Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°c

Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания средства - протекторного раствора для консервирования лейкоцитов при температуре переохлаждения и сохранения их в физиологически активном состоянии после выхода из холодового гипобиоза. Раствор содержит в оптимальном соотношении глицерин, оксиметилэтилпиримидина сукцинат, модежель. Его рН составляет 7,0-7,4. Протекторный раствор обеспечивает сохранность высокого процента функционально активных лейкоцитарных клеток. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания протекторного раствора для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С.

В качестве прототипа нами использована работа В.М.Трошиной и соавт. "Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживании гранулоцитов" (ж. Проблемы гематологии и переливания крови. М.: Медицина. - 1977. - №5. - с.50-54). Существенным недостатком прототипа является то, что предложенный его авторами ограждающий раствор не содержит мембраностабилизирующего и антиоксидантного вещества - оксиметилэтилпиридина сукцината, восстанавливающего нарушенные функции мембран клеток и тормозящего процессы перекисного окисления липидов (Справочник ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России: Справочник. М.: АстраФармСервис. - 2001. - С.348-349). В прототип не входят также тропный к тканям и клеткам организма человека глицерин и препарат модежель, применяемый для консервирования и ресуспендирования эритроцитов при положительной температуре, состоящий в основном из модифицированного желатина с молекулярной массой 13000-20000 (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов. Справочник "Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга" под ред. Хлябича Г.Н. М.: Медицина. - 1997. - С.144-145).

Техническим результатом настоящего изобретения является создание протекторного раствора для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С. Данный протекторный раствор обеспечивает сохранность высокого процента функционально активных лейкоцитарных клеток и может быть использован в учреждениях криобиологического и медицинского профиля, обеспеченных бытовыми электроморозильниками на -10°С.

Технический результат достигается тем, что в предложенный протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С включены хладоограждающие вещества: глицерин высшего сорта, производное янтарной кислоты - оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные функции мембран клеток, тормозит перекисное окисление липидов, Сукцинат участвует в энергетическом обмене клетки (Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - С.317-319 и с.321-322). В качестве компонента в Протекторный раствор введен модежель - препарат, состоящий из модифицированного желатина с м.м. - 13000-20000, натрия гидроцитрата двузамещенного, натрия гидрокарбоната, натрия хлорида и воды для инъекций (Аграненко В.А., Тибилова Н.Н. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов. Справочник "Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга" под ред. Хлябича Г.Н. М.: Медицина. - 1997. - С.144-145). Протекторный раствор имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Ингредиенты в данном растворе тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в России.

Пример получения протекторного раствора (№2) для консервирования лейкоцитов при -10°С.

В стерильном боксе при температуре+22°С в мерную колбу на 100 мл наливают 70 мл модежеля, к нему, используя градуированные пипетки, добавляют 7 мл глицерина (ч.д.а.), 6 мл 5% раствора оксиметилпиримидина сукцината при постоянном перемешивании. В смесь по каплям добавляют 1 М раствор гидроксида натрия до достижения рН среды 7,0-7,4. С помощью модежеля доводят объем раствора до 100 мл. Тщательно перемешивают, производят контроль рН среды. рН должен находиться в интервале 7,0-7,4.

Приготовленный таким образом протекторный раствор в количестве 5 мл отправляют на бакконтроль. Все ингредиенты, лабораторная посуда, а также перчатки, халат, бахилы, маска, шапочка лаборанта должны быть стерильными.

Флакон с протекторным раствором герметично укупоривают, этикируют и хранят до применения при комнатной температуре в защищенном от света месте.

При отсутствии бактериальной контаминации протекторный раствор может быть использован для консервирования лейкоцитов при -10°С.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА

Протекторный раствор, включающий глицерин в концентрации 7%, оксиметилэтилпиридина сукцинат 0,3%, модежель до 100 мл, гидроокись натрия 1 М раствор до рН 7,0-7,4, смешивают в равных количествах (1:1) с лейкоцитным концентратом в полимерном контейнере "Компопласт". Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают на 24 часа в электрический морозильник (в 3-литровую ванну с этиловым 96° спиртом, охлажденным до -10°С). Следует отметить, что как протекторный раствор, так и смесь его с лейкоконцентратом в соотношении 1:1 при -10°С не замерзают. Согревание смеси осуществляют в 20-литровой водяной ванне, нагретой до +38°С в течение 2-3 секунд при интенсивном покачивании контейнера. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Далее исследуют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N9. - С 58-59). Результаты выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями форменных элементов до замораживания.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Изучению были подвергнуты три варианта протекторного раствора для лейкоцитного концентрата, различающихся по концентрации включенных в них ингредиентов. Состав растворов представлен в табл. 1.

После смешивания 1:1 с лейкоконцентратом конечная концентрация веществ, которые входят в состав растворов N1, N2 и N3 становилась в 2 раза ниже исходной (табл.2); рН среды оставалась в пределах 7,0-7,4.

При введении лейкоцитов в холодовой гипобиоз (-10°С) изучена их морфологическая сохранность и функциональная активность (табл.3).

Биологическое состояние лейкоцитов и прежде всего нейтрофилов, определяет их фагоцитарная активность. Этот показатель, надежно характеризующий биологическую полноценность клеток, был лучшим после охлаждения-согревания при применении протекторного раствора с оптимальным соотношением его ингредиентов.

Оптимальный протекторный раствор прозрачен, без цвета, без запаха, рН=7,0-7,4, смешивается легко с лейкоцитным концентратом, не вызывает образование конгломератов клеток и обеспечивает их высокую функциональную и морфологическую сохранность до и после охлаждения-согревания. Раствор проявляет четкое криозащитное свойство при охлаждении лейкоцитов с +10°С до -10°С.

Таким образом, разработанный протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре переохлаждения обеспечил сохранность высокого процента функционально активных лейкоцитарных клеток. Он может быть использован в учреждениях криобиологического и медицинского профиля, где имеются обычные бытовые электрохолодильники с морозильными камерами на -10°С.

Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С, характеризующийся тем, что он содержит глицерин, оксиметилэтилпиримидина сукцинат, модежель при следующем соотношении ингредиентов, %:

Глицерин высшего сорта	5,0-9,0
Оксиметилэтилпиримидина сукцинат	0,075-0,3
Модежель	до 100 мл
Гидроокись натрия 1 М раствор	до рН 7,0-7,4