Синтетический антиген на основе сополимеров n-винилпирролидона, кротоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола, содержащий ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена
Владельцы патента RU 2262515:
ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Минздрава РФ (RU)
Институт высокомолекулярных соединений РАН (RU)
Изобретение относится к области иммунохимии высокомолекулярных соединений, обладающих антигенными характеристиками, и может быть использовано преимущественно для выявления групп профессионального онкологического риска у рабочих, экспонированных к 2-нафтиламину. Описан синтетический антиген на основе сополимеров N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола, содержащий ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена, общей формулы:
,
где m=88,5 мол.%, n=6,8÷10,3 мол.%, l=1,2÷4,7 мол.%. Технический результат изобретения состоит в повышении специфичности антител против 2-нафтиламина как гаптена. Показана возможность получения высокоспецифических антител против канцерогена 2-нафтиламина как гаптена путем иммунизации кроликов синтетическим антигеном, в котором в качестве макромолекулярного носителя использован сополимер N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола. Обнаружена возможность практического использования этих антител для иммунологической регистрации 2-нафтиламина как гаптена в крови промышленных рабочих, экспонированных к 2-нафтиламину. 1 ил., 1 табл.
Изобретение относится к иммунохимии высокомолекулярных соединений, обладающих антигенными характеристиками.
Изобретение может найти широкое использование при иммунологическом определении в биологических жидкостях 2-нафтиламин-белковых аддуктов, являющихся специфическими маркерами профессионального онкологического риска, образующимися у лиц, имеющих контакт с 2-нафтиламином или с веществами, содержащими его в структуре молекулы, например, с анилиновыми красителями.
Известно, что 2-нафтиламин, широко используемый на различных производствах, является сильньм органотропным канцерогеном, вызывающим у людей и собак рак мочевого пузыря, а у мышей - гепатомы (Темкин И.С. Опухоли мочевого пузыря, вызванные канцерогенными аминосоединениями. - М.: Медицина, 1957 - с.36-47). К наиболее характерным для ранних стадий химического канцерогенеза иммунометаболическим нарушениям относится образование в сыворотке крови и в ткани-мишени животных канцероген-белковых антигенов (КБА) (Коростелева Т.А. Об изменениях тканевых антигенов в процессе экспериментального канцерогенеза. - Л.: Медицина, 1966, с.247). КБА обнаруживаются на ранних стадиях канцерогенеза при действии на животных канцерогенов-орто-амино-азотолуола, бензидина, 2-нафтиламина, 3-метилдиметиламиноазобензола, 3-оксиантраниловой кислоты. КБА обнаруживаются также при онкологическом риске у лиц, контактирующих с канцерогенами (Коростелева Т.А., Белохвостова А.Т. Возможности использования иммунологических маркеров для выявления групп онкологического риска в производственных контингентах (Сборник научных трудов. - Практические и научные основы профилактики канцерогенных воздействий. - Ленинград, 1984. - c.159).
Исходный сополимер N-винилпирролидона (ВП) с кротоновой кислотой (КК), используемый для получения тройного сополимера ВП-КК-n-кротоноиламинофенол и заявленного соединения на его основе описан в литературе: С.Н.Ушаков, В.А.Кропачев, Л.Б.Трухманова, Р.И.Груз, Т.М.Маркелова, «О сополимеризации кротоновой кислоты с винилпирролидоном»//Высокомолекулярные соединения, т. IX (А), №8, с.1807-1813, 1967.
Эти факторы послужили основой для разработки иммунологического метода регистрации 2-нафтиламина как гаптена в биологических материалах в качестве маркера онкологического риска.
Описан антиген, содержащий ковалентно присоединенный к белковому носителю 2-нафтиламин в качестве гаптена (Скачков А.П. Изучение тканевых антигенов и антител на ранних стадиях канцерогенеза при действии 2-нафтиламина. Автореферат канд. дисс., Л., 1970). Этот антиген является прототипом заявляемого изобретения. Автор использовал антитела против 2-нафтиламин-антигена как реактивы для выявления 2-нафтиламина, входящего в антигенные комплексы, образующиеся в организме животных при введении им этого канцерогена. Поиски КБА приводились при помощи реакции преципитации в геле.
Недостатком известного комплексного решения, направленного на получение синтетического антигена, содержащего ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена, является необходимость использования в качестве макромолекулярных носителей белков сыворотки крови различных животных, имеющих общевидовые антигены. Иммунизация антигенами, содержащими остаток 2-нафтиламина, присоединенный к белку, неизбежно приводит к образованию побочных антител к общевидовым антигенам, что затрудняет качественную и количественную интерпретацию конечных результатов определения 2-нафтиламин-белковых антигенов, образующихся в организме. В связи с этим автор прототипа был вынужден ставить дополнительные реакции истощения общевидовых антигенов.
Техническим результатом изобретения является повышение специфичности антител против 2-нафтиламина как гаптена.
Это достигается использованием для выработки антител против 2-нафтиламина синтетического антигена, представляющего собой азопроизводные 2-нафтиламина на основе сополимера N-винилпирролидона с кротоновой кислотой и кротоноиламинофенолом общей формулы I:
где m=88,5 мол.%; n=6,8÷10,3 мол.%; l=1,2÷4,7 мол.%.
Способ получения этого антигена реализуется следующим образом:
1. Аминогруппу 2-нафтиламина диазотируют с получением хлористого 2-нафтиламиндиазония. Проводят азосочетание сополимеров N-винилпирролидона с кротоновой кислотой и n-кротоноиламинофенолом II с хлористым 2-нафтиламиндиазонием III в водном растворе при 0÷5°С сначала в кислой (рН 4,2÷4,6), а затем в щелочной (рН 9,0÷9,4) среде.
2. При этом молярные количества терполимера (в расчете на одно звено n-кротоноиламинофенола) хлористого 2-нафтиламиндиазония составляют 1:2÷2,2. Схему синтеза антигена 1 можно представить следующим образом:
Анализ известного уровня науки и техники показал отсутствие информации о тройных сополимерах общей формулы 1.
Строение терполимера 1 подтверждено методом ПМР-спектроскопии. В ПМР-спектре терполимера 1, снятого в дейтерированном диметилформамиде, в области 0,5÷5,0 м.д. сохраняются сигналы исходного тройного сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и с n-кротоноиламинофенолом (n-КАФ). В отличие от ПМР-спектра терполимера II в ПМР-спектре продукта азосочетания I обнаруживается интенсивный сигнал в области 7,9-8,5 м.д., относящийся к протонам бензольного ядра звена п-КАФ, находящихся в орто- и в мета-положениях к азогруппе. Отсутствие сигнала при 6,8-7,3 м.д. позволяет утверждать, что замещение протонов на остаток азо-2-нафтиламина произошло в двух местах бензольного кольца звена n-КАФ. Сравнение площадей пиков в области 7,4-7,8 м.д. и в области 7,9-8,5 м.д. в ПМР-спектре коньюгата I позволило определить места замещения протонов бензольного ядра звена n-КАФ на остаток азо-2-нафтиламина. Наблюдаемым в спектре пикам равной площади соответствует только замещение в положениях 2 и 6 бензольного кольца звена n-КАФ.
Для определения содержания остатков 2-нафтиламина в продукте азосочетания снимали его УФ спектр в этаноле в референции с раствором исходного сополимера II. Использовали калибровку Д280 - С (мкг/мл), ранее установленную для 2-нафтиламина, в УФ спектре которого имеется интенсивная полоса поглощения (lg∑=4,2) с максимумом при 280 нм.
Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приводим примеры его конкретного выполнения.
А. Приготовление водного раствора хлористого 2-нафтиламиндиазония.
К суспензии 0,001 кг 2-нафтиламина в смеси 0,01 л дистиллированной воды и 0,003 л концентрированной соляной кислоты, охлажденной до 0°С, по каплям при перемешивании добавляют охлажденный раствор 0,58·10-3 кг нитрита натрия в 0,01 л воды. Полученный прозрачный раствор темно-желтого цвета перемешивают при 0°С в течение 30 мин.
Б. Примеры 1-6 по синтезу антигена I.
Пример 1.
К охлажденному до 5°С раствору терполимера II (m=88,5 мол.%, n=10,3 мол.%, 1=1,2 мол.% с молекулярной массой 11.000) в 0,01 л. воды по каплям приливают при перемешивании 1,5·10-3 л полученного раствора хлористого 2-нафтиламиндиазония, содержащего 0,06·10-6 кг соли диазония, и добавлением сухого бикарбоната натрия доводят рН раствора до 4,3. Смесь перемешивают в течение 30 мин и доводят рН реакционного раствора до 9,2 с помощью 5% раствора NaOH. Азосочетание проводят при этом значении рН в течение 1 часа при 5°С и еще в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем проводят диализ полученного раствора против воды в течение 3 суток. Продукт реакции выделяют путем лиофильной сушки. Получают 1,23·10-3 кг (79,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=10,3 мол.%, l=1,2 мол.%), содержащего 3,3 мас.% связанного 2-нафтиламина.
Проводят иммунизацию беспородных кроликов разводки Рапполовского питомника весом 1,5-2 кг 5% водным раствором полученного антигена по следующей схеме:
1. Один раз в неделю внутрикожно в 10 точек вдоль спинного хребта на расстоянии 1,5-2 см от него в обе стороны (по 5 точек с каждой стороны) вводят 1,0·10-3 л водного раствора антигена I.
2. Через неделю повторяют внутрикожное введение антигена I в той же дозе также в 10 точек спины.
3. Через 2 недели вводят раствор антигена I под обе лопатки подкожно и внутрибрюшинно в общей дозе 1,5·10-3 л.
4. Через 1,5 месяца вводят раствор антигена I по 0,5·10-3 л внутривенно через день три раза в неделю. Кровь берут на 9-й день после последней инъекции. В дальнейшем кроликов реиммунизируют через 3-4 месяца, используя только внутривенное введение антигена.
На следующий день после взятия крови сыворотку отделяют от сгустка центрифугированием в течение 10 мин при 400g. Сыворотку концентрируют в 2 раза в целлофановых трубках под вентиляторами, консервируют борной кислотой и используют для постановки реакции встречной иммунодиффузии в агаре и реакции связывания комплемента (РСК).
Для постановки реакции преципитации в агаре используют 1% водный раствор агара Дифко. Для постановки РСК используют готовую гемолитическую сыворотку против эритроцитов барана и сухой комплемент. В качестве антигенов применяют водные растворы антигена I и гетерологичных азопротеинов, содержащих 2-нафтиламин, присоединенный к белкам человеческой сыворотки крови. Титрование антигенов проводят перед постановкой каждого опыта. Связывание комплемента осуществляют при объеме 0,5·10-5 л в платах. РСК ставят на холоду при +4°С (18 часов).
Результаты испытаний иммунсыворотки приведены в таблице. В графе А указаны содержания в мол.% антигена I в последних разведениях, дающих видимую реакцию преципитации в агаре с сыворотками крови интактных (контроль) и иммунизированных антигеном I кроликов. В графе Б указаны титры антител против 2-нафтиламинга в РСК.
Пример 2.
В условиях примера I из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=9,0 мол.%, 1=2,5 мол.%) и 0,081·10-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,74·10-3 кг (69,2%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=9,0 мол.%, l=2,5 мол.%), содержащего 6,6 мас.% 2-нафтиламина.
По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против 2-нафтиламина приведены в таблице.
Пример 3.
В условиях примера 1 из 0,7·10-3 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=7,6 мол.%, l=3,9 мол.%) и 0,093·10-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,58·10-3 кг (75,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=7,6 мол.%, l=3,9 мол.%), содержащего 9,8 мас.% 2-нафтиламина.
По схеме, описанной в примере 2, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки приведены в таблице.
Пример 4.
В условиях примера 1 из 0,8·10-3 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=6,8 мол.%, 1=4,7 мол.%) и 0,127·10-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,67·10-3 кг (74,2%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=6,8 мол.%, l=4,7 мол.%), содержащего 11,5 мас.% 2-нафтиламина.
По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки приведены в таблице.
Пример 5 (контрольный).
В условиях примера 1 из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=5,7 мол.%, l=5,8 мол.%) и 0,19·10-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,82·10-3 кг (70,7%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=5,7 мол.%, 1=5,8 мол.%), содержащего 13,7 мас.% 2-нафтиламина.
Полученный антиген в воде не растворяется, поэтому иммунизацию кроликов этим антигеном не проводили.
Пример 6 (контрольный).
В условиях примера 1 из 0,001 кг терполимера II (m=88,5 мол.%, n=10,6 мол.%, l=0,5 мол.%) и 0,016·10-3 кг хлористого 2-нафтиламиндиазония получают 0,65·10-3 кг (64,3%) антигена I (m=88,5 мол.%, n=10,6 мол.%, l=0,5 мол.%), содержащего 1,4 мас.% 2-нафтиламина.
По схеме, описанной в примере 1, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытания полученной иммунсыворотки показали, что в ней отсутствуют антитела против 2-нафтиламина.
Как видно из данных таблицы, результаты испытаний иммунсывороток как в реакции встречной иммунодиффузии в агаре, так и в РСК, свидетельствуют о том, что при иммунизации животных антигеном I, полученным по примерам 1-4, может быть получена иммунсыворотка, содержащая антитела против 2-нафтиламина как гаптена. Наиболее высокий титр антител обнаружен в иммунсыворотке, полученной при иммунизации кроликов антигеном I по примеру 3. Для подтверждении специфичности присутствующих в ней антител против 2-нафтиламина как гаптена используют реакцию частичной идентичности путем исследования иммунсыворотки с антигеном I и гетерологичным антигеном, содержащим тот же гаптен-2-нафтиламин, но другой носитель - альбумины лошадиной сыворотки.
| Таблица | ||||||
| Результаты испытаний иммунсывороток, полученных при иммунизации кроликов антигеном I. | ||||||
| № примера по заявке | Антиген I | |||||
| mI, мол. % | nI, мол. % | 1I мол.% | Содержание 2-нафтиламина мас.% | Результаты испытаний иммунсывороток | ||
| При помощи метода иммунодиффузии в агаре | При помощи РСК | |||||
| 1 | 88,5 | 10,3 | 1,2 | 3,3 | - | - |
| 2 | 88,5 | 9,0 | 2,5 | 6,6 | 9,3·10-5 | 1:256 |
| 3 | 88,5 | 7,6 | 3,9 | 9,8 | 1,2·10-8 | 1:8192 |
| 4 | 88,5 | 6,8 | 4,7 | 11,5 | 11,2·10-5 | 1:128 |
| 5 контрольный | 88,5 | 5,7 | 5,8 | 13,7 | Не определено, так как антиген не растворим в воде | |
| 6 контрольный | 88,5 | 10,6 | 0,5 | 1,4 | Нет антител против 2-нафтиламина | Нет антител против 2-нафтиламина |
На фото показаны результаты реакции частичной идентичности при взаимодействии иммунсыворотки кролика, иммунизированного антигеном I по примеру 3, содержащим 2-нафтиламин (1), с этим антигеном (2) и с гетерологичным антигеном, содержащим тот же гаптен-2-нафтиламин, но другой носитель - альбумины лошадиной сыворотки (3). Образование "шпоры", видной на фото, свидетельствует о присутствии антител против 2-нафтиламина в исследуемой иммунсыворотке кролика, дающих реакцию частичной идентичности при взаимодействии их с антигенами, содержащими один и тот же гаптен-2-нафтиламин, но различные макромолекулярные носители. Как видно на фото, взаимодействия этой иммунсыворотки с белковым носителем - альбуминами лошадиной сыворотки (4), не наблюдалось.
Иммунсыворотка, содержащая антитела против 2-нафтиламина как гаптена, полученная путем иммунизации кролика 2-нафтиламин-полимерным антигеном по примеру 3, была использована как тест-система при определении 2-нафтиламина в сыворотке крови рабочих ЛПО "Красный треугольник", у которых возможна экспозиция 2-нафтиламином. При помощи этой иммунсыворотки 2-нафтиламин-антиген был обнаружен у 5 из 43 обследованных рабочих, что составляет 11,6%. При помощи иммунсыворотки кролика, полученной путем иммунизации 2-нафтиламин-антигеном, содержащим белковый носитель (альбумины лошадиной сыворотки), 2-нафтиламин-антиген был обнаружен у 3 из 50 рабочих, что составляет 6,0%. Эти данные свидетельствуют о достижении положительного эффекта путем повышения точности определения 2-нафтиламина как гаптена в крови рабочих по сравнению с прототипом при использовании в качестве тест-системы иммунсыворотки, полученной путем иммунизации кроликов 2-нафтиламин-полимерным антигеном.
Анализ таблицы позволяет подтвердить критериальные значения заявляемых составов антигенов I:
А. Заявлено содержание звеньев n-кротоноиламинофенола в исходном терполимере II, равное 1,2÷4,7 мол.%. Снижение содержания этого звена до 0,5 мол.% (пример 6) приводит к потере положительного эффекта.
Б. Молярное соотношение n-кротоноиламинофенольных звеньев и хлористого 2-нафтиламиндиазония составляет 1:2÷2,2, что обеспечивает введение двух молекул 2-нафтиламина в бензольное кольцо указанного звена.
Синтетический антиген на основе сополимеров N-винилпирролидона, кретоновой кислоты и n-кротоноиламинофенола, содержащий ковалентно присоединенный 2-нафтиламин в качестве гаптена, общей формулы
где m=88,5 мол.%, n=6,8÷10,3 мол.%, l=1,2÷4,7 мол.%.
