Слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, димерный слитый белок, фармацевтическая композиция, их содержащая, молекула днк (варианты) и способ адресования интерферона-альфа в ткани печени

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к получению слитого белка Fc-фрагмента иммуноглобулина и интерферона-альфа, и может быть использовано для лечения гепатита. Конструируют слитый белок, содержащий в направлении от N-конца к С-концу Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из IgG1 или IgG3, и целевой белок, включающий, по меньшей мере, один интерферон-альфа. Fc-фрагмент и целевой белок соединяют между собой непосредственно или с помощью полипептидного мостика. Слитый белок используют для получения фармацевтической композиции для лечения заболеваний печени, а также в способе адресования интерферона-альфа в ткани печени. Изобретение позволяет получить слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, обеспечивающий его концентрирование в печени и имеющий повышенную растворимость, более длительное время полужизни в сыворотке и повышенное связывание со своим рецептором. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка основана на приоритете предварительной заявки на патент США №60/134895, поданной в Патентное ведомство США 19 мая 1999 г., содержание которой включено сюда ссылкой на нее.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Раскрываемое в данной заявке изобретение относится к системам экспрессии слитых белков, усиливающим продуцирование белков - членов класса интерферонов-альфа. Конкретнее, настоящее изобретение относится к обеспечению высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих и секреции слитых белков с фрагментом иммуноглобулина Fc, таких как слитый белок состава Fc-фрагмент иммуноглобулина - интерферон-альфа, и к их различным структурным формам и применениям.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Было установлено, что семейство белков интерферонов-альфа (IFN-альфа) может быть использовано в лечении различных заболеваний. Например, интерфероны альфа-2а и 2b (торговые наименования соответственно Роферон - Roferon и Интрон А - Intron А) были применены для лечения хронических гепатитов В, С и D (опасные для жизни вирусные болезни печени), condylomata acuminate (генитальные бородавки), связанной со СПИД саркомой Капоши, лейкемии ворсинчатых клеток, злокачественной меланомы, карциномы базальных клеток, множественной миеломы, карциномы почечных клеток, герпеса I и II, ветрянки/герпеса зостер и фунгоидной гранулемы. Была также изучена эффективность лечебных схем с участием интерферона-альфа при раке простаты и хронической миелогенной лейкемии.

Семейство человеческих интерферонов-альфа является наибольшим и наиболее сложным семейством интерферонов. Члены семейства интерферонов-альфа имеют подобные аминокислотные последовательности, что определяет отличие этой группы от других интерферонов; например, эти белки обычно имеют при типичном линейном выравнивании (alignment) последовательностей степень идентичности аминокислотной последовательности не менее 35%. В банке данных SwissProt содержатся многие белки интерферонов-альфа человека, в том числе белки, называемые иначе интерферон-дельта и интерферон-омега. Эти белки обычно синтезируются с лидирующей последовательностью из примерно 23 аминокислот, а зрелые белки обычно имеют молекулярный вес приблизительно 19 кДа. Из-за схожести этих белков при получении и тщательной очистке интерферона-альфа, происходящего из человека или другого млекопитающего, часто получают смесь подвидов с различной биологической активностью [Georgiades и др. Патент США №4732683]. Подобным же образом и кДНК, кодирующие эти белки, имеют достаточно близкие размеры и свойства, так что для операций с ними в целях конструирования плазмид можно использовать один и тот же набор приемов. Поэтому могло бы оказаться полезным иметь способ эффективного продуцирования и очистки одиночных видов интерферонов-альфа, происходящих из млекопитающих.

Благодаря своему относительно малому размеру - около 19 кДа (Lawn и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Т.78. С.5435) интерферон-альфа может фильтроваться почками. Однако при фильтровании интерферон-альфа обычно адсорбируется и метаболизируется трубчатыми клетками почек и поэтому обычно не выделяется из организма. В современной клинической практике интерферон-альфа в составе лекарственных средств вводят внутримышечной инъекцией, после чего его содержание в сыворотке снижается с временем полужизни около 5 ч для интерферона-альфа-2а и 2-3 ч для интерферона-альфа-2b (Physicians Desk Reference, 50^th edition. 1996. С.2145-2147 и 2364-2373).

Более того, из-за малого размера интерферонов-альфа необходимы их множественные, частые инъекции (обычно ежедневно или 3 раза в неделю) и при этом могут быть значительные колебания в содержании интерферона-альфа у различных пациентов. Кроме того, вводятся большие дозы, варьирующие от приблизительно 50 микрограмм на дозу при лейкемии ворсинчатых клеток до 300 микрограмм на дозу при связанной со СПИД саркомой Капоши. Высокие уровни циркулирующего интерферона-альфа могут давать значительные побочные эффекты, в том числе токсичность для кожи и нервной, иммунной и эндокринной систем. Полагают, что малый размер интерферона-альфа позволяет ему проходить сквозь гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему, что объясняет некоторые из побочных неврологических эффектов. Поэтому было бы полезным повысить действенность и эффективное время жизни интерферона-альфа в сыворотке получивших его пациентов и в то же время снизить до минимума побочное действие.

Принимая во внимание необходимость высоких доз, низкую эффективность, малое время полужизни в сыворотке, трудности очистки и побочное действие интерферона-альфа, в данной области существует потребность в способах повышения продуцирования и улучшения фармакологических свойств этого терапевтического средства.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение описывает способы и композиции, пригодные для создания и применения слитых белков, содержащих интерферон-альфа. В частности, настоящее изобретение описывает нуклеиновые кислоты, например последовательности ДНК или РНК, кодирующие слитый белок состава Fc-фрагмент иммуноглобулина-интерферон-альфа, и способы экспрессии нуклеиновой кислоты для продуцирования таких слитых белков. Слитые белки могут обеспечить высокий уровень экспрессии биологически активного интерферона-альфа. Слитый белок может быть перед введением млекопитающему, например человеку, объединен с фармацевтически приемлемым носителем. При определенных обстоятельствах интерферон-альфа перед включением в лечебный состав и/или введением может быть отщеплен от слитого белка. В качестве альтернативы последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие содержащий интерферон-альфа слитый белок, могут быть объединены с фармацевтически приемлемым носителем и введены млекопитающему.

Цель изобретения - предложить новые последовательности нуклеиновой кислоты - например ДНК или РНК, которые способствуют продуцированию и секреции интерферона-альфа. В частности, настоящее изобретение предлагает (i) последовательности нуклеиновой кислоты, которые способствуют эффективному продуцированию и секреции интерферона-альфа; (ii) конструкции нуклеиновой кислоты для быстрого и эффективного продуцирования и секреции интерферона-альфа в различных клетках-хозяевах млекопитающих; и (iii) способы продуцирования, секреции и сбора рекомбинантного интерферона-альфа или его генно-инженерных вариантов, в том числе ненативных, биосинтетических или иным образом полученных искусственных белков интерферона-альфа, таких как белки, созданные рациональным способом конструирования.

Другая цель настоящего изобретения - предложить полинуклеотидные последовательности, которые при слиянии с полинуклеотидом, кодирующим интерферон-альфа, кодируют содержащий интерферон-альфа слитый белок, который может быть очищен с помощью общепринятых реагентов и методов. Следующая цель - поместить между кассетой секреции и кодируемым белком интерферона-альфа сайт протеолитического расщепления таким образом, чтобы кассету секреции можно было отщепить от домена интерферона-альфа, в результате чего интерферон-альфа может быть очищен независимо.

Поэтому в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, например молекулы ДНК или РНК, которые кодируют слитый белок состава «Fc-фрагмент иммуноглобулина - интерферон-альфа». Молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательно в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность, Fc-фрагмент иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, причем целевой белок представляет собой интерферон-альфа.

В предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина содержит шарнирную область иммуноглобулина и предпочтительно содержит по меньшей мере один домен константной части тяжелой цепи иммуноглобулина, например домен 2 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН2), домен 3 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН3) и в зависимости от типа иммуноглобулина, используемого для формирования Fc-фрагмента, но не обязательно домен 4 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН4). В более предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина лишен по меньшей мере домена 1 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН1). Хотя Fc-фрагменты иммуноглобулина могут иметь основой любой класс иммуноглобулинов, например IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительными являются Fc-фрагменты иммуноглобулина на основе IgG.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть включена в функциональной связи в способный к репликации экспрессирующий вектор, который затем можно ввести в клетку-хозяин млекопитающего, подходящую (компетентную) для продуцирования слитого белка на основе интерферона-альфа. Получаемый в результате слитый белок на основе интерферона-альфа эффективно продуцируется и секретируется из клетки-хозяина млекопитающего. Секретированный слитый белок на основе интерферона-альфа может быть извлечен из культуральной среды без лизирования клетки-хозяина млекопитающего. Можно определить активность белка-продукта, и/или очистить его необходимым образом с помощью обычных реагентов, и/или отщепить его от слитого партнера, причем все процедуры выполняются с помощью обычных методов.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает слитые белки, содержащие интерферон-альфа. Слитые белки по настоящему изобретению проявляют улучшенные биологические свойства по сравнению с нативным интерфероном-альфа, такие как повышенную растворимость, более длительное время полужизни в сыворотке и повышенное связывание со своим рецептором. Эти свойства могут существенно повысить клиническую эффективность интерферона-альфа. В предпочтительном варианте осуществления слитый белок содержит в направлении от N-конца к С-концу Fc-фрагмент иммуноглобулина и интерферон-альфа вместе с другими участками, например сайтом протеолитического расщепления, помещенного (но необязательно) между Fc-фрагментом иммуноглобулина и интерфероном-альфа. Получаемый таким образом слитый белок предпочтительно синтезируется в клетке, которая гликозилирует Fc-фрагмент в нормальных местах гликозилирования, т.е. в местах, обычно существующих в исходных антителах.

В ином варианте осуществления слитый белок может содержать второй целевой белок, например зрелый интерферон-альфа полной длины или его биологически активный фрагмент. В этом типе конструкции первый и второй целевые белки могут быть одинаковыми или разными белками. Первый и второй целевые белки могут быть соединены вместе либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика. В качестве альтернативы оба целевых белка могут быть соединены либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика с Fc-фрагментом иммуноглобулина. В последнем случае первый целевой белок может быть присоединен к N-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина, а второй целевой белок присоединен к С-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления два слитых белка могут быть соединены или ковалентно, например, дисульфидной связью, пептидной связью или сшивающим агентом, или нековалентно с получением димерного белка. В предпочтительном варианте осуществления два слитых белка соединены ковалентно с помощью по меньшей мере одной, а предпочтительнее с помощью двух межцепных дисульфидных связей между остатками цистеина, предпочтительно расположенными внутри шарнирных областей иммуноглобулина, находящихся внутри Fc-фрагментов иммуноглобулина каждой из цепей.

Еще одна цель настоящего изобретения - обеспечить поливалентные и мультимерные формы слитых белков с интерфероном-альфа и их комбинации.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способы продуцирования слитых белков, содержащих Fc-фрагмент иммуноглобулина и целевой белок. Способ включает этапы: (а) создания клетки млекопитающего, которая содержит молекулу ДНК, кодирующую такой слитый белок, вместе с сигнальной последовательностью или без нее, и (b) культивирования клетки млекопитающего для продуцирования слитого белка. Получаемый в результате слитый белок может быть собран, упорядочен (свернут) заново, если необходимо, и очищен с использованием обычных методов очистки, хорошо известных и используемых в данной области. Если допустить, что слитый белок содержит сайт протеолитического расщепления, расположенный между Fc-фрагментом иммуноглобулина и целевым белком, тогда целевой белок может быть отщеплен от слитого белка с помощью обычных протеолитических ферментов и при необходимости очищен перед использованием.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы лечения болезненных состояний, поддающихся облегчению с помощью интерферона-альфа или его активных вариантов, путем введения млекопитающему эффективного количества интерферона-альфа, производимого способом по настоящему изобретению, и/или слитой конструкции по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предлагает также способы лечения болезненных состояний, поддающихся облегчению с помощью интерферона-альфа или его активных вариантов, путем введения имеющему такое состояние млекопитающему нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например «голой ДНК» или вектора, содержащего ДНК или РНК по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления конструкции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения расстройства печени, причем интерферон-альфа благодаря Fc-фрагменту иммуноглобулина попадает в печень. Конструкции по настоящему изобретению могут быть особенно полезны в лечении расстройств печени, которые включают (но не ограничиваются ими) вирусные заболевания, такие как гепатит В, гепатит С или гепатит D, рак печени, а также другие типы рака, дающие локализованные в печени метастазы.

Вышеизложенное и другие цели, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих описания, чертежей и формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1А -1С дают схематическую иллюстрацию неограничивающих примеров слитых белков, сконструированных согласно настоящему изобретению.

Фиг.2 - график, показывающий кривые выживания для групп мышей SCID, которым путем инъекции были введены клетки Daudi и которые затем подвергались лечению слитым белком huFc-hulFN-alpha (составленным из Fc-фрагмента иммукоглобулина человека и интерферона-альфа человека). В день начала отсчета (день 0) мышам были инъецированы клетки Daudi. В дни 3-8 группам по 8 мышей инъецировали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (ромбики), 30 мкг huFc-hulFN-alpha (крестики) или 60 мкг huFc-hulFN-alpha (треугольники).

Фиг.3 - график, показывающий скорость роста подкожных опухолей, вызванных клетками Daudi у мышей SCID, которым вводили huFc-hulFN-alpha. Приблизительно за 4 недели до лечения мышам инъецировали подкожно клетки Daudi. После того как клетки Daudi прорастали с образованием опухолей размером 200-400 мм³, формировали группы по 8 мышей и вводили им в течение 6 дней PBS (ромбики), 30 мкг huFc-hulFN-alpha в PBS (квадраты) или 60 мкг huFc-hulFN-alpha в PBS (треугольники).

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие болезненные состояния могут быть облегчены введением интерферона-альфа. Например, как обсуждалось выше, интерфероны альфа-2а и 2b (торговые наименования соответственно Roferon и Intron А) могут быть полезны для лечения хронических гепатитов В, С и D, condylomata acuminata (генитальные бородавки), связанной со СПИД саркомой Капоши, лейкемии ворсинчатых клеток, злокачественной меланомы, карциномы базальных клеток, множественной миеломы, карциномы почечных клеток, герпеса I и II, ветрянки/герпеса зостер (опоясывающего) и фунгоидной гранулемы. Были также проведены исследования для оценки эффективности интерферона-альфа в лечении рака простаты и хронической миелогенной лейкемии.

Например, для лечения гепатита особенно полезным может быть наличие формы интерферона-альфа, которая концентрируется в печени. Таким путем концентрация интерферона-альфа в других тканях может быть сведена к минимуму, что уменьшает побочные эффекты. Ткань печени представляет собой первичный центр удаления растворимых иммунных комплексов, и макрофаги печени (клетки Купфера) богаты рецепторами для Fc (Benacerraf В. и др. // J. Immunol. 1959. Т.82. С.131; Paul W.E. // Fundamentals of Immunology, 3^rd ed. ch.5. С.113-116). Поэтому путем слияния интерферона-альфа с Fc-фрагментом иммуноглобулина молекулу интерферона-альфа можно направить предпочтительно в ткань печени, что нельзя сделать с такой же молекулой интерферона-альфа, лишенной Fc-фрагмента иммуноглобулина. Тип IgG антител, имеющий наибольшее сродство к рецепторам для Fc, - это lgG1. Однако в противоположность этому lgG4, например, имеет приблизительно в 10 раз более низкое сродство к рецептору I Fc-гамма (Anderson and Abraham // J. Immunol. 1980. Т.125. С.2735; Woof и др. // Mol. Immunol. 1986. Т.23. С.319). Фрагмент Fc-гамма 1 из lgG1 будучи помещен на С-конце лиганда может вызывать зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим рецептор для этого лиганда. Кроме того, если Fc-гамма 1 находится на С-конце лиганда, он может участвовать в связывании C1q и фиксации (связывании) комплемента, выработанного против клеток, экспрессирующих рецептор для этого лиганда.

В противоположность lgG1 lgG4 не фиксирует комплемент достаточно эффективно. На этом основании сделано предположение, что N-концевой интерферон-альфа может быть слит с С-концевым Fc-фрагментом из lgG4 (Chang T.W. и др. Патент США №5723125). Однако, если Fc-фрагмент иммуноглобулина lgG4 отделен от Fab-фрагмента, Fc lgG4 фиксирует комплемент так же хорошо, как и Fc-фрагмент lgG1 (Isenman D.E. и др. // J. Immunol. 1975. Т.114. С.1726). На основании этого результата и близкого сходства последовательностей для Fc-фрагментов lgG1, не вдаваясь в теорию, сделано предположение, что фрагмент Fab lgG4 блокирует связывание C1q и фиксацию комплемента путем пространственного (стерического) запрета, так как шарнирная область, соединяющая фрагменты Fab и Fc иммуноглобулина lgG4, короче, чем шарнирная область lgG1. Предполагается, что если большой, громоздкий Fab-фрагмент иммуноглобулина lgG4 заменить небольшой молекулой, такой как молекула интерферона-альфа, и интерферон-альфа и Fc-фрагмент соединить гибким мостиком, такой слитый белок интерферон-альфа-Fc-гамма-4 будет фиксировать комплемент при связывании с клетками, имеющими рецепторы для интерферона-альфа.

Цитотоксический эффект вследствие слияния N-концевого цитокина с С-концевым Fc-фрагментом хорошо известен. Например, слияние цитокина - интерлейкина-2 (IL-2) с Fc-фрагментом дает молекулу, фиксирующую комплемент и приводящую к лизису клеток, имеющих рецептор для IL-2 (Landolfi N.F. Патент США №5349053).

Слияния, в которых Fc-фрагмент помещен на N-конце лиганда (названные "иммунофузинами" или слияниями "Fc-X", где Х обозначает лиганд, такой как интерферон-альфа), имеют много характерных, полезных биологических свойств (Lo и др. Патенты США №5726044 и №5541087; Lo и др. // Protein Engineering. 1998. Т.11. С.495). В частности, такие слитые белки могут сохранять способность к связыванию с соответствующими рецепторами для Fc на поверхности клеток. Но если лиганд связывается со своим рецептором на поверхности клетки, ориентация Fc-фрагмента меняется и оказывается, что последовательности, отвечающие за ADCC и фиксацию комплемента, становятся недоступными. В результате Fc-фрагмент в молекуле Fc-X не участвует эффективно в ADCC и фиксации комплемента. Поэтому ожидается, что слияния Fc-X будут иметь полезное свойство - увеличенное время полужизни в сыворотке и относительно более высокую концентрацию в печени с незначительными вредными проявлениями ADCC и фиксации комплемента.

Одно из свойств конструкций Fc-X настоящего изобретения состоит в концентрировании целевого белка - в данном случае интерферона-альфа в печени. Fc-фрагмент цепей гамма-1 и гамма-3 проявляет наивысшее сродство к рецептору для Fc, тогда как цепь гамма-4 имеет сниженное сродство, а цепь гамма-2 обнаруживает крайне низкое сродство к рецептору для Fc. Поэтому Fc-фрагменты, полученные из цепей гамма-1 или гамма-3, предпочтительно используются в конструкциях Fc-X по настоящему изобретению, так как они обладают наивысшим сродством к рецепторам Fc и поэтому могут адресовать интерферон-альфа преимущественно в ткани печени. Это отличает их от белка типа X-Fc, например от слитого белка интерферон-альфа-Fc, у которого потенциальное удобство концентрирования в печени должно уравновешиваться тем фактом, что этот слитый белок может быть посредником в эффекторных функциях, а именно в фиксации комплемента и ADCC, направленных против клеток, имеющих рецепторы для интерферона-альфа.

Таким образом, изобретение предусматривает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, и аминокислотные последовательности, определяющие слитые белки, которые содержат Fc-фрагмент иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, который здесь определен как интерферон-альфа. На фигурах 1А-1С проиллюстрированы три типичных варианта осуществления белковых конструкций, воплощающих настоящее изобретение. Поскольку предпочтительны димерные конструкции, все эти проиллюстрированные случаи представляют собой димеры, сшитые парой дисульфидных связей между цистеинами смежных субъединиц. На чертежах изображены дисульфидные связи, соединяющие два Fc-фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина через шарнирные области, находящиеся в каждой из тяжелых цепей, и это характерно для нативных форм этих молекул. Хотя предпочтительными являются конструкции, содержащие шарнирную область Fc, и было показано, что они перспективны как терапевтические агенты, изобретение подразумевает, что при необходимости сшивки могут быть осуществлены в других положениях. Кроме того, в некоторых случаях димеры или мультимеры, пригодные в применении настоящего изобретения, могут быть получены путем нековалентного соединения, например с помощью гидрофобных взаимодействий. Поскольку гомодимерные конструкции являются важными вариантами осуществления настоящего изобретения, на чертежах приведены такие конструкции. Необходимо, однако, принимать во внимание, что гетеродимерные конструкции также пригодны для применения в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг.1А показана димерная конструкция, полученная в соответствии с принципами, указанными здесь далее (см., например, пример 1). Каждый мономер в гомодимере содержит Fc-фрагмент (1) иммуноглобулина, включая шарнирную область, домен СН2 и домен СН3. Непосредственно к С-концу Fc-фрагмента с помощью пептидной связи присоединен интерферон-альфа (2). Следует понимать, что Fc-фрагмент может быть присоединен к целевому белку через полипептидный мостик (не показан).

Фигуры 1В и 1С изображают белковые конструкции по настоящему изобретению, включающие в качестве целевого белка несколько белков интерферона-альфа, расположенных в виде тандема и соединенных мостиком. На фиг.1В целевой белок содержит интерферон-альфа полной длины (2), полипептидный мостик, составленный из остатков глицина и серина (4), и активный вариант интерферона-альфа (3). Конструкция на фиг.1С отличается от конструкции на фиг.1В тем, что большая часть С-концевого домена белка представляет собой вторую копию полной длины интерферона-альфа (2). Хотя фиг.1А-1С показывают конструкции Fc-X, где Х обозначает целевой белок, подразумевается, что полезные белки настоящего изобретения могут быть также обозначены формулой X-Fc-X, где буквами Х могут быть обозначены одни и те же или различные целевые белки.

В том смысле, как он использован здесь, под термином «полипептидный мостик» понимают полипептидную последовательность, которая может соединять два белка, в естественных условиях не соединенные вместе. Полипептидный мостик преимущественно содержит множество аминокислот, таких как аланин, глицин и серин, или комбинации таких аминокислот. Предпочтительно полипептидный мостик содержит набор глициновых и сериновых пептидов длиной примерно 10-15 остатков (см., например, патент США №5258698). Предполагается, однако, что оптимальные длина мостика и его аминокислотный состав могут быть определены обычным экспериментальным путем.

В том смысле, как он использован здесь, термин «мультивалентный» относится к рекомбинантной молекуле, которая включает два или более биологически активных сегмента. Белковые фрагменты, образующие мультивалентную молекулу, могут быть соединены (но не обязательно) полипептидным мостиком, который присоединен к составляющим частям и позволяет каждой из них функционировать независимо.

В том смысле, как он использован здесь, термин «бивалентный» относится к мультивалентной рекомбинантной молекуле, имеющей конфигурацию Fc-X или X-Fc, где Х - целевая молекула. Fc-фрагменты иммуноглобулина могут быть соединены, например, межцепными дисульфидными связями, образуя конструкции типа показанной на фиг.1А. Если слитая конструкция по настоящему изобретению имеет конфигурацию Fc-X-X, получаемая в результате молекула с Fc показана на фиг.1С. Два целевых белка могут быть соединены пептидным мостиком. Конструкции типа показанных на фиг.1А могут иметь повышенное кажущееся сродство в связывании между целевой молекулой и ее рецептором.

В том смысле, как он использован здесь, термин «мультимерный» относится к стабильному соединению двух или более полипептидных цепей либо ковалентно, например, путем ковалентного взаимодействия, например, с помощью дисульфидной связи, или нековалентно, например, путем гидрофобного взаимодействия. Подразумевается, что термин «мультимер» включает как гомомультимеры, где субъединицы одни и те же, так и гетеромультимеры, где субъединицы различны.

В том смысле, как он использован здесь, термин «димерный» относится к специфической мультимерной молекуле, в которой две полипептидные цепи стабильно соединены с участием ковалентных или нековалентных взаимодействий. Такие конструкции схематически изображены на фиг.1А. Следует понимать, что образование димера типично для Fc-фрагмента, включающего по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. Известно, что многие белковые лиганды связываются со своими рецепторами в виде димеров. Если димеризация белкового лиганда Х естественна, часть Х в молекуле Fc-X будет димеризоваться в гораздо большей степени, поскольку процесс димеризации зависит от концентрации. Физическая сближенность двух частей X, соединенных Fc, превращает димеризацию во внутримолекулярный процесс, сильно сдвигая равновесие в сторону образования димера и усиливая его связывание с рецептором.

Понятно, что в том смысле, как он использован здесь, термин «интерферон-альфа» означает не только зрелый интерферон-альфа полной длины, например интерферон-альфа 1 человека (SEQ ID NO: 8), интерферон-альфа 2 человека (SEQ ID NO: 9), интерферон-альфа 4 человека (SEQ ID NO: 10), интерферон-альфа 5 человека (SEQ ID NO: 11), интерферон-альфа 6 человека (SEQ ID NO: 12), интерферон-альфа 7 человека (SEQ ID NO: 13), интерферон-альфа 8 человека (SEQ ID NO: 14), интерферон-альфа 10 человека (SEQ ID NO: 15), интерферон-альфа 14 человека (SEQ ID NO: 16), интерферон-альфа 16 человека (SEQ ID NO: 17), интерферон-альфа 17 человека (SEQ ID NO: 18), интерферон-альфа 21 человека (SEQ ID NO: 19), интерферон дельта-1 (SEQ ID NO: 20), II-1 (интерферон омега-1) (SEQ ID NO: 21); а также интерферон-альфа 1 мыши (SEQ ID NO: 22), интерферон-альфа 2 мыши (SEQ ID NO: 23), интерферон-альфа 4 мыши (SEQ ID NO: 24), интерферон-альфа 5 мыши (SEQ ID NO: 25), интерферон-альфа 6 мыши (SEQ ID NO: 26), интерферон-альфа 7 мыши (SEQ ID NO: 27), интерферон-альфа 8 мыши (SEQ ID NO: 28) и интерферон-альфа 9 мыши (SEQ ID NO: 29); но также и их варианты и биологически активные фрагменты. Известные последовательности интерферона-альфа можно найти в банке данных GenBank.

Термин «биологически активный фрагмент» относится к любому фрагменту белка интерферона-альфа, который имеет не менее 50%, более предпочтительно не менее 70% и наиболее предпочтительно не менее 90% биологической активности (определенной методом ингибирования пролиферации клеток по примеру 4) образцового белка интерферона-альфа человека с последовательностью SEQ ID NO: 2. Термин «варианты» включает виды и аллельные варианты, а также другие встречающиеся в природе или неприродные варианты, например, полученные методами генетической инженерии, которые имеют степень подобия не менее 70% или степень идентичности не менее 60%, более предпочтительно не менее 75% подобия или 65% идентичности, наиболее предпочтительно не менее 80% подобия или 70% идентичности со зрелым белком интерферона-альфа человека, представленным SEQ ID NO: 2.

Чтобы определить, имеет ли рассматриваемый белок необходимую процентную степень подобия или идентичности с референсным полипептидом, рассматриваемую аминокислотную последовательность и референсную аминокислотную последовательность вначале располагают параллельно с помощью алгоритма динамического программирования, описанного в работе Smith and Waterman // J. Mol. Biol. 1981. Т.147. С.195-197, в комбинации с матрицей замещений BLOSUM62, описанной на фиг.2 работы Henikoff and Henikoff. "Amino acid substitution matrices from protein blocks". // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Т.89. С.10915-10919. В настоящем изобретении для недопустимости вставки в пробел (gap insertion penalty) принята величина 12, а для недопустимости расширения пробела (gap extension penalty) принята величина 4. Компьютерные программы, осуществляющие параллельные выравнивания (alignments) последовательностей с помощью алгоритма Смита-Уотермана (Smith-Waterman) и матрицы BLOSUM62, такие как программное обеспечение GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, England), имеются в продаже и широко используются специалистами в данной области.

Осуществив параллельное выравнивание рассматриваемой и референсной последовательностей, можно вычислить значения процента подобия. Индивидуальные аминокислоты каждой последовательности последовательно сравниваются попарно с определением их подобия друг другу. Если значение в матрице BLOSUM62, соответствующее данной паре выровненных аминокислот, равно нулю или отрицательной величине, значение попарного подобия равно нулю; в ином случае значение попарного подобия равно 1,0. Общее значение подобия равно сумме значений попарного подобия выровненных параллельно аминокислот. Затем общее значение подобия нормализуют путем деления его на число аминокислот в более короткой из рассматриваемой и референсной последовательностей. Нормализованное общее значение подобия составляет процент подобия. В качестве альтернативы для вычисления процента идентичности снова попарно сопоставляют последовательно аминокислоты в каждой из выровненных параллельно последовательностей. Если аминокислоты не идентичны, значение попарной идентичности равно нулю; в ином случае значение попарной идентичности равно 1,0. Общее значение идентичности равно сумме значений идентичности выровненных аминокислот. Затем общее значение идентичности нормализуют путем деления его на число аминокислот в более короткой из рассматриваемой и референсной последовательностей. Нормализованное общее значение идентичности составляет процент идентичности. При вычислении процента подобия и идентичности вставки и делеции игнорируют. Поэтому значения недопустимости для просветов в этих вычислениях не используют, хотя они используются при первичном параллельном выравнивании.

Варианты могут также включать другие мутантные белки интерферона-альфа, имеющие подобную интерферону-альфа активность. Виды и аллельные варианты включают (но не ограничиваются ими) последовательности интерферона-альфа человека и мыши. Варианты интерферона-альфа человека представлены в последовательностях SEQ ID NOS: 8-21, а варианты интерферона-альфа мыши представлены в последовательностях SEQ ID NOS: 22-29.

Кроме этого, последовательность интерферона-альфа может представлять собой часть консенсусной последовательности или всю ее, представленную далее как SEQ ID NO: 7, где интерферон-альфа имеет не менее 50%, более предпочтительно не менее 70% и наиболее предпочтительно не менее 90% биологической активности (определенной методом ингибирования пролиферации клеток по примеру 4) зрелого белка интерферона-альфа человека с последовательностью SEQ ID NO: 2.

Эти белки очень похоже ведут себя в процессе очистки и имеют другие сходные биологические свойства. В частности, манипуляции с ДНК, экспрессия слитого белка и свойства слитого белка в процессе очистки для белков Fc-интерферон-альфа чрезвычайно похожи. Например, интерферон-альфа-2а человека и интерферон-альфа-2b человека различаются только одной аминокислотой, причем интерферон-альфа-2а имеет остаток лизина в том положении, где интерферон-альфа-2b имеет остаток аргинина. Интерферон-альфа-2а человека и интерферон-альфа-2b человека имеют чрезвычайно похожие свойства и взаимозаменяемы при всех известных целях их использования.

Трехмерная пространственная структура интерферона-альфа была определена с помощью рентгеновской кристаллографии (Ramaswamy и др. // Structure. 1986. Т.4. С.1453). Аминокислотные последовательности белков интерферонов-альфа столь близки, что определенную структуру считают структурой всего семейства белков. Трехмерная структура интерферона-альфа, подобно структуре интерферона-бета, представляет собой димер с ионом цинка на поверхности димера. Однако в растворе интерферон-альфа ведет себя как мономер. На основании аналогии с цитокином IL-6 и другими белковыми лигандами было высказано предположение, что интерферон-альфа может димеризоваться при связывании с рецептором (Radhakrishnan R. и др. // Structure. 1996. Т.4. С.1453; Karpusas М. и др. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. Т.94. С.11813).

Димеризация лиганда может повышать кажущееся сродство в связывании между лигандом и его рецептором. Например, если один участок интерферона-альфа слитого белка Fc-Интерферон-альфа свяжется с рецептором клетки с определенным сродством (аффинностью), то второй участок интерферона-альфа того же самого слитого белка Fc-Интерферон-альфа может связаться со вторым рецептором той же клетки с гораздо большим стремлением к связыванию (avidity - кажущееся сродство). Причиной этого может быть физическое сближение второго участка интерферона-альфа с рецептором после того, как уже связался первый участок интерферона-альфа. В случае связывания антитела с антигеном кажущееся сродство может увеличиваться не меньше чем в 10 тысяч, т.е. в 10⁴ раз. Каждая белковая субъединица, т.е. "X", имеет свою собственную независимую функцию, так что в мультивалентной молекуле функции белковых субъединиц могут быть аддитивными или синергическими. Поэтому слияние естественно димерной молекулы Fc с интерфероном-альфа может усиливать активность интерферона-альфа. Соответственно конструкции типа показанных на фиг.1А могут повышать кажущееся сродство связывания между интерфероном-альфа и его рецептором.

Раскрываемые в данной заявке целевые белки экспрессируются в виде слитых белков с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Как известно, каждая константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит четыре или пять доменов. Домены последовательно имеют следующие обозначения: СH1-шарнир-СН2-СН3(-СН4). Нуклеотидные последовательности ДНК доменов тяжелой цепи имеют перекрестную гомологию в пределах классов иммуноглобулинов, например домен СН2 IgG гомологичен домену СН2 IgA и IgD и домену СН3 IgM и IgE.

Понятно, что термин «Fc-фрагмент иммуноглобулина» в том смысле, как он использован здесь, означает карбоксильно-концевую часть константной области цепи иммуноглобулина, предпочтительно константную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть. Например, Fc-фрагмент иммуноглобулина может содержать: (1) домен СН1, домен СН2 и домен СН3; (2) домен СН1 и домен СН2; (3) домен СН1 и домен СНЗ; (4) домен СН2 и домен СН3 или (5) комбинацию двух или более доменов и шарнирную область иммуноглобулина. В предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина включает по меньшей мере шарнирную область иммуноглобулина, домен СН2 и домен СНЗ и предпочтительно лишен домена СН1.

Общепринятым предпочтительным классом иммуноглобулина, из которого происходит константная область тяжелой цепи, является IgG (Igγ) (γ подклассы 1, 2, 3 или 4). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности Fc γ-1 человека приведены далее как последовательности ID №№3 и 4. Могут быть использованы другие классы иммуноглобулинов - IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) и IgM (Igμ). Выбор подходящих константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина подробно обсуждается в патентах США №5541087 и №5726044. Считается, что квалификации специалистов в данной области достаточно для выбора конкретных последовательностей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина среди определенных классов и подклассов иммуноглобулинов для достижения конкретного результата. Часть конструкции ДНК, кодирующая Fc-фрагмент иммуноглобулина, предпочтительно содержит последовательности по меньшей мере части шарнирного домена и по меньшей мере части домена СН3 фрагмента Fcγ или гомологичных доменов любого иммуноглобулина из IgA, IgD, IgE или IgM.

В зависимости от применения могут быть использованы гены константной области не только человека, но и других видов, например мыши или крысы. Обычно Fc-фрагмент, используемый как партнер для слияния в ДНК-конструкции, может происходить из любого вида млекопитающих. В том случае, когда нежелательно получение в клетке-хозяине или в животном иммунного ответа на Fc-фрагмент, Fc-фрагмент может происходить из того же вида, что и клетка-хозяин или животное. Например, если организм-хозяин - человек или клетка-хозяин - человеческого происхождения, можно использовать Fc-фрагмент иммуноглобулина человека; подобным же образом в том случае, когда животное-хозяин является мышью или клетка-хозяин является клеткой мыши, можно использовать Fc-фрагмент иммуноглобулина мыши.

Кодирующие последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности, определяющие Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, полезный в практике применения настоящего изобретения, приведены далее как SEQ ID NOS: 3 и 4. Однако подразумевается, что могут быть найдены другие последовательности для Fc-фрагмента иммуноглобулина, полезные в практике применения настоящего изобретения. Например, это могут быть фрагменты, кодируемые нуклеотидными последовательностями, представленными в банках данных GenBank и EMBL, например AF045536.1 (Масаса fuscicularis), AF045537.1 (Масаса mulatto), AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03789 (Sus scrota), Z48947 (Camelus dromedaries), X62916 (Bos Taurus), L07789 (Mustela vison), X69797 (Ovis ahes), U17166 (Cricetulus migratoris), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1 (Thhosurus vulpecula) или AF035195 (Monodelphis domestica), раскрытие которых включено сюда ссылкой на них.

Кроме того, подразумевается, что в практике применения настоящего изобретения могут быть полезными замена или делеция аминокислот в пределах константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина. Один из примеров может состоять во введении аминокислотных замен в верхнюю область СН2 для создания варианта Fc с пониженным сродством к рецепторам для Fc (Cole и др. // J. Immunol. 1997. Т.159. С.3613). Специалист в данной области может приготовить такие конструкции с использованием хорошо известных методов молекулярной биологии.

Использование Fcγ1 человека в качестве последовательности Fc-фрагмента имеет несколько преимуществ. Например, если слитый белок, содержащий Fc, должен быть использован как биологически активное лекарство, домен Fcγ1 может придавать слитому белку активность в смысле эффекторных функций. Эффекторные функции включают такие типы биологической активности, как перенос в плаценте и увеличенное время полужизни в сыворотке. Fc-фрагмент иммуноглобулина делает возможным также обнаружение методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с антителами к Fc и очистку связыванием с белком A Staphylococcus aureus («Protein А»). В некоторых применениях, однако, может оказаться желательным снять с Fc-фрагмента иммуноглобулина некоторые эффекторные функции, такие как связывание с рецепторами для Fc и/или связывание комплемента.

Понятно, что настоящее изобретение использует обычные методы рекомбинантной ДНК для получения содержащих Fc слитых белков, пригодных для практического применения изобретения. Слитые конструкции с Fc предпочтительно создаются на уровне ДНК, а полученные ДНК интегрируют в экспрессирующие векторы и экспрессируют для получения слитых белков по настоящему изобретению. Понятно, что термин «вектор» в том смысле, как он использован здесь, обозначает любую нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, способную быть внедренной в клетку-хозяина, рекомбинировать с геномом и интегрироваться в геном клетки-хозяина или автономно реплицироваться в виде эписомы. Такие векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды, РНК-векторы, вирусные векторы и т.п. Примеры вирусных векторов, не ограничивающие все возможности, включают ретровирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус. Понятно, что в том смысле, как он здесь использован, термин «генетическая экспрессия» или «экспрессия» целевого белка обозначает транскрипцию последовательности ДНК, трансляцию мРНК-транскрипта и секрецию продукта - слитого белка, содержащего Fc.

Пригодным экспрессирующим вектором является pdCs (Lo и др. // Protein Engineering. 1988. Т.11. С.495), в котором для транскрипции гена Fc-X используются энхансер/промотор цитомегаловируса человека и сигнал полиаденилирования SV40. Последовательность энхансера и промотора цитомегаловируса человека была получена из нуклеотидов от -601 до +7 последовательности, предложенной в работе Boshart и др. // Cell. 1985. Т.41. С.521. Вектор содержит также в качестве селектирующего маркера мутантный ген дигидрофолат-редуктазы (Simonsen и Levinson // Proc. Nal. Acad. Sci. USA. 1983. Т.80. С.2495).

Подходящая клетка-хозяин может быть трансформирована или трансфицирована последовательностью ДНК настоящего изобретения и использована для экспрессии и/или секреции целевого белка. Общепринятые предпочтительные клетки-хозяева для использования в настоящем изобретении включают бессмертные клетки гибридом, клетки миеломы NS/O, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка, клетки HeLa и клетки COS.

Одна из систем экспрессии, использованная для получения экспрессии с высоким уровнем слитых белков в клетках млекопитающих, - это ДНК-конструкция, кодирующая в направлении 5'→3' секреционную кассету, включающую сигнальную последовательность, Fc-фрагмент иммуноглобулина и целевой белок. В такой системе были успешно экспрессированы несколько целевых белков, включая, например, IL-2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, (βIG-H3, рецептор IgE, PSMA и gp120. Эти конструкции для экспрессии раскрыты в патентах США №№5541087 и 5726044 (авторы Lo и др.).

Понятно, что в том смысле, как он использован здесь, термин «сигнальная последовательность» означает сегмент, который обеспечивает секрецию слитого белка с интерфероном-альфа, и затем отщепляется после трансляции в клетке-хозяине. Сигнальная последовательность по настоящему изобретению представляет собой полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, инициирующую транспорт белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности, которые пригодны в настоящем изобретении, включают сигнальные последовательности легкой цепи антител, например антител 14.18 (Gillies и др. // J. Immunil. Meth. 1989. Т.125. С.191-202), сигнальные последовательности тяжелой цепи антител, например сигнальные последовательности тяжелой цепи антител МОРС141 (Sakano и др. // Nature. 1980. Т.286. С.5774) и любые другие известные в данной области сигнальные последовательности (например, см. Watson // Nucleic Acids Research. 1984. Т.12. С.5145).

Сигнальные последовательности хорошо исследованы в данной области. Известно, что они обычно содержат от 16 до 30 аминокислотных остатков и могут содержать большее или меньшее число аминокислотных остатков. Типичный сигнальный пептид состоит из трех участков: основного N-концевого участка, центрального гидрофобного участка и более полярного С-концевого участка. Центральный гидрофобный участок содержит от 4 до 12 гидрофобных остатков, которые сквозным образом закрепляют сигнальный пептид в липидном бислое мембраны при транспортировке синтезированного полипептида. После инициирования транспорта сигнальный пептид обычно расщепляется в просвете эндоплазматического ретикулума клеточными ферментами, известными как сигнальные пептидазы. Потенциальные сайты расщепления сигнального пептида, как правило, подчиняются «правилу (-3, -1)». Это означает, что типичный сигнальный пептид содержит небольшие нейтральные аминокислотные остатки в положениях -1 и -3 и не содержит в этой области остатков пролина. Сигнальная пептидаза расщепляет такой сигнальный пептид между аминокислотами -1 и +1. Таким образом сигнальная последовательность может быть отщеплена в процессе секреции от аминоконца слитого белка. Это приводит к секреции слитого белка с Fc, состоящего из Fc-фрагмента иммуноглобулина и целевого белка. Детальное обсуждение последовательностей сигнального пептида дано von Heijne // Nucleic Acids Res. 1986. Т.14. С.4683.

Как очевидно специалистам в данной области, пригодность конкретной сигнальной последовательности для использования в секреторной кассете может потребовать некоторой обычной экспериментальной проверки. Такая экспериментальная проверка включает определение способности сигнальной последовательности управлять секрецией слитого с Fc белка и также определение оптимальной конфигурации кодирования - геномной ДНК или кДНК - той последовательности, которую можно использовать для достижения эффективной секреции слитых с Fc белков. Дополнительно к этому специалист в данной области способен создать синтетический сигнальный пептид, следуя правилам, установленным von Heijne (см. ссылку выше) и проверить эффективность такой синтетической сигнальной последовательности в обычных экспериментах. Сигнальная последовательность может также иметь название «сигнальный пептид», «лидирующая последовательность» или «лидирующие пептиды».

Соединение сигнальной последовательности и Fc-фрагмента иммуноглобулина иногда здесь обозначается как секреционная кассета. Примерная секреционная кассета, пригодная в практике применения настоящего изобретения, представляет собой полинуклеотид, кодирующий в направлении 5'→3' сигнальную последовательность гена легкой цепи иммуноглобулина и фрагмент Fcγ1 гена γ1 иммуноглобулина человека. Фрагмент Fcγ1 гена иммуноглобулина γ1 предпочтительно содержит по меньшей мере часть шарнирного домена иммуноглобулина и по меньшей мере часть домена СНЗ, или более предпочтительно по меньшей мере часть шарнирного домена, домен СН2 и домен СН3. Понятно, что в том смысле, как он использован здесь, термин «часть» шарнирной области иммуноглобулина означает часть шарнира иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере один, а предпочтительно два остатка цистеина, способных образовать межцепные дисульфидные связи. ДНК, кодирующая секреционную кассету, может быть в конфигурации геномной ДНК или в конфигурации кДНК. В некоторых случаях может давать преимущество получение Fc-фрагмента из последовательностей для тяжелой цепи иммуноглобулина Fcγ2 человека. Хотя слияния с Fc, основанные на последовательностях иммуноглобулина γ1 и γ2 человека, ведут себя сходно с мышиными, у людей слияния с Fc на основе последовательностей γ2 проявляют лучшую фармакокинетику.

В другом варианте осуществления последовательность ДНК кодирует сайт протеолитического расщепления, помещенный между секреционной кассетой и целевым белком. Сайт расщепления, обеспечивающий протеолитическое расщепление кодируемого слитого белка, обеспечивает таким образом отделение домена Fc от целевого белка. Понятно, что термин «сайт протеолитического расщепления», как он использован здесь, означает аминокислотные последовательности, которые преимущественно расщепляются протеолитическим ферментом или другими агентами протеолитического действия. Пригодные сайты протеолитического расщепления включают аминокислотные последовательности, распознаваемые протеолитическими ферментами, такими как трипсин, плазмин или энтерокиназа К. Известны многие пары сайт расщепления/расщепляющий агент (см., например, патент США №5726044).

Далее, могут оказаться полезными конструкции с замещением или делецией в этих константных областях, когда один или более аминокислотных остатков доменов константной области замещены или делетированы. Одним из примеров может быть введение аминокислотных замен в верхнюю область СН2 для создания варианта Fc с пониженным сродством к рецепторам для Fc (Cole и др. // J. Immunol. 1997. Т.159. С.3613). Специалист в данной области может приготовить такие конструкции с использованием хорошо известных методов молекулярной биологии.

В приведенных здесь примерах был получен высокий уровень продуцирования слитых белков Fc-Интерферон-альфа. Исходные клоны продуцировали около 50 мкг/мл белка Fc-Интерферон-альфа, который мог быть легко очищен до гомогенности аффинной хроматографией с белком А. Путем субклонирования уровни экспрессии часто можно было повысить в несколько раз. Как указывалось выше, было показано, что если интерферон-альфа экспрессируется в виде молекул, слитых с Fc, достигается высокий уровень экспрессии, по-видимому, благодаря тому, что часть Fc служит носителем, помогающим полипептиду на С-конце правильно сворачиваться и эффективно выделяться. Кроме того, Fc-фрагмент при физиологических значениях рН гликозилирован и несет значительный заряд, поэтому Fc-фрагмент может способствовать растворению гидрофобных белков.

Кроме высоких уровней экспрессии слитые белки с интерфероном-альфа имеют большее время полужизни в сыворотке по сравнению с отдельным интерфероном-альфа частично благодаря их более значительным молекулярным размерам. Например, Fc-Интерферон-альфа имеет циркуляционное (в кровотоке) время полужизни у мышей 19,3 часа (см. пример 6), а интерферон-альфа - 2-5 ч (Physicians Desk Reference, 50^th Edition. 1996. С.2136-2147 и 2364-2373). Интерферон-альфа, имеющий молекулярный вес около 19 кДа, достаточно мал и эффективно удаляется почечной фильтрацией. В противоположность этому Fc-Интерферон-альфа имеет молекулярный вес около 100 кДа, поскольку в нем к каждой молекуле Fc присоединены две молекулы интерферона-альфа (вследствие того, что Fc находится в форме димера). Такая димерная структура может обладать более высоким сродством связывания с рецептором интерферона-альфа. Поскольку рецепторы являются посредниками в активности интерферона-альфа, бивалетные слитые белки с интерфероном-альфа потенциально более эффективны, чем сам интерферон-альфа.

Кроме того, известно, что многие белковые лиганды связываются со своими рецепторами как димеры. Поскольку интерферон-альфа принадлежит к классу белковых лигандов, характеризующихся константами слабой димеризации, физическое воздействие Fc на интерферон-альфа превращает димеризацию во внутримолекулярный процесс, сдвигая таким образом равновесие в сторону образования димеров и усиливая их связывание с рецепторами. С помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК в мономер в нужных местах можно ввести также остатки цистеина, чтобы стабилизировать димер с помощью образования ковалентной дисульфидной связи.

Слитые белки по настоящему изобретению дают несколько важных полезных клинических эффектов. Как было показано при испытаниях биологической активности на клетках Daudi и анализе цитопатогенного действия (пример 4), биологическая активность слитого белка Fc-Интерферон-альфа значительно превышает активность самого интерферона-альфа.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает конструкции, имеющие различные структурные конформации, например бивалентные или мультивалентные конструкции, димерные или мультимерные конструкции, и их комбинации. Такие функциональные конформации молекул по настоящему изобретению позволяют изучать на животных моделях синергическое действие интерферона-альфа и других противовирусных и противоопухолевых белков.

Важным аспектом настоящего изобретения является то, что последовательности и свойства белков различных интерферонов-альфа и кодирующих их ДНК очень похожи. Что касается слияний Fc-X, то свойства белков интерферонов-альфа и кодирующих ДНК настолько близки, что для получения любых слияний ДНК для белка Fc-Интерферон-альфа, экспрессии слияний, очистки слитого белка и терапевтического применения слитого белка можно использовать один и тот же набор технических приемов.

Настоящее изобретение предусматривает также способы продуцирования интерферонов-альфа из иных, чем человек, видов, в виде слитых с Fc белков. Слитые белки с интерфероном-альфа отличных от человека видов полезны для доклинического изучения интерферона-альфа, так как белковые лекарства до исследований на людях должны быть испытаны на их эффективность и токсичность на модельных системах с животными. Белок человека может не действовать в мышиной модели, поскольку этот белок может вызывать иммунную реакцию и/или иметь другую фармакокинетику, что исказит результаты испытаний. Поэтому эквивалентный мышиный белок является наилучшим заменителем человеческого белка для испытаний на мышиной модели.

Настоящее изобретение предусматривает способы воздействия на различные типы раковых заболеваний, вирусные заболевания, другие заболевания, связанные с ними болезненные состояния и вызывающие их причины, введением млекопитающему, имеющему такие симптомы, ДНК, РНК или белков согласно настоящему изобретению. Относящиеся к этому болезненные состояния могут включать (но не ограничиваются ими) гепатит В, гепатит С, гепатит D, генитальные бородавки, лейкемию ворсинчатых клеток, связанную со СПИД саркому Капоши, меланому, рак простаты и другие формы вирусных болезней и рака. В связи с широким спектром функций, который интерферон-альфа имеет в регуляции иммунных реакций, настоящее изобретение предусматривает также способы лечения болезненных состояний, поддающихся воздействию интерферона-альфа. Эти способы включают введение эффективного количества композиции по настоящему изобретению млекопитающему, имеющему болезненное состояние, которое может быть связано, но может и не быть связано непосредственно с вирусной инфекцией или раком.

Белки по настоящему изобретению могут быть полезны не только как терапевтические средства. Специалистам в данной области понятно, что эти белки полезны в продуцировании антител для диагностических целей. Подобным же образом соответствующее введение ДНК или РНК, например, в векторе или другой пригодной для этой цели системе доставки, включено в способы применения настоящего изобретения.

Fc-Интерферон-альфа как слитый белок с Fc-фрагментом иммуноглобулина может иметь чрезвычайно благоприятное распределение в тканях и несколько отличный способ действия, чем достигается клиническая эффективность, особенно с учетом его более продолжительного времени полужизни в сыворотке и возможностью введения высокой дозы растворимого белка. В частности, для печени, которая является местом поражения вирусами, вызывающими гепатит В и гепатит D, характерно высокое содержание рецепторов для Fc-гамма. Считается, что побочное неврологическое действие интерферона-альфа вызвано тем, что малый размер интерферона-альфа позволяет ему проникать сквозь гематоэнцефалический барьер. Намного больший размер слитого белка Fc-Интерферон-альфа существенно снижает степень проникновения этого белка сквозь гематоэнцефалический барьер.

Композиции по настоящему изобретению могут вводиться любым путем, допустимым для определенных молекул. Подразумевается, что композиции по настоящему изобретению могут вводиться животному любым подходящим способом - непосредственно (например, локально, как при инъекции, имплантации или местном введении в участок ткани) или системно (например, парентерально или орально). Если композиция должна быть введена парентерально (внутривенно, подкожно, офтальмологически, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутриротовым способом, ректально, вагинально, внутриглазным способом, в мозг, внутричерепным способом, интраспинально, интравентрикулярно, внутриоболочечным способом, внутриполостным способом, внутрикапсульно, интраназально или аэрозольным способом), то композиция предпочтительно содержит как часть суспензию или раствор в воде или в физиологически совместимой жидкости. Так, носитель или наполнитель являются физиологически приемлемыми, если их добавление при введении пациенту необходимой композиции не влияет неблагоприятным образом на электролитный и объемный баланс физиологических жидкостей пациента. Поэтому жидкая среда для лечебного агента может представлять собой нормальный физиологический раствор.

ДНК-конструкции (или генные конструкции) по настоящему изобретению могут также применяться как часть курса генотерапии для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих интерферон-альфа или его конструкции типа слитых белков. Настоящее изобретение обращает внимание на экспрессирующие векторы для трансфекции in vivo и экспрессии интерферона-альфа или его конструкции типа слитого белка в определенные типы клеток, чтобы восстановить или дополнить функцию интерферона-альфа. Экспрессирующиеся конструкции интерферона-альфа или его конструкции типа слитых белков могут быть введены в любой биологически эффективный носитель, например в состав или композицию, способные эффективно доставлять ген интерферона-альфа или его конструкцию типа слитого белка в клетки in vivo. Такие подходы включают внедрение надлежащего гена в вирусные векторы, включающие рекомбинантные ретровирусы, аденовирус, аденоассоциированный вирус и вирус простого герпеса 1 типа, или рекомбинантные бактериальные или эукариотные плазмиды. Предпочтительные дозы на одно введение нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки настоящего изобретения, находятся в пределах от 1 мкг/м² до 100 мг/м², более предпочтительно от 20 мкг/м² до 10 мг/м² и наиболее предпочтительно от 400 мкг/м² до 4 мг/м². Предполагается, однако, что оптимальные пути введения и дозировки могут быть определены обычным экспериментальным исследованием, что соответствует уровню квалификации в данной области.

Предпочтительные дозы на одно введение слитого белка находятся в пределах от 0,1 мг/м² до 100 мг/м², более предпочтительно от 1 мг/м² до 20 мг/м² и наиболее предпочтительно от 2 мг/м² до 6 мг/м². Предполагается, однако, что оптимальная дозировка зависит от типа требующего лечения заболевания и от наличия побочных эффектов. Однако оптимальные дозировки могут быть определены обычным экспериментальным исследованием. Введение слитого белка может быть осуществлено периодическими разовыми инъекциями или путем непрерывного внутривенного или внутрибрюшинного вливания из внешнего резервуара (например, из пакета для внутривенного вливания), или внутренним введением (например, из биологически разрушаемого имплантата). Кроме того, подразумевается, что слитые белки по настоящему изобретению могут также вводиться предназначенному реципиенту вместе с множеством различных биологически активных молекул. Предполагается, однако, что оптимальная комбинация слитого белка и других молекул, способы введения, дозировки могут быть определены обычным экспериментальным исследованием, что соответствует уровню квалификации в данной области.

Далее изобретение иллюстрируется следующими не ограничивающими его примерами.

Примеры

Пример 1. Экспрессия слитого белка huFc-huИнтерферон-альфа человека (huFc-IFN-альфа)

мРНК получали из мононуклеарных клеток периферической крови человека и подвергали обратной транскрипции обратной транскриптазой. Полученную кДНК использовали как матрицу для полимеразных цепных реакций (ПЦР), чтобы клонировать и приспособить (адаптировать) кДНК интерферона-альфа человека для экспрессии в виде слитых белков huFc-Интерферон-альфа (huFc-IFN-альфа). Прямым праймером был 5' С CCG GGT ААА TGT GAT CTG CCT CAG AC (SEQ ID NO: 5), где последовательность CCCGGG (сайт рестрикции XmaI)TAAA кодирует карбоксильный конец тяжелой цепи иммуноглобулина, за которой следует последовательность (выделенная жирным шрифтом), кодирующая N-конец интерферона-альфа. Обратным праймером был 5' СТС GAG ТСА АТС СТТ CCT CCT ТАА ТС (SEQ ID NO: 6), который кодирует последовательность (антисмысловым образом) карбоксильного конца интерферона-альфа с его стоп-кодоном трансляции (антикодон ТСА), после чего следует сайт рестрикции XhoI (CTCGAG). ПЦР-продукт длиной 517 пар нуклеотидов клонировали и секвенировали. Анализ нуклеотидной последовательности подтвердил, что ПЦР-продукт кодирует зрелый интерферон-альфа человека, адаптированный для экспрессии, т.е. с сайтом XmaI на 5'-конце и сайтом XhoI на 3'-конце.

Экспрессирующий вектор pdCs-huFc-IFN-альфа конструировали следующим образом. Рестрикционный фрагмент XmaI-XhoI, содержащий кДНК интерферона-альфа человека, пришивали лигазой к фрагменту XmaI-XhoI вектора pdCs-huFc в соответствии с работой Lo и др. // Protein engineering. 1998. Т.11. С.495. huFc - это фрагмент Fc иммуноглобулина гамма-1 человека. Итоговый вектор, pdCs-huFc-IFN-альфа использовали для трансфицирования клеток млекопитающих с целью экспрессии слитого белка huFc-IFN-альфа.

Пример 2. Трансфекция и экспрессия белка.

Для временной трансфекции плазмиду pdCs-huFc-IFN-альфа вводили в клетки 293 почки человека соосаждением плазмидной ДНК с фосфатом кальция (под ред. Sambrook и др. "Molecular Cloning - A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Press, NY, 1989) или липофекцией с использованием препарата Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) в соответствии с инструкциями поставщика.

Для получения стабильно трансфицированных клонов плазмидную ДНК вводили электропорацией в клетки NS/O миеломы мыши. Вкратце процедура состояла в следующем. Клетки NS/O выращивали в среде Игла в модификации Дальбеко с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 2 мМ глутамина и пенициллина/стрептомицина. Приблизительно 10⁶ клеток однократно промывали раствором NaCl в фосфатном буфере (phosphate buffered saline - PBS) и ресуспендировали в 0,5 мл PBS. Затем с клетками инкубировали линеаризованную плазмидную ДНК (10 мкг) в кювете для электропорации - Gene Pulse Cuvette (просвет между электродами 0,4 см, фирма BioRad) во льду в течение 10 мин. Электропорацию осуществляли с помощью импульсной установки Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA, USA) с параметрами 0,25 В и 500 мкФ. Клеткам давали восстановиться в течение 10 мин в ледяной бане, затем их ресуспендировали в ростовой среде и распределяли в два планшета на 96 ячеек. Проводили селекцию стабильно трансфицированных клонов выращиванием клеток в присутствии 100 нМ метотрексата (МТХ), который добавляли через 2 дня после трансфекции. Питательную среду заменяли 2 или 3 раза через каждые 3 дня, и устойчивые к МТХ клоны появлялись через 2-3 недели. Культуральную среду, отобранную с клонов, анализировали методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с антителами к Fc (см. Пример 3) для идентификации высокоактивных продуцентов. Высокопродуктивные клоны отбирали и поддерживали в ростовой среде, содержащей 100 нМ МТХ.

Для обычного анализа электрофорезом в геле слитые белки с Fc в необходимой среде связывали с белок А - сефарозой (Protein A Sepharose, фирма Repligen, Cambridge, MA, USA) и затем элюировали с этого сорбента кипячением в стандартном буфере для белковых образцов с добавлением или без 2-меркаптоэтанола. После электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) белковые зоны визуализовали окрашиванием красителем Кумасси голубой (Coomassie blue). Согласно SDS-PAGE кажущийся молекулярный вес слитого белка huFc-huИнтерферон-альфа был равен примерно 52 кДа.

Для очистки сорбированные на белок А - сефарозе слитые белки элюировали натрий-фосфатным буфером (100 мМ NaH₂PO₄, pH 3 и 150 мМ NaCl). После этого элюат сразу нейтрализовали добавлением 0,1 объема 2 М трис-HCl, рН 8.

Пример 3. Методика анализа ELISA

Концентрацию в надосадочных жидкостях устойчивых к МТХ клонов и в других пробах белковых продуктов, содержащих Fc человека, определяли методом ELISA с антителами к Fc человека (anti-huFc ELISA).

А. Планшеты для покрытий.

Планшеты для ELISA покрывали козьими антителами к IgG человека -AffiniPure Goat anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) с концентрацией 5 мкг/мл в PBS, 100 мкл на ячейку в планшетах на 96 ячеек (Nunc-lmmuno plate Maxisorp.). Планшеты с покрытием закрывали и инкубировали ночь при 4°С. Затем планшеты 4 раза промывали 0,05% Твином 20 (Tween 20) в PBS и проводили блокирование (остановку реакции) раствором (200 мкл на ячейку) 1% BSA/1% козья сыворотка в PBS (BSA - бычий сывороточный альбумин). После инкубации с блокирующим буфером при 37°С в течение 2 ч планшеты промывали 4 раза 0,05% твином в PBS и осушали бумажными полотенцами.

В. Инкубация с пробами и вторичными антителами

Пробы разбавляли в необходимой степени в буфере для проб (1% BSA/1% козья сыворотка/0,05% твин в PBS). Калибровочную кривую получали с использованием химерных антител (с Fc человека) с известной концентрацией. Для получения стандартной калибровочной кривой проводили последовательные разбавления в буфере для проб, чтобы получить для калибровочной кривой интервал концентраций от 125 нг/мл до 3,9 нг/мл. В планшет вносили разбавленные пробы и стандарты, 100 мкл на ячейку, и планшет инкубировали при 37°С в течение 2 ч. После инкубации планшет промывали 8 раз 0,05% Твином в PBS. Затем в каждую ячейку добавляли 100 мкл раствора вторичных антител - конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) антител к IgG человека (Jackson Immuno Research), разбавленных приблизительно 1:120000 в буфере для проб. Точную степень разбавления вторичных антител нужно было определять для каждой партии конъюгированных с HRP антител к IgG человека. После инкубации при 37°С в течение 2 ч планшет промывали 8 раз 0,05% твином в PBS.

С. Проявление

В планшет добавляли раствор субстрата (100 мкп на ячейку). Раствор субстрата готовили, растворяя 30 мг OPD (о-фенилендиамин дигидрохлорид) (1 таблетку) в 15 мл буфера состава 0,025 М лимонная кислота/0,05 М Na₂HPO₄, pH 5, содержащего 0,03% добавленной непосредственно перед использованием перекиси водорода. Развитие окраски происходило в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Время проявления можно менять в зависимости от партии покрытых планшетов, вторичных антител и т.д. Реакцию останавливали добавлением 4 Н серной кислоты (100 мкл на ячейку). Интенсивность окрашивания в ячейках планшета регистрировали автоматическим считывающим устройством "plate reader", измеряющим значения оптической плотности при 490 и 650 нм и запрограммированным на вычитание фоновой оптической плотности при 650 нм из оптической плотности при 490 нм.

Пример 4. Биологические испытания

Биологическую активность слитого белка huFc-hulFN-альфа сравнивали двумя различными методами с биологической активностью интерферона-альфа человека (hulFN-альфа) - человеческого лейкоцитарного интерферона фирмы Sigma, St. Louis, МО, USA. Анализ первого типа определяет ингибирование пролиферации линии Daudi лимфобластоидных клеток В человека (АТСС CCL 213). В анализе второго типа измеряют ингибирование цитопатогенного эффекта вируса энцефаломиокардита (EMCV) на линии клеток А549 карциномы легких человека (АТСС CCL 185).

Интерферон-альфа ингибирует пролиферацию клеток Daudi (лимфома Беркитта человека). Клетки Daudi дважды промывали средой RPMI 1640 без сыворотки и ресуспендировали в ростовой среде, состоящей из RPMI 1640 и 20% сыворотки плода коровы, инактивированной прогревом при 56°С. Затем клетки высевали в планшет с 24 ячейками (1×10⁵ клеток/мл на ячейку) в присутствии различных концентраций α-IFN (2,1×10⁶ МЕ/мг) (ME - международные единицы) и слитого белка huFc-hulFN-альфа. Было показано, что через 3-4 дня 50 пг/мл IFN-альфа в форме huFc-hulFN-альфа, вызывая 50-100% ингибирование роста клеток Daudi, был также эффективен, как 750 пг/мл hulFN-альфа. Использованный в качестве контроля интерферон-гамма (Pharmingen, San Diego, CA, USA) при концентрации 100 нг/мл в этом анализе не обладал никакой активностью.

Пример 5. Измерение противовирусной активности

Репликация вируса в культуре клеток часто приводит к цитотоксичности - этот эффект известен как цитопатогенное действие (ЦПД). Интерфероны могут индуцировать в культурах клеток антивирусное состояние и защищать клетки от такого ЦПД. Противовирусную активность IFN-альфа можно количественно охарактеризовать по подавлению цитопатогенного действия (ПЦПД), как описано в "Lymphokines and Interferons: A Practical Approach" (под ред. M.J.CIemens, A.D.Morris и A.J.H.Gearing. I.R.L. Press, Oxford, 1987). Противовирусную активность huFc-hulFN-альфа и hulFN-альфа сравнивали, используя линию клеток А549 карциномы легких человека (АТСС CCL 185) и вирус энцефаломиокардита (АТСС VR 129В) в соответствии с протоколом испытания ПЦПД, представленным в приведенной выше ссылке. Было обнаружено, что эффективные дозы, дающие 50% ПЦПД (т.е. 50% защиту), составляли 570 пг/мл (по количеству IFN-альфа) для huFc-hulFN-альфа и 500 пг/мл для hulFN-альфа. Следовательно, IFN-альфа в huFc-hulFN-альфа и в hulFN-альфа имеет практически одинаковую противовирусную активность.

Пример 6. Фармакокинетика

Фармакокинетика huFc-hulFN-альфа была определена в группе из 4 мышей линии Balb/c. В хвостовую вену каждой мыши инъекцией вводили 25 мг huFc-hulFN-альфа. Пробы крови получали ретроорбитальным кровопусканием сразу после инъекции (т.е. при времени t=0) и через 0, 5, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после инъекции. Пробы крови собирали в пробирки с гепарином для предотвращения свертывания. Клетки удаляли центрифугированием в течение 4 мин в высокоскоростной микроцентрифуге Eppendorf. Концентрацию huFc-huIFN-альфа в плазме определяли методом ELISA с антителами к Fc человека (huFc) и вестерн-блотингом с антителами к huFc, и было показано, что huFc-huIFN-альфа остается в кровотоке интактным (линия 52 кДа для huFc-huIFN-альфа). Никаких продуктов деструкции (линия 32 кДа для huFc) не было зафиксировано. Было определено, что время полужизни huFc-hulFN-альфа в кровотоке равно 19,3 ч - значительно большее, чем указанное в литературе время полужизни в кровотоке (от примерно 2 ч до 5 ч) для IFN-альфа человека (Physicians Desk Reference, 50^th edition, 1996. С.2145-2147 и 2364-2373).

Пример 7. Воздействие на рассеянный рост лимфомы Беркитта человека у мышей SCID

Клетки Daudi (лимфома Беркитта человека) росли у мышей С.В-17 SCID (Severe Combined Immune Deficiency - тяжелый комбинированный иммунодефицит) в виде рассеянных опухолей (Ghetie и др. // Intl. J. Cancer. 1990. Т.45. С.481). Примерно 5×10⁶ клеток Daudi в виде суспензии одиночных клеток в 0,2 мл PBSB инъецировали внутривенно мышам SCID в возрасте 6-8 недель. Через 3 дня мышей распределяли случайным образом на 3 группы по 8 мышей и вводили им ежедневно внутрибрюшинно 0,2 мл PBS, 30 мкг huFc-huIFN-альфа (содержащего около 12 мкг IFN-альфа) в PBS, или 60 мкг huFc-huIFN-альфа в PBS. Мышей обследовали ежедневно. Результаты представлены на фиг.2.

К 28 дню после инъекции клеток Daudi у всех мышей в контрольной группе, получавших PBS (ромбики), развился паралич задних ног. Мыши в этой контрольной (PBS) группе начали погибать на 38-й день, и к 61 дню все мыши в контрольной группе погибли. В отличие от этого, длительность жизни мышей в опытных группах была значительно большей и зависела от дозы лекарства. В группе, получавшей 30 мкг huFc-huIFN-альфа (крестики), первая гибель отмечена на 70-й день, а все мыши погибли к 134 дню. В группе, получавшей 60 мкг huFc-huIFN-альфа (треугольники), первая гибель отмечена на 126-й день, и к 153 дню погибли 4 мыши. Остальные мыши были больны и были забиты.

Пример 8. Воздействие на локализованный рост лимфомы Беркитта человека у мышей SCID

В этой модели клетки Daudi росли у мышей С.В-17 SCID как подкожные опухоли (Ghetie и др. // Intl. J. Cancer. 1990. Т.45. С.481). Примерно 6×10⁶ клеток Daudi в виде суспензии одиночных клеток в 0,1 мл PBS инъецировали подкожно мышам SCID в возрасте 6-8 недель. Лечение начинали, когда размер опухолей достигал 200-400 мм³, т.е. примерно через 4 недели. Мышей распределяли случайным образом на 3 группы по 8 мышей, и каждая группа получала 6 ежедневных внутрибрюшинных инъекций 0,2 мл PBS, 30 мкг huFc-huIFN-альфа в PBS, или 60 мкг huFc-huIFN-альфа в PBS. Результаты представлены на фиг.3. Размер опухолей измеряли дважды в неделю.

Опухоли у мышей контрольной группы (ромбики) быстро росли до среднего объема 5602 мм³ (разброс значений 4343-6566 мм³) к 35-му дню, после чего все мыши в группе были забиты. В противоположность этому, рост опухолей у мышей в опытных группах был подавлен, и подавление зависело от дозы препарата. В группах, получавших 30 мкг и 60 мкг huFc-huIFN-альфа, на 35-й день средний размер опухолей был соответственно 214 и 170 мм³, т.е. меньше, чем 268 и 267 мм³ до лечения. Фактически, подкожные опухоли полностью деградировали у 5 из 8 мышей в группе, получавшей 30 мкг huFc-huIFN-альфа, и у 4 из 8 мышей в группе, получавшей 60 мкг huFc-huIFN-альфа. После прекращения лечения, однако, некоторые опухоли снова появлялись и начинали расти. Тем не менее, две мыши в группе оставались без опухолей к 205-му дню, когда опыт был прекращен.

Пример 9. Лечение заболевания печени слитым белком Fc-Интерферон-альфа

Предполагается, что заболевание печени, например гепатит или метастазы в печени, могут более эффективно излечиваться слитым белком Fc-Интерферон-альфа, чем самим интерфероном-альфа или слитым белком интерферон-альфа-Fc.

Например, предполагается, что Fc-Интерферон-альфа может быть эффективным при применении в мышиной модели, где опухолевые клетки метастазируют в печень. Мышей анестезировали примерно за 5 мин до операции внутрибрюшинной инъекцией 80 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина в 0,2 мл PBS. Последующие этапы осуществляли в вытяжном боксе с ламинарным протоком для обеспечения стерильности. Кожу у каждой мыши промывали бетадином и этанолом. Опухолевые клетки, такие как клетки Daudi, инъецировали в течение примерно 1 мин с помощью иглы №27 в 100 мкл среды RPMI 1640 без добавок под оболочку селезенки. Через 2 мин стебель селезенки зашивали шелковым сутажом №4,0 и селезенку удаляли.

Некоторые клетки перемещались из места инъекции в печень, где они могли образовывать метастазные опухоли. Затем мышей с метастазными опухолями печени лечили слитым белком Fc-интерферон-альфа. Предполагается, что мыши, подвергнутые воздействию белка Fc-интерферон-альфа, дают существенное уменьшение роста опухоли по сравнению с мышами, получавшими эквимолярное количество интерферона-альфа или слитого белка интерферон-альфа-Fc.

Кроме того, предполагается, что специфический эффект слитого белка Fc-интерферон-альфа более выражен при лечении заболевания печени, чем при лечении нарушений, локализованных в других тканях, где Fc-интерферон-альфа не концентрируется.

Эквиваленты

Настоящее изобретение может быть осуществлено в других специфических формах без отклонения от его идеи или существенных характеристик. Следовательно, вышеизложенные варианты осуществления должны рассматриваться во всех аспектах как иллюстративные, но не ограничивающие описанное здесь изобретение. Таким образом, сфера охвата данного изобретения указана приложенной формулой, а не предшествующим описанием, и имеется в виду, что сюда включаются все изменения, не выходящие за границы смысла и области эквивалентности пунктов формулы.

Включение ссылкой

Содержание каждой из научных статей и патентных документов, на которые выше сделана ссылка, включены в данное описание ссылкой на них.

1. Слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа и обеспечивающий его концентрирование в печени, характеризующийся тем, что указанный слитый белок содержит в направлении от N-конца к С-концу Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из IgG1 или IgG3, и целевой белок, включающий, по меньшей мере, один интерферон-альфа, причем Fc-фрагмент и целевой белок соединены между собой либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика.

2. Слитый белок по п.1, отличающийся тем, что Fc-фрагмент иммуноглобулина содержит, по меньшей мере, шарнирную область иммуноглобулина, домен СН2 и домен СН3.

3. Слитый белок по п.1, отличающийся тем, что целевой белок дополнительно содержит второй интерферон-альфа полной длины или его биологически активный фрагмент.

4. Слитый белок по п.3, отличающийся тем, что первый и второй белки интерферона-альфа соединены между собой либо непосредственно либо с помощью полипептидного мостика.

5. Димерный слитый белок, содержащий два слитых белка, как они определены в п.1, соединенных ковалентной связью.

6. Димерный слитый белок по п.5, отличающийся тем, что указанные два слитых белка являются одинаковыми.

7. Молекула ДНК, кодирующая слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа и обеспечивающий его концентрирование в печени, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, которая, по существу, соответствует аминокислотной последовательности слитого белка по п.1.

8. Молекула ДНК, кодирующая сигнальную последовательность и слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа и обеспечивающий его концентрирование в печени, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, которая, по существу, соответствует аминокислотной последовательности сигнальной последовательности и слитого белка по п.1, причем указанная сигнальная последовательность и указанный слитый белок кодируются последовательно в направлении от 5' к 3'.

9. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения заболеваний печени, содержащая эффективное количество слитого белка, как он определен в п.1 или 5, по желанию в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

10. Способ адресования интерферона-альфа в ткани печени, включающий введение млекопитающему эффективного количества слитого белка по п.1 или 5.