуму катализируемой основанием деполимеризации. В Примере 1 использована концентрация 1 г/л борогидрида натрия, однако диапазон эффективных концентраций составляет ориентировочно от 50 мг/л до 10 г/л. В соответствии с предпочтительным вариантом концентрация борогидрида натрия составляет по меньшей мере 100 мг/л и не более чем 4 г/л, преимущественно по меньшей мере 500 мг/л и не более чем 2 г/л, а еще лучше по меньшей мере 800 мг/л и не более чем 1,2 г/л. При проведении этой операции могут быть использованы и другие формы борогидрида, в том числе (но без ограничения) борогидрид лития, борогидрид калия и цианоборогидрид натрия.
Степень начальной обработки шелухи семян подорожника может влиять на проведение операции щелочного растворения, что известно специалистам в данной области. Важно, чтобы материал шелухи семян подорожника был обработан таким образом, чтобы он содержал небольшие куски, что позволяет легче разделять вязкие полисахариды от нерастворимых и волокнистых материалов стенок клеток. В Примере 1 используют молотую шелуху семян подорожника, однако может быть использован любой другой процесс измельчения растительного материала, причем такие процессы хорошо известны сами по себе.
Отношение количества материала шелухи семян подорожника к объему щелочного раствора имеет важное значение для эффективной солюбилизации (растворения) фракций полисахаридов. В Примере 1 вводят 2 г шелухи семян подорожника в 400 мл щелочного раствора, однако это отношение может варьировать без существенного влияния на солюбилизацию. Например, можно вводить ориентировочно от 0,1 до 4 г шелухи семян подорожника в 400 мл щелочного раствора. Кроме того, время солюбилизации (в диапазоне 0,5 - 24 часа) можно варьировать для оптимизации процедуры при температуре в диапазоне 4-50°С.
Операция два способа в соответствии с настоящим изобретением предусматривает разделение не растворимых в щелочи материалов от растворимых в щелочи материалов. В Примере 1 для решения этой задачи используют центрифугирование. Однако могут быть использованы и различные другие процедуры и их вариации, которые не изменяют существенно выделенные (изолированные) растворимые материалы. Специалисты легко поймут, каким образом следует изменить время и усилие центрифугирования для адаптации операции разделения к различным роторам центрифуги, к различным растительным материалам и к различным щелочным растворам. Для осуществления операции разделения могут быть использованы и другие методики, которые хорошо известны сами по себе, причем некоторые из этих методик лучше подходят для промышленного использования способа в соответствии с настоящим изобретением. Среди представляющих интерес способов разделения можно указать (но без ограничения) проточное центрифугирование или фильтрацию (с перемешиванием). В Примере 1 дополнительно предусмотрены промывка нерастворимых материалов при помощи щелочного раствора и повторное разделение для повышения выхода растворимых в щелочи материалов. Указанная операция промывки не является обязательной, но может быть преимущественно использована для повышения выхода материала.
Операция три предусматривает подкисление растворимых в щелочи материалов, полученных при проведении операции два. В Примере 1 это осуществлено путем добавления ледяной уксусной кислоты в объединенные растворимые в щелочи материалы, пока рН не достигнет значения 4,5. Диапазон значений рН, применимый при этой кислотной солюбилизации, может варьировать без существенного влияния на процедуру. В соответствии с предпочтительным вариантом используют значение рН в диапазоне от 3 до 6, преимущественно в диапазоне от 4 до 5, а еще лучше, если рН равно ориентировочно 4,5, как это использовано в Примере 1. Выбор кислоты также подвержен вариациям. Среди прочих при проведении операции три могут быть использованы уксусная, соляная, серная, щавелевая, трихлоруксусная и трифторуксусная кислоты. При проведении операции три, как и при проведении операции один, могут варьировать время, температура и другие параметры солюбилизации, однако преимущественно эту операцию проводят при окружающей температуре в течение ориентировочно 2 часов.
Операция четыре предусматривает разделение не растворимого в кислоте гелеобразного материала (Фракция В) от растворимых в кислоте материалов (Фракция С). Для проведения указанного разделения преимущественно используют центрифугирование. Для повышения эффективности разделения можно также использовать промывку нерастворимой массы геля (например, в воде, в буферном или ином подходящем растворителе).
В качестве альтернативы центрифугированию при проведении операции четыре могут быть использованы два других подхода, которые годятся для промышленного выпуска препаратов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что гелеобразный материал Фракции В всплывает, причем гель имеет хорошую целостность. Поэтому гель может быть сцежен или снят с поверхности подкисленной смеси при помощи лопатки, например, такого типа, которую используют для снятия творога (створоженного молока) при производстве сыра. После этого гелевый материал помещают в отдельный резервуар, где он может быть промыт при проведении дополнительной операции очистки. Альтернативно, сосуд, в котором находится подкисленный раствор с плавающим на его поверхности гелем, может быть дренирован снизу за счет силы тяжести или при приложении небольшого вакуума, так чтобы гель оставался на дне сосуда. И в этом случае гель может быть дополнительно промыт.
При подготовке Фракции В и Фракции С для хранения и/или для использования могут быть применены различные процедуры. Для хранения могут быть использованы полисахаридные препараты Фракций В и С или же эти фракции могут хранится в гидратированной форме. При хранении в гидратированной форме могут быть добавлены консерванты или бактериостатические вещества. Для хранения особенно предпочтительным является использование сушки полисахаридных препаратов. В соответствии с предпочтительным вариантом Фракцию В и Фракцию С обезвоживают за счет обработки 95% этанолом, промывают диэтиловым эфиром и сушат. Обезвоживание указанных фракций может быть также осуществлено при помощи других растворителей, таких как метанол, ацетон или изопропиловый спирт. Для сушки (обезвоживания) указанных фракций может быть также использован любой стандартный способ дегидратации (например, выпаривание, лиофилизация) при условии поддержания температуры ниже ориентировочно 60°С, а преимущественно ниже ориентировочно 40°С.
Использование фракций шелухи семян подорожника
Фракции шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве терапевтических препаратов. Было показано, что вязкая гелеобразующая фракция, а именно Фракция В, является эффективной в качестве слабительного, а также в качестве средства снижения содержания холестерина. Этот материал может быть использован изолированно или в сочетании с другими активными веществами в терапевтических или профилактических препаратах, при запорах, диарее и/или при повышенном содержании холестерина в сыворотке крови. Такие препараты в виде таблеток, капсул или жидкостей для приема перорально могут содержать гелеобразующую фракцию. В соответствии с предпочтительным вариантом удобной для приема в виде таблеток или капсул является сухая форма геля, причем после приема внутрь (проглатывания) пациентом происходит регидратация геля. Что касается регидратации, то следует сказать, что гелеобразующая фракция обладает особенно предпочтительными характеристиками гидратации. После выделения и сушки гелеобразующая фракция имеет малую скорость гидратации. Основываясь на наблюдениях, полученных при экспериментах на крысах, можно определенно полагать, что введенный гель становится гидратированным в верхней части кишечника, где он оказывает свое действие по снижению содержания холестерина. Эта задержка гидратации является благоприятной, так как за счет этого снижается или исключается риск преждевременной гидратации, например, в пищеводе.
Гелеобразующие препараты могут быть также введены в пищевые продукты. Так как активные полисахариды были отделены (очищены) от других компонентов клеток растений при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением, то они не имеют неприятного вкуса, причем нет необходимости введения их значительных количеств, что требуется при применении известных в настоящее время препаратов из шелухи семян подорожника.
Хорошо известно, что несброженный гелеобразующий полисахарид из шелухи семян подорожника имеет слабительное действие в моножелудочном желудочно-кишечном тракте млекопитающих. Для взрослого человека необходимая доза гелеобразующей фракции в сухом виде составляет около 2 г при приеме от одного до трех раз в день, что позволяет поддерживать регулярную деятельность кишечника и предупреждать запоры.
Как это описано в Примере 4, гелеобразующая фракция шелухи семян подорожника может быть использована в качестве средства для снижения содержания холестерина. И в этом случае указанная фракция может быть использована изолировано или в сочетании с другими активными веществами в качестве терапевтического средства для снижения содержания холестерина. Для взрослого человека необходимая доза Фракции В в сухом виде составляет ориентировочно от 3 до 7 г в день. Фракции В и С шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы также в качестве пищевых добавок. Они могут быть использованы в качестве загустителей, формирователей геля и наполнителей при приготовлении пищи. Они также могут быть использованы в сочетании с другими пищевыми добавками для получения систем имитации жиров. Так как полисахаридные препараты в соответствии с настоящим изобретением являются частично неперевариваемыми, они дополнительно являются низкокалорийными, снижающими содержание холестерина и имеющими слабительные свойства. Полисахаридные препараты Фракций В и С могут быть использованы в различных пищевых продуктах, в которых в настоящее время используют камедь и растительный клей.
Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующих примеров, не имеющих ограничительного характера.
ПРИМЕР 1
Фракционирование шелухи семян подорожника
Молотая шелуха семян подорожника (2 г) в атмосфере азота в течение 90 минут была перемешана с 0,2 N гидроксидом калия (400 мл), содержащим борогидрид натрия (400 мг). Смесь центрифугировали в течение 20 минут при 23,500×g. Надосадочная жидкость была сцежена с нерастворимой фракции, которая осаждалась в колбе центрифуги. Нерастворимую фракцию (именуемую как «Фракция А») перемешивали со свежим раствором гидроксида калия и борогидрида натрия (100 мл) дополнительно в течение 15 минут и повторно центрифугировали. Надосадочные жидкости после двух операций центрифугирования объединяли. Значение рН объединенных надосадочных жидкостей доводили до 4,5 при помощи ледяной уксусной кислоты при перемешивании при температуре окружающей среды, после чего центрифугировали в течение 60 минут при 25,500×g. Надосадочная жидкость (Фракция С) была сцежена с массы геля (Фракция В), которая осаждалась в колбе центрифуги. Гель был осторожно промыт водой (50 мл) для удаления налипшей надосадочной жидкости, причем эта промывочная вода была добавлена в надосадочную жидкость. Гелевая фракция была обезвожена за счет обработки 95% этанолом, промыта диэтиловым эфиром и высушена.
Ранее обезвоживания Фракции В в некоторых случаях проводят дополнительную очистку Фракции В путем повтора описанных здесь выше операций щелочной солюбилизации и подкисления. При этом гель повторно суспендируют в 0,2 N КОН, подкисляют до рН 4,5 и центрифугируют для извлечения геля.
ПРИМЕР 2
Определение состава сахара Фракций В и С шелухи семян подорожника
Было проведено определение составов сахара гелевой фракции (Фракция В) и растворимой в кислоте фракции (Фракция С), полученных по способу, описанному в Примере 1. Результаты сведены в Таблицу 1.
| Таблица 1 Состав фракций шелухи семян подорожника (вес. % в сухом состоянии) | ||||
| Шелуха семян подорожника (2 г) | Нерастворимая в щелочи (Фракция А) | |||
| Нерастворимая в кислоте (Фракция В) | Растворимая в кислоте (Фракция С) | |||
| Выход (г) | -- | 0,328 | 1,164 | 0,255 |
| Состав (вес. % в сухом состоянии) | ||||
| Рамноза | 3,17 | 0,49 | 0,95 | 14,86 |
| Арабиноза | 19,93 | 33,58 | 19,45 | 8,11 |
| Ксилоза | 49,15 | 3,16 | 67,20 | 38,79 |
| Манноза | 2,17 | 10,84 | 0,0 | 0,0 |
| Галактоза | 3,83 | 12,86 | 1,59 | 1,89 |
| Глюкоза | 4,37 | 19,34 | 0,37 | 0,75 |
| Уроновые кислоты | 5,41 | 3,58 | 1,74 | 16,84 |
| Отношения (вес. % в сухом состоянии) | ||||
| Ксилоза/ Рамноза | 15,50 | 6,45 | 70,70 | 2,61 |
| Ксилоза/ Арабиноза | 2,47 | 0,094 | 3,46 | 4,78 |
| Ксилоза/ Галактоза | 12,83 | 0,25 | 42,26 | 20,52 |
| Ксилоза/ Уроновые кислоты | 9,08 | 0,88 | 38,62 | 2,30 |
ПРИМЕР 3
Измерение вязкости гелеобразуюшей фракции шелухи семян подорожника
Была определена кажущаяся вязкость гелеобразующей фракции (Фракция В) шелухи семян подорожника. Раствор для определения кажущейся вязкости был получен путем перемешивания в течение ночи 0,2% раствора сухой фракции в формамиде. После этого раствор при перемешивании нагревали до 70°С в течение 5 минут, а затем перемешивали 1 час при окружающей температуре. Измерение кажущейся вязкости производили с использованием вискозиметра с пипеткой (Ostwald Dropping Pipet Viscometer, Cat. № 13-695, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Вязкость раствора измеряли три раза и находили среднее значение.
| Таблица 2 Кажущаяся вязкость Фракции В шелухи семян подорожника | |
| Кажущаяся вязкость (сек) | |
| Растворимая в щелочи и не растворимая в кислоте фракция (Фракция В) | 876 |
| Формамид (только растворитель) | 303 |
ПРИМЕР 4
Экстракция растворителем компонентов шелухи семян подорожника
Компоненты шелухи семян подорожника могут быть также получены путем экстракции различными растворителями. Среди таких растворителей можно указать формамид, диметилсульфоксид и 4-метилморфолин N-оксид (50% раствор в воде).
Молотую шелуху семян подорожника (2 г) добавляли небольшими порциями в выбранный растворитель (200 мл) при перемешивании в течение 30-60 мин. В соответствии с одной из методик смесь перемешивали в течение двух дней при комнатной температуре, а затем центрифугировали в течение 40 мин при 27,000×g. В соответствии с альтернативной методикой смесь перемешивали при повышенной температуре (до 60°С), при этом продолжительность перемешивания может быть снижена до 12 часов.
Гранулированный нерастворимый материал повторно суспендировали и перемешивали в дополнительном растворителе (50 мл) в течение 30 мин, а затем повторно центрифугировали. Добавляли объединенные надосадочные жидкости при перемешивании в 95% этанол (5 объемов) и доводили конечную концентрацию этанола до 80%. Этанол на этом этапе может быть замещен метанолом, изопропиловым спиртом, ацетоном или другими аналогичными растворителями. Осадок собирали и промывали абсолютным этанолом, а затем диэтиловым эфиром, после чего сушили.
Полученный не растворимый в этаноле осадок аналогичен по составу растворимому в щелочи материалу, описанному в Примерах 1-3. Составы сахаров фракций, полученных при помощи описанной первоначальной экстракции растворителем, приведены в Таблице 3.
| Таблица 3 Составы сахаров фракций (вес. % сухой массы) | |||
| Формамид | 4-метилморфолин N-оксид | Диметилсульфоксид | |
| Рамноза | 3,03 | 3,25 | 0,48 |
| Арабиноза | 18,95 | 16,54 | 17,38 |
| Ксилоза | 65,56 | 57,47 | 65,33 |
| Манноза | 0,05 | 0,0 | 0,12 |
| Галактоза | 1,54 | 1,50 | 1,64 |
| Глюкоза | 0,21 | 0,22 | 0,34 |
| Уроновые кислоты | 4,30 | 4,69 | 0,94 |
ПРИМЕР 5
Влияние шелухи семян подорожника и ее фракций на реабсорбцию желчных кислот из тонких кишок крыс
Одним из основных участков гипохолестеринового действия пищевой клетчатки (за счет действия на желчные кислоты) является нижняя часть тонких кишок (подвздошная кишка). Желчные кислоты в тонкой кишке работают как эмульгаторы, способствующие перевариванию и абсорбции жира. Они синтезируются из холестерина в печени, хранятся в желчном пузыре и поступают в тонкую кишку при еде. Желчные кислоты сохраняются за счет реабсорбции в подвздошной кишке и рециркулируются назад в печень через кровь. Переваривание пищи и абсорбция влаги протекают по мере перемещения пищевого материала в кишечнике таким образом, что нижняя треть тонкой кишки в просвете содержит главным образом непереваренный материал (то есть волокна) и некоторую часть жидкости. В настоящее время известно, что многие вязкие растворимые волокна сохраняют свою вязкость при проходе через верхний желудочно-кишечный тракт и накапливаются главным образом в нижней части кишечника. Эти растворимые волокна эффективно препятствуют реабсорбции желчных кислот в подвздошной кишке, которая является единственным участком кишечника, обеспечивающим необходимые транспортирующие протеины для желчных кислот. Желчные кислоты выводятся со стулом и восполняются за счет нового синтеза в печени из холестерина крови, что эффективно снижает уровни холестерина в крови.
У подопытных крыс хирургическим путем удаляли слепую кишку и ободочную кишку и соединяли конец подвздошной кишки с прямой кишкой. После восстановительного периода 7-10 дней эти животные выделяли мягкий отформованный материал, который называется идеальными испражнениями (экскретами). Идеальные испражнения являются более предпочтительными, чем стул, для измерения воздействия вещества на абсорбцию желчных кислот, так как бактериальное трансформирование желчных кислот в толстой кишке может снижать наполовину их содержание в стуле.
Тестовая (испытательная, пробная) пища скармливалась группам крыс, каждая из которых состояла из четырех крыс. Тестовая пища содержала 5% волокна либо (1) шелухи семян подорожника (PSH); либо (2) целлюлозы (в качестве контроля) или (3) количество выбранной Фракции (А, В или С) шелухи семян подорожника, отдельно или в сочетании, которое содержится в 5% шелухи семян подорожника. Тестовая пища также содержала неперевариваемый маркер, так что концентрация маркера в идеальных испражнениях может быть использована для расчета количества тестовой пищи, образовавшей идеальные испражнения.
Результаты анализа после приема тестовой пищи приведены в Таблице 4.
| Таблица 4 Количество выведенных желчных кислот после приема тестовой пищи, содержащей различные растворимые волокна. | |
| Тестовая пища | Количество выведенных желчных кислот* (мкмоль/г тестовой пищи) |
| Целлюлоза | 8,32±2,42 |
| Немолотая PSH | 18,41±2,61 |
| Фракция А | 9,07±2,75 |
| Фракция В | 16,08±3,20 |
| Фракция С | 13,76±2,71 |
| Совместно А, В, С | 15,65±1,37 |
* Среднее ± SEM (среднеквадратическая погрешность), n=4 крысы
Увеличение экскреции желчных кислот свидетельствует о сопутствующем снижении желчных кислот, реабсорбируемых в кровь. Вещество, которое препятствует реабсорбции желчных кислот в кровь из подвздошная кишки, считается имеющим гипохолестериновые свойства. Приведенные выше результаты показывают, что гипохолестериновые свойства имеет шелуха семян подорожника (PSH), а в особенности удобно вводимая гелеобразующая фракция (Фракция В), которая по гипохолестериновому действию в основном эквивалентна целой шелухе семян подорожника.
ПРИМЕР 6
Несброженный гелевый компонент шелухи семян подорожника активирует перистальтику кишечника людей и действует в качестве смазочного материала.
Кроме увеличения веса стула, добавление в пищу шелухи семян подорожника (PSH) создает стул, который является склизким и гелеобразным. В этом примере показано, что гелевая фракция шелухи семян подорожника не подвергается микробной ферментации и обладает характеристиками, которые активируют перистальтику кишечника.
Материалы и методы
Описание эксперимента. Исследование включает в себя 3 периода: фазу скрининга, PSH период и основной период. В ходе фазы скрининга пациенты (испытуемые) потребляли 15 г в день Metamucil® (5 г за один прием) (Smooth Texture Metamucil®, The Procter & Gamble Co., Cincinnati, ОН) вместе с их обычной пищей в течение 12 дней для получения дополнительной пищевой клетчатки в качестве 8,8 г в день. Пациентов просили заполнить опросные листки в 9-12 дни для оценки соответствия плану (протоколу) исследования и для получения более подробной информации относительно типичного приема пищи. От каждого пациента в течение 9-12 дней также получали два стула для оценки соответствия плану исследования. В течение последующих 7 дней (13-19 дни исследования) пациенты имели заданную диету с малым содержанием волокон и получали при каждом приеме пищи добавочно PSH и неперевариваемый маркер (полуторная окись хрома, 200 мг на один прием пищи). В течение последующих двух недель (20-33 дни исследования) пациенты имели свою обычную диету, что позволяло вывести все содержимое PSH. В течение 7 дней (34-40 дни исследования) основного периода пациенты получали такую же диету с малым содержанием волокон и неперевариваемый маркер, но без добавки PSH. Этот план эксперимента был основан на результатах предварительного исследования, при проведении которого определили, что необходимо иметь 7-10 дней приема добавки для того, чтобы достичь высокого уровня экскреции PSH. Предварительные наблюдения также показали, что требуется 7-10 дней после приема последней тестовой дозы для того, чтобы обеспечить полную экскрецию PSH. Поэтому PSH период для сбора данных сопровождался 12 днями потребления PSH, что образует фазу скрининга, причем перекрестный эксперимент не проводили.
В течение двух недель приема контролируемой диеты ежедневно собирали данные относительно стула и качества работы кишечника, приема пищи и активности. Это исследование получило разрешение на применение от комитета College of Agricultural and Life Sciences Human Subjects Committee, University of Wisconsin-Madison.
Пациенты: В фазе скрининга приняли участие 21 из 33 человек, которые ответили на объявление в местной прессе. Для исключения из фазы скрининга применялись следующие критерии: непереносимость лактозы, разборчивость в приеме пищи и нежелание принимать специфическую пищу. В ходе фазы скрининга была произведена оценка покладистости пациентов, их надежности, доступности и отношения к эксперименту. В результате для участия в исследовании были отобраны 15 пациентов (8 мужчин и 7 женщин), из которых 14 дошли до конца исследования (Данные от одного пациента, который предположительно сдавал не все анализы кала в течение заданных периодов сбора, были исключены из конечного анализа). Возраст пациентов составляет 18-30 лет (среднее ± SE (среднеквадратическая погрешность) 24±1 год) и они имели нормальный вес для своего роста (коэффициент массы тела 24,2±0,9).
Пища. Все пациенты получали заданную пищу в течение фазы с добавкой PSH и основной фазы, причем прием пищи являлся частью исследования. Завтрак пациенты принимали дома, причем он состоял из зерновых Rice Krispies®, снятого молока, апельсинового сока, белого хлеба, маргарина или масла и желе (джема). Обед (ленч) включал в себя бутерброд, свежие фрукты и молоко. Вечером пациенты ели мясо, потребляли источник крахмала, салат и десерт. Пациенты потребляли заданное количество пищи, причем количество хлеба и молока варьировалось в зависимости от необходимой дневной энергии. Допускался также прием ограниченного количества не содержащих волокон легких закусок и спиртного. Кофе допускалось по желанию пациента. Вечерний прием пищи проходил под наблюдением персонала. Потребление добавки (PSH) и неперевариваемого маркера проверяли ежедневно при замене пустых пакетов на новые с порцией добавки на следующий день.
Сбор данных и проб. Проводили индивидуальный сбор всех стулов в течение PSH фазы и основной фазы исследования, причем содержимое сразу помещали в холодильник, взвешивали и замораживали в течение 8 часов после сбора. Пациенты производили анализ каждого стула по 9-бальной системе со следующими оценками: -4 несовместим (не соответствует) больше всего, -3 несовместим чрезвычайно, -2 несовместим очень сильно, -1 несовместим, 0 нейтральный, +1 соответствует, +2 соответствует очень сильно, +3 соответствует чрезвычайно и +4 соответствует больше всего.
Пациенты ежедневно заполняли опросные листки приема пищи для проверки потребления компонентов контролируемой диеты. Пациенты ежедневно заполняли также формуляры физической активности для оценки основных изменений дневного распорядка. Дневной распорядок каждого участника исследований оставался неизменным в течение двух недель отбора проб.
Анализы. Стулы экскреции в течение 4-8 дней каждого периода контролируемой диеты (16-20 и 37-41 дни исследования) оттаивали, объединяли для каждого пациента при помощи перемешивания вручную и вновь замораживали до последующего использования или обработки, что описано ниже. Аликвотные дубликаты (3 г) высушивали (16 часов, 70°С) для определения содержания (Marlett et al., JNCI 76: 1065-1070, 1986). Содержание хрома в стуле определяли с использованием модификации (Hosig et al., Cereal Chem. 73: 392-398, 1996) метода Guncaga et al. (Clin. Chim. Acta 47: 77-81, 1974). Порции объединенного стула были подвергнуты лиофилизации для определений на дубликате (25 мг) содержания нейтрального и аминного сахара при помощи газовой хроматографии как производных ацетата альдита после кислотного гидролиза и восстановления (Kraus et al., J. Chromatog. 513:71-81, 1990; Monsma et al., Appl. Environ. Microbiol. 58:3330-3336, 1992), а также для анализа уроновых кислот с использованием колориметрического количественного анализа (Blumenkranz et al., Anal. Biochem. 54: 484-489, 1973). Водный экстракт оттаявшего объединенного стула был использован для определения относительной вязкости стула на вискозиметре (Ostwald dropping pipet viscometer, Cat. № 13-695, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Водные фракции были получены при помощи встряхивания и перемешивания аликвотов (2 г) с водой (10 мл), центрифугирования (30,000×g, 30 мин, 4°С), сбора и повторного центрифугирования надосадочной жидкости.
Процедура фракционирования для выделения компонента, ответственного за характеристики геля, была применена к оттаявшим аликвотам объединенного стула от каждого пациента для обоих периодов диеты. Аликвоты (25 г) были делипидированы и обработаны основанием (0,18 N КОН), содержащим борогидрид натрия (0,026 М) для сведения к минимуму катализируемой основанием деполимеризации. Растворимая в щелочи фракция была подкислена до рН 4,5 при помощи ледяной уксусной кислоты, причем осадок (Фракция 1) был восстановлен за счет добавления в этанол. Фракция 1 была суспендирована в воде, нагрета до кипения, центрифугирована, причем объем надосадочной жидкости был уменьшен за счет выпаривания. Концентрат вводили в этанол для получения конечной концентрации спирта 70%. Волокнистую массу, которая была образована добавлением концентрированной надосадочной жидкости в этанол, промывали этанолом и эфиром и подвергали вакуумной сушке. Полученный материал соответствует гелеобразной компоненте PSH стулов (Фракция 2). Отметим, что при проведении анализа проб контрольного стула осадок не образуется. На аликвотах указанного материала определяют в соответствии с ранее описанным содержания нейтрального и аминного сахара и концентрации уроновой кислоты.
Макропитательность и содержание энергии планируемого меню, а также ежедневный прием пищи каждым пациентом рассчитывают с использованием таблиц состава питательных веществ. Прием пищевой клетчатки рассчитывают из записей приема пищи с использованием детальной базы данных относительно состава волокна и композиции пищи. Суммы дневных приемов для 2-6 дней каждого периода контролируемой диеты (14-18 и 35-39 дни) используют для введения нейтральных сахаров (глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннозы, галактозы) и уроновых кислот, что необходимо для определения кажущейся усваиваемости сахаров, полученных из волокна. Состав сахара PSH добавки также определяли при помощи газовой хроматографии после кислотного гидролиза, как это описано здесь выше. Фекальную экскрецию сахаров регулировали таким образом, чтобы она отражала экскрецию 5 дней приема пищи с использованием содержания хрома в объединенном стуле (Chen et al., Am. J. Clin. Nutr. 68: 711-719, 1998). Кажущиеся усваиваемости полученных из волокна сахаров подсчитывали как разность между приемом и экскрецией и выражали в процентах приема (Chen et al., 1998, см. выше).
Статистический анализ. Данные выражали в виде среднего ± SE. Данные, собранные в течение основной фазы и фазы с PSH добавкой, сравнивали при помощи ежедневного анализа дисперсии с использованием компьютерной программы SAS, версия 6.12. Существенные различия находили при помощи разделительного теста средних наименьших существенных различий.
Результаты
Первая фракция (Фракция 1), выделенная по схеме изоляции геля, была получена как из основного стула, так и из PSH-содержащего стула. Указанная растворимая в щелочи фракция из PSH стула была существенно больше (Р<0,0005), чем полученная из основного стула. Осажденная этанолом гелеобразная фракция (Фракция 2) была выделена при помощи обработки горячей водой растворимой в щелочи фракции из стула пациентов, которые получали PSH добавку. Никакая гелеобразная фракция не была получена из стула, собранного в течение основной фазы исследования с низким содержанием волокон в пище.
Основным компонентом Фракции 2, выделенной из стула 14 пациентов, потребляющих PSH, был полисахарид, который содержит 763±18 мг сахара на грамм Фракции 2, большую часть которого составляет ксилоза (64±1%) и арабиноза (27±0%); остаток сахара содержит (%): 2 глюкозы, 3 галактозы и 3 других сахаров (фукозы, рибозы, маннозы, миоинозита, мурамовой кислоты, глюкозамина и галактозамина). Ксилоза и арабиноза в этой гелевой фракции составляют 53,9±2,1 и 31,1±1,4% соответствующего сахара в стуле.
Так как из основного стула не была получена ни одна фракция, сопоставимая с гелеобразной фракцией PSH-содержащего стула, то были приготовлены водные экстракты стула для сравнения относительной вязкости стула для двух периодов исследования. Кажущаяся вязкость водного экстракта PSH-содержащего стула была существенно выше (р<0,01), чем основного стула с малым содержанием волокон (238±38 по отношению к 128±7 с).
PSH добавка увеличивает средний дневной выход влаги с 117±7 до 188±13 г в день (Р<0,0001), средний дневной выход сухой массы с 29±2 до 37±2 г в день (Р<0,0001) и влажность стула с 74,4±0,9% до 80,2±1,0% (Р<0,05). Другие данные относительно функции толстой кишки также существенно отличаются. Средний сырой вес каждого стула увеличивается с 121±6 до 173±14 г (Р<0,005), средний сухой вес каждого стула увеличивается с 30±2 до 34±3 г (Р<0,0001), причем частота дефекации растет от 1,0±0,1 до 1,1±0,1 (Р<0,05) при получении PSH добавки.
Смешанная пищевая контролируемая диета содержит смесь полученных из волокон сахаров, причем кажущаяся усваиваемость полученных из волокон всех нейтральных сахаров составляет 67±4% в течение основного периода с малым содержанием волокон в пище. PSH препарат имеет следующий состав: (мг/г): 21 рамнозы, 127 арабинозы, 325 ксилозы, 8 маннозы, 25 галактозы, 44 глюкозы, 35 уроновых кислот, 19 золы, 18 сырого протеина и 346 покрытия. При приеме указанной добавки кажущаяся усваиваемость полученных из волокон ксилозы и арабинозы снижается (Р<0,001), в то время как усваиваемость уроновых кислот повышается (Р<0,03). Вычитание ксилозы и арабинозы, выведенных со стулом в течение основного периода исследования, из количества указанных сахаров в PSH-содержащем стуле, дает средство оценки кажущейся усваиваемости двух основных сахаров в PSH. Кажущиеся усваиваемости ксилозы, арабинозы и всех нейтральных сахаров, поставляемых за счет PSH, составляют соответственно 59±5, 28±7 и 54±9%, причем они являются переменными.
Тестовая доза PSH хорошо переносилась всеми пациентами. По сравнению с функцией толстой кишки во время основного периода исследований, прием PSH приводит к более благоприятному стулу, так как более мягкий стул легче проходит по кишечнику, легче удаляется, дает полное чувство облегчения пациента, причем стул имеет увеличенную массу. PSH добавка не оказывает воздействия на схватки в животе, на позывы к дефекации или к повторному опорожнению кишечника, а также не вызывает диарею, несмотря на то, что пациенты ощущают большее скопление газов и вспучивание. Несмотря на то, что стулы являются мягкими и отформованными, они выглядят гелеобразными и вибрируют при встряхивании. Отметим, что при потреблении PSH добавки макропитательность и содержание пищевой клетчатки в пище не изменяется.
Таким образом, в отличие от других вязких волокон, которые полностью ферментируются в ободочной кишке, PSH компонент не ферментируется. Результаты проведенного исследования показывают, что при функционировании в качестве смягчающего средства и смазочного материала несброженный гель, выделенный из PSH-содержащей пищи, представляет собой новое средство активации перистальтики кишечника при помощи пищевой клетчатки.
ПРИМЕР 7
Демонстрация слабой ферментации гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника in vitro
Для проведения ферментации in vitro (в пробирке) шелухи семян подорожника и ее фракций были использованы колбы для ферментации емкостью 40 мл. Для ферментации использовали 200 мг углеводов, из которых 31 мг получали из телячьего бульона и 45 мг из дрожжей, а остаток был образован Фракциями А, В и С шелухи семян подорожника. Фракции были выделены из молотой шелухи семян подорожника в соответствии с ранее описанным. Проба «3 фракции вместе» содержит три выделенные из шелухи семян подорожника фракции, которые повторно объединены в пропорциях, соответствующих их исходной концентрации в указанной шелухе. Инокулят представляет собой цекальные содержимые, полученные от крыс, получавших очищенную пищу, содержащую 5% (по весу) шелухи семян подорожника. Экспериментальные протоколы и анализы соответствуют методикам, описанным в публикации Monsma & Marlett (J. Nutr. 126:- 554-563, 1996). Было показано, что полученные по этой методике результаты аналогичны результатам, полученным in vivo при ферментации у людей (Monsma et al., J. Nutr. 130: 585-593, 2000). Все ферментации были подготовлены и проведены в анаэробной камере, причем их проводили дважды (дублировали).
В Таблице 5 приведены результаты ферментации in vitro. Углеводы в колбах для ферментации содержат 11 нейтральных и аминосахаров, а также уроновые кислоты; они были получены из телячьего бульона и из дрожжей тестового субстрата (смотри примечания «а» и «b» к Таблице 5). Кажущаяся ферментация сахаров из указанных источников подытожена, так чтобы выделить ферментацию тестовых фракций. Как это показано в таблице, Фракция С почти полностью ферментируется за 24 часа. В отличие от этого Фракция В ферментируется только частично (ориентировочно на 25-35%), причем ее ферментация прекращается через 48 часов. Фракция А ферментирована слабо и ее ферментация ограничена первыми 12 часами периода ферментации.
| Таблица 5 Исчезновение нейтральных сахаров в ходе ферментации in vitro шелухи семян подорожника и ее фракций | ||||||
| Полисахарид/сахар | 0 ч | 12 ч | 24 ч | 48 ч | 72 ч | |
| буфера | фракцияb | ----оставшийся %----- | ||||
| ---мг в колбе--- | ||||||
| Шелуха семян подорожника | ||||||
| Рамноза | 0,6 | 4,5 | 21 | 22 | 21 | 22 |
| Арабиноза | 0,9 | 28,1 | 84 | 84 | 76 | 82 |
| Ксилоза | 2,6 | 69,3 | 68 | 46 | 39 | 40 |
| Галактоза | 4,3 | 5,4 | 61 | 67 | 61 | 66 |
| Другие сахарас | 65,5 | 9,2 | 23 | 22 | 19 | 21 |
| 3 объединенные фракции | ||||||
| Рамноза | 0,6 | 4,4 | 19 | 22 | 22 | 22 |
| Арабиноза | 0,9 | 29,9 | 85 | 81 | 76 | 80 |
| Ксилоза | 2,6 | 70,0 | 73 | 47 | 44 | 44 |
| Галактоза | 4,3 | 5,7 | 56 | 61 | 58 | 60 |
| Другие сахара | 65,5 | 8,6 | 24 | 22 | 21 | 20 |
| Фракция С | ||||||
| Рамноза | 0,6 | 21,4 | 16 | 6 | 6 | 6 |
| Арабиноза | 0,9 | 11,6 | 47 | 19 | 18 | 19 |
| Ксилоза | 2,6 | 57,3 | 53 | 11 | 9 | 8 |
| Уроновые кислоты | 3,1 | 30,5 | 22 | следы | следы | следы |
| Другие сахара | 69,9 | 3,6 | 14 | 12 | 8 | 9 |
| Фракция В | ||||||
| Рамноза | 0,6 | 1,3 | 79 | 61 | 52 | 53 |
| Арабиноза | 0,9 | 26,8 | 93 | 85 | 78 | 76 |
| Ксилоза | 2,6 | 91,4 | 84 | 76 | 65 | 59 |
| Другие сахара | 69,9 | 2,2 | 13 | 10 | 10 | 10 |
| Фракция А | ||||||
| Арабиноза | 0,9 | 49,2 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Ксилоза | 2,6 | 4,6 | 68 | 58 | 59 | 59 |
| Манноза | 15,4 | 16,0 | 56 | 58 | 65 | 55 |
| Галактоза | 4,3 | 19,8 | 91 | 89 | 94 | 98 |
| Глюкоза | 35,3 | 29,4 | 53 | 50 | 54 | 55 |
| Другие сахара | 17,4 | 0,7 | 27 | 23 | 19 | 19 |
| а. Сахара из телячьего бульона и из дрожжей, которые являются частью ферментата, обеспечивают ориентировочно 70-75 мг углеводов для ферментации. b. Сахара в тестовом субстрате по расчету обеспечивают ориентировочно 120-125 мг углеводов для ферментации. с. Включает в себя сахара из следующего списка, которые специально не указаны: рамноза, фукоза, рибоза, арабиноза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкоза, миоинозит, глюкозамин и галактозамин. Несмотря на то, что уроновые кислоты были включены в расчет количества подлежащих ферментации углеводов, измерение их количества производилось не во всех пробах и поэтому не включено во все сводки за исключением сводки для Фракции С. |
ПРИМЕР 8
Восстановительное расщепление и ЯМР анализ Фракции В шелухи семян подорожника
Полисахарид Фракции В шелухи семян подорожника был полностью метилирован и затем восстановительно расщеплен в присутствии триэтилсилана и триметилсилилтрифторметансульфоната в соответствии со стандартными методиками. Полученные продукты были ацетилированы на месте нахождения и проанализированы при помощи газовой и жидкостной хроматографии и массовой спектрометрии (GLC-MS) в колонке DB-5. Результаты приведены в Таблице 6.
| Таблица 6 Результаты анализа восстановительного расщепления | ||
| Пик | Радикал | Молекулярный процент |
| 1 | Окончание Xylp | 23,27 |
| 2 | Окончание Araƒ | 16,95 |
| 3 | 3-связанный Araƒ | 10,76 |
| 4 | 3-связанный Xylp | 4,33 |
| 5 | Окончание Galp | 1,07 |
| 6 | 2,3- или 3,4-связанный Xylp | 11,84a |
| 7 | 2,3-связанный Araƒ | 3,44 |
| 8 | 2,4-связанный Xylp | 21,41b |
| 3,5-связанный Araƒ | 0,58b | |
| 9 | 2,5-связанный Xylp | 2,68 |
| 10 | Неопознанный | |
| 11 | 3-связанный Galp | 0,66b |
| 2,3,4-связанный Xylp | 3,01b | |
| а Стандартный анализ путем метилирования показывает, что этот радикал Xylp является 3,4-связанным. b Коэлюирующие компоненты были разделены при помощи GLC на колонке RTx-200. |
При использовании процесса восстановительного расщепления намного легче разделить компоненты для проведения их идентификации и количественной оценки, а также для получения более точной структурной информации, чем в случае применения стандартной методики метилирования и гидролиза. Приведенные в Таблице 6 данные показывают, что полисахарид Фракции В является высоко разветвленной и очень сложной молекулой. Основная ксилановая цепь содержит, в дополнение к ветвям ксилозы и арабинозы, ветви неопределенной длины, которые могут содержать оба сахара.
Полисахарид также подвергался двухмерному ЯМР анализу, результаты которого показывают, что радикалы ксилозы являются бета-связанными, а радикалы арабинозы являются альфа-связанными. Последнее утверждение поддерживается действием альфа-L-арабинофуранозидазы на полисахарид.
Несмотря на то, что были описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, совершенно ясно, что в них специалистами в данной области могут быть внесены изменения и дополнения, которые не выходят однако за рамки приведенной далее формулы изобретения.
1. Гелевая фракция шелухи семян подорожника блошиного, предназначенная для лечения запоров, а также для использования в качестве пищевой добавки, которая выдерживает микробную ферментацию при проходе через моножелудочный желудочно-кишечный тракт млекопитающих, содержащая ксилозу и арабинозу при соотношении масс в сухом состоянии, составляющем по меньшей мере около 3:1, а также содержащая менее 4% (вес) рамнозы, причем гелевая фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и способна образовывать гель при подкислении раствора до рН около 4,5.
2. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что весовое отношение ксилозы к рамнозе в сухом состоянии превышает 50.
3. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит галактозу и имеет весовое отношение ксилозы к галактозе в сухом состоянии, превышающее 25.
4. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит уроновые кислоты и имеет весовое отношение ксилозы к уроновым кислотам в сухом состоянии, превышающее 25.
5. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она имеет следующий состав сахаров (вес.% в сухом состоянии): до 3,5% рамнозы; от 15 до 20% арабинозы; от 55 до 70% ксилозы; до 0,5% маннозы; от 1 до 2% галактозы; до 0,5% глюкозы и от 0,5 до 5% уроновых кислот.
6. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она имеет кажущуюся вязкость в формамиде, составляющую по меньшей мере 500 с.
7. Фармацевтический препарат для лечения запоров, характеризующийся тем, что он содержит эффективную дозу гелевой фракции по п.1.
8. Фармацевтический препарат по п.7, отличающийся тем, что указанная эффективная доза составляет от 2 до 6 г в пересчете на сухой вес геля.
9. Углеводная фракция шелухи семян подорожника, предназначенная для лечения запоров, а также для использования в качестве пищевой добавки, характеризующаяся тем, что она растворима в разбавленном щелочном растворе и остается растворимой при подкислении раствора до рН около 4,5, причем указанная фракция содержит ксилозу и арабинозу при соотношении по меньшей мере около 4:1, а также содержит по меньшей мере около 12% (вес) рамнозы и по меньшей мере оксло 15% (вес) уроновых кислот.
10. Способ фракционирования шелухи семян подорожника для получения гелевой фракции и дополнительной углеводной фракции, включающий следующие операции:
а) перемешивание шелухи семян подорожника блошиного в водном щелочном растворе, который содержит ориентировочно от 0,15 до 1,0 М гидроксильных ионов, за счет чего осуществляют фракционирование шелухи семян подорожника блошиного на растворимую в щелочи фракцию и на не растворимую в щелочи фракцию;
b) удаление не растворимой в щелочи фракции;
c) подкисление растворимой в щелочи фракции до рН в диапазоне от 3 до 6 с получением гелевой фракции и подкисленного раствора, содержащего дополнительную углеводную фракцию; и
d) выделение гелевой фракции из раствора, который содержит дополнительную углеводную фракцию.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что перемешивание шелухи семян подорожника блошиного производят в водном щелочном растворе, который содержит от 0,15 до 0,3 М гидроксильных ионов.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что растворимую в щелочи фракцию подкисляют до рН около 4,5.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает промывку гелевой фракции в водном растворе.
14. Способ по п.10, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает обезвоживание промытой гелевой фракции.
15. Гелевая фракция из шелухи семян подорожника, характеризующаяся тем, что она получена способом по п.10.
16. Фармацевтический препарат для лечения запоров, характеризующийся тем, что он содержит эффективную дозу гелевой фракции по п.15.
17. Фармацевтический препарат по п.16, отличающийся тем, что указанная эффективная доза составляет от 2 до 6 г в пересчете на сухой вес геля.
18. Углеводная фракция шелухи семян подорожника, характеризующаяся тем, что она получена способом по п.10.
19. Способ лечения запоров, характеризующийся тем, что он предусматривает прием пациентом фармацевтического препарата по п.7.
20. Способ лечения запоров, характеризующийся тем, что он предусматривает прием пациентом фармацевтического препарата по п.15.
