Способ определения содержания свободных аминокислот - лизина и/или метионина - в кормовых средствах

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к анализу кормовых средств, кормовых добавок и других препаратов, содержащих лизин и метионин. Для определения содержания свободных аминокислот - лизина и/или метионина в кормовых средствах готовят растворы кормовых средств, перешедшие в раствор, определяемые аминокислоты превращают в их дансильные производные и определяют их содержание в растворе методом капиллярного электрофореза. По полученным данным рассчитывают содержание свободного лизина и метионина в анализируемом образце кормового средства. Это позволяет быстро и достоверно определять содержание свободных лизина и метионина в кормовых средствах. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, к кормопроизводству, а именно к методам анализа кормовых средств, кормовых добавок и других препаратов, содержащих лизин и метионин.

В центре проблемы создания сбалансированных кормов для высокопродуктивных пород сельскохозяйственных животных и птицы стоит вопрос состава и соотношения аминокислот в кормах.

Известные и применяемые в настоящее время методики анализа аминокислот основаны на разделении их методом ионообменной хроматографии на аминокислотных анализаторах [1], [2]. Метод в достаточной мере отработан, но не получил широкого распространения в практике лабораторий по анализу кормов из-за дороговизны аминокислотного анализатора, сложности его эксплуатации, необходимости высокой квалификации обслуживающего персонала, длительности анализа и высокой погрешности количественного определения (25%).

Известен метод капиллярного электрофореза и прибор «Капель» для его осуществления [3].

Однако ни в патентах, ни в технической литературе не описаны способы определения аминокислот методом капиллярного электрофореза, в том числе не описано применение данного метода для анализа кормовых средств.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является ускорение, упрощение определения содержания в кормовых средствах свободных аминокислот - лизина и/или метионина, повышение достоверности определения.

Указанный технический результат достигается тем, что способ определения содержания свободных аминокислот, в том числе лизина и/или метионина, в кормовых средствах заключается в отборе пробы анализируемого кормового средства, приготовлении ее раствора, определении содержания аминокислот в приготовленном анализируемом растворе, расчете содержания аминокислоты в анализируемом кормовом средстве по полученным данным, причем при определении лизина и/или метионина содержание аминокислоты в приготовленном растворе доводят предпочтительно до 0,005-0,05 мг/см³, затем ее превращают в ее дансильное производное путем взаимодействия с раствором дансилхлорида, предпочтительно с концентрацией 1,4-1,6 г/см³ в течение 45-60 мин при температуре 20-24°С и рН 9,5-10,5 или в течение 8-12 мин при температуре 50-60°С и рН 9,5-10,5. Содержание аминокислоты в анализируемом растворе определяют по содержанию в нем ее дансильного производного. Кроме того, определение проводят предпочтительно методом капиллярного электрофореза с использованием капилляра длиной 500-700 мм, диаметром 65-85 мкм, объем вводимого в капилляр анализируемого раствора не превышает 2% объема капилляра при времени ввода в капилляр анализируемого раствора 25-35 сек, при этом напряжение питания прибора составляет 187-242В, напряжение на электродах -18-22 кВ.

При попытке использовать метод капиллярного электрофореза для определения свободных аминокислот (лизина, метионина и других) в кормовых средствах было установлено, что прямое определение данных аминокислот данным известным методом не позволяет получать достоверные результаты. Неожиданно было выяснено, что достоверность определения можно повышать, если превратить определяемые аминокислоты в их дансильные производные, полученные в определенных условиях (при определенном соотношении концентраций взаимодействующих соединений, при определенной температуре проведения взаимодействия). Установлено, что на достоверность определения аминокислот - лизина и метионина также дополнительно влияет режим проведения анализа (габариты капилляра, напряжение, подаваемое на его концы, объем и время ввода в него анализируемого раствора, концентрация раствора электролита, используемого для разделения смеси).

Указанные выше параметры дают наилучшие результаты, но не исчерпывают всех возможных режимов определения свободных аминокислот.

Ниже приведены примеры реализации способа согласно изобретению.

ПРИМЕР 1. Определение содержания свободных аминокислот - лизина и/или метионина проводят в образцах комбикормов, кормовых добавках, премиксах, кормовых концентратах и других препаратах, содержащих лизин и метионин. Отбирают пробу анализируемого кормового средства, вносят ее в мерную колбу, заливают буферным раствором, рН 10,0, после тщательного перемешивания раствор центрифугируют, надосадочную жидкость фильтруют и для анализа используют полученный фильтрат. При приготовлении раствора анализируемого образца, ориентируясь на предполагаемое содержание в нем определяемой аминокислоты, обеспечивают ее содержание в растворе в пределах 0,005-0,5 мг/см³. Для приготовления дансильных производных анализируемых аминокислот к приготовленному раствору добавляют раствор дансилхлорида в ацетонитриле концентрации 1,45 г/см³ и выдерживают приготовленную смесь в течение 45 минут при температуре 24°С. Затем приготовленный раствор дансильного производного вводят в капилляр длиной 600 м, диаметром 75 мкм в объеме, равном 1,5% от объема капилляра. Время ввода - 25 сек. Методом капиллярного электрофореза с использованием прибора «Капел-103Р» производства НПО Аналитического приборостроения «ЛЮМЭКС», Санкт-Петербург, определяют количество вносимого производного в анализируемом растворе. При этом напряжение питания прибора составляет 187 В, напряжение на электродах - 18 В, время определения - 11,5 мин.

Массовую долю L-лизина, %, в испытуемой пробе вычисляют по математическому выражению:

X_L=C_L×V×100/m×1000,

где:

C_L - концентрация L-лизина монохлоргидрата в испытуемой пробе (по результатам измерений), мг/см³;

V - объем испытуемого раствора, см³;

М - масса навески, г;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

1000 - коэффициент перевода г в мг.

Массовую долю D, L-метионина, %, в испытуемой пробе вычисляют по математическому выражению:

X_M=C_M×V×100/m×1000,

где:

C_L - концентрация D, L-метионина в испытуемой пробе (по результатам измерений), мг/см³;

V - объем испытуемого раствора, см³;

М - масса навески, г;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

1000 - коэффициент перевода г в мг.

Другие свободные кислоты, присутствующие в анализируемой пробе, не мешают определению свободных лизина и метионина, так как они имеют разный ионный радиус, от которого зависит их скорость движения по капилляру под действием электрического поля.

Для подтверждения достоверности определения содержания аминокислот в кормовых средствах проводили дополнительно параллельное определения содержания аминокислоты в образце кормового средства и в нем же после дополнительного внесения в него заведомого количества определяют аминокислоты (Метод добавок).

Результаты определения приведены в таблице. Представленные в таблице данные свидетельствуют о высокой достоверности определения содержания свободных аминокислот - лизина и метионина в кормовых средствах.

Таблица
№ п/п	Образец	Ожидаемое содержание аминокислоты, %	Найденное содержание аминокислоты, %
1.	Комбикорм	0,1 лизина	0,095 лизина
2.	Комбикорм	0,1 лизина	0,107 лизина
3.	Комбикорм	0,1 лизина + 0,1 метионина	0,095 лизина + 0,103 метионина
4.	Комбикорм концентрат	0,4 метионина	0,38 метионина
5.	Кормовой концентрат лизина (сухой)	12,8 лизина	12,6 лизина
6.	Кормовой концентрат лизина (жидкий)	12,3 лизина	12,5 лизина
7.	Комбикорм + лизин	0,1 лизина + 0,08 лизина	0,192 лизина
8.	Комбикорм + метионин	0,1 лизина + 0,18 метионина	0,103 лизина + 0,175 метионина
9.	Комбикорм + лизин + метионин	0,1 лизина + 0,08 лизина + 0,08 метионина	0,168 лизина + 0,079 метионина

ПРИМЕР 2. Проводят определение содержания свободных аминокислот - лизина и метионина в кормовых средствах по методике примера 1, но для получения дансильных производных аминокислот используют раствор дансилхлорида с концентрацией 1,55 г/см³. Реакцию взаимодействия проводят в трех экспериментах: в течение 60 мин при 20°С, в течение 9 мин при 60°С и в течение 11 мин при 50°С. Время ввода анализируемого раствора в капилляр - 35 сек, объем вводимого раствора - 20% от объема капилляра. Напряжение питания прибора составляет 242 В, напряжение на электродах - 22 кВ, время определения - 12,5 мин. Ошибка определения не превышает 10%.

ПРИМЕР 3. Проводят определение содержания свободных аминокислот - лизина и метионина в образцах кормовых средств по методике примера 1, но для работы с прибором использовали анализируемые растворы кормовых средств без превращения анализируемых аминокислот в их дансильные производные. Ошибка определения составляет 100%.

ПРИМЕР 4. По методике примера 2 проводят определение содержания свободных аминокислот в образцах кормовых средств, но изменяют условия образования дансильных производных лизина и метионина с выходом за заявленные пределы. Наблюдают уменьшение уширения пиков, размытие пиков на электрофореграммах не наблюдается. Ошибка определения составляет 3,7%.

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет быстро и с высокой достоверностью определять содержание свободных аминокислот - лизина и метионина в кормовых средствах.

Источники информации:

1. ГОСТ 13496.21-87. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения лизина и триптофана. Утв. 25.05.1987.

2. ГОСТ 13496.22-90. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения цистина и метионина. Утв. 15.12.1990.

3. Система капиллярного электрофореза типа «Капель-103А». Руководство по эксплуатации 023.00.00.00.РЭ. НПФ Люмэкс, Санкт-Петербург, 1998 г.

1. Способ определения содержания свободных аминокислот в кормовых средствах, заключающийся в отборе пробы анализируемого кормового средства, приготовлении ее раствора, определении содержания аминокислот в приготовленном анализируемом растворе, расчете содержания аминокислоты в анализируемом кормовом средстве по полученным данным, причем аминокислоту в приготовленном растворе превращают в ее дансильное производное путем взаимодействия с раствором дансилхлорида, а содержание аминокислоты в анализируемом растворе определяют методом капиллярного электрофореза по содержанию в нем ее дансильного производного.

2. Способ по п.1, при котором при определении содержания лизина и/или метионина предполагаемое содержание аминокислоты в приготовленном растворе доводят до 0,005-0,05 мг/см³, а взаимодействие осуществляют с раствором дансилхлорида с концентрацией 1,4-1,6 г/см³ в течение 45-60 мин при температуре 20-24°С или в течение 8-12 мин при температуре 50-60°С при рН 9,5-10,5.

3. Способ по п.1 или 2, при котором определение проводят методом капиллярного электрофореза с использованием капилляра длиной 500-700 мм, диаметром 65-85 мкм, объем вводимого в капилляр анализируемого раствора не превышает 2% от объема капилляра при времени ввода в капилляр анализируемого раствора 25-35 с, при этом напряжение питания прибора составляет 187-242 В, напряжение на электродах - 18-22 кВ.