6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид и фармацевтическая композиция на его основе
Изобретение относится к новым 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацил гидрохлоридам общей формулы (I), где R является алкилом с 1-4 атомами углерода, которые обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью и могут быть использованы в качестве иммуномодулятора и антимикобактериальных средств. Изобретение также относится к фармацевтической композиции на их основе. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 10 табл.
Изобретение относится к области биологическиактивных веществ, в частности к 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлоридам, которые обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью и могут быть использованы в качестве иммуномодулятора и антимикобактериальных средств, а также к фармацевтической композиции на их основе.
Известны щелочные соли N-(6-алкил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида формулы (А) (Изодинафон)
где R является алкилом с 1-4 атомами углерода и М является щелочным металлом, обладающие аналогичной активностью с токсичностью 7000 мг/кг (см. международную заявку на патент WO 01/32650). Однако их активность не достаточно высока (см. нижеследующие таблицы).
Известен также N-(6-метил-2.4-диоксо-1.2.3.4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N-изоникотиноилгидразид гидрат (В), обладающий антимикобактериальной и иммуномодулирующей активностями (патент RU 2141322). Однако данное соединение (В) не растворяется в воде, физрастворе и других растворителях, имеет плохую растворимость в биологических жидкостях, что свидетельствуют о его низкой биологической активности, невысокой биодоступности.
В основу изобретения положена задача - изыскание новых близких по структуре соединений, обладающих более высокой активностью.
Задача решается предложенными 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфо-гидразоил)урацилгидрохлоридами общей формулы (I)
где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.
6-Метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид формулы (I) представляют собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета с температурой плавления Тпл= 253-254°С.
Предложенные соединения получают путем взаимодействия гидразида изоникотиновой кислоты с 6-метилурацил-5-сульфохлоридом в растворителе.
Соединения формулы (I) обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью.
Задача также решается предложенной фармацевтической композицией, обладающей антимикобактериальной и иммунотропной активностью, включающей активное вещество и целевые добавки, отличие которой состоит в том, что в качестве активного вещества она содержит 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I) в эффективном количестве.
Дозировка зависит от возраста, состояния и веса пациента, а также от вида введения. Согласно изобретению, предлагаемая фармацевтическая композиция содержит активного вещества в количестве от 0,1 до 4 г.
Токсичность предложенных соединений была определена на белых беспородных мышах весом 18-20 г в остром опыте по методу Литчфильда-Уилкоксона и составила более 7000 мг/кг.
Заявленные соединения были испытаны в экспериментах на животных.
Определение иммунотропной активности предложенного гидрохлорида
а) Влияние на гуморальный иммунитет изучали с помощью метода локального гемолиза в геле. Мышей гибридов F1 (СВА × С57BI6) иммунизировали эритроцитами барана в дозе 5×106 и сразу после этого вводили изучаемые вещества как перорально в крахмальной суспензии, так и парентерально. На 5-е сутки подсчитывали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и определяли индекс стимуляции иммунного ответа по отношению число АОК в опытной группе к числу АОК в контрольной группе.
Данные представлены в таблице 1.
| Таблица 1. Влияние исследуемых соединений на накопление антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме). | |||||
| Название препарата | Способ введения | Доза м кг/мышь | Количество АОК в селезенке | Кол-во животных | Индекс стимуляции иммунного ответа |
| Контроль | перорально | 0,5 мл крахм. суспензии | 500±50 | 12 | 1,0 |
| Гидрохлорид | перорально | 500 | 2850±150 | 12 | 5,3±0,5 |
| Изодинафон | перорально | 500 | 2360±250 | 12 | 4,6±0,7 |
| Контроль | парентерально | 0,2 мл физиол. раствора | 510±50 | 12 | 1,0 |
| Гидрохлорид | парентерально | 100 | 1800±100 | 12 | 403±0,6 |
| Изодинафон | парентерально | 100 | 1650±280 | 12 | 3,20±0,6 |
Индексы стимуляции иммунного ответа гидрохлорида и изодинафона при введении препаратов внутрь достоверно неразличимы между собой. Это говорит о том, что исследуемые препараты обладают близким действием на гуморальный иммунитет, тестируемый в реакции накопления АОК в селезенке мышей.
б) Влияние исследуемых препаратов на пролиферацию Т-лимфоцитов изучали на модели in vitro. Для этого проводили предварительную 3-х часовую инкубацию мононуклеарных клеток человека в присутствии различных концентраций каждого исследуемого вещества. Изучали широкий диапазон концентраций каждого исследуемого вещества: от 0,01 до 5 мкг/л. В качестве негативного контроля добавляли физиологический раствор 0,9% NaCI.
Результаты влияния новых соединений на интенсивность пролиферации Т-лимфоцитов человека в культуре клеток in vitro представлены в таблице 2.
| Таблица 2. Влияние гидрохлорида на пролиферацию Т-лимфоцитов в культуре in vitro. | |||
| Препарат | Доза, мкг/мл | Интенсивность включения 3Н-тимидинов ДНК культивируемых клеток (импульс/мин) | |
| Спонтанная | Активированная ФГА | ||
| Физраствор | 800 | 20002 | |
| Гидрохлорид | 5 | 900 | 20132 |
| 1 | 1275 | 25400 | |
| 0,1 | 1301 | 38000 | |
| 0,03 | 1980 | 31150 | |
| 0,01 | 1530 | 29990 | |
| Изодинафон | 5 | 620 | 19142 |
| 1 | 812 | 22068 | |
| 0,1 | 1144 | 28145 | |
| 0,03 | 1762 | 34284 | |
| 0,01 | 1496 | 29586 |
Таким образом, предлагаемый гидрохлорид также как и изодинафон обладает как собственной митогенной активностью, так и в ответ на фитогемагглютинин, но проявляет эту активность при добавлении в меньшей дозе.
в) Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов изучали по клиренсу туши в крови, взятой из ретроорбитального синуса мышей, получавших препараты перорально. Результаты оценивали по фагоцитарному индексу (таблица 3).
| Таблица 3. Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме). | ||||
| Препарат | Способ введения | Доза, мкг/мышь | Фагоцитарный индекс | Кол-во животных |
| Крахмальная сусп. | перорально | 0,5 мл | 4,2±0,06 | 12 |
| Гидрохлорид | перорально | 500 | 7,1±0,03 | 12 |
| Изодинафон | перорально | 500 | 6,64±0,12 | 12 |
| Физраствор | парентерал. | 0,2 мл | 4,1±0,07 | 12 |
| Гидрохлорид | парентерал. | 100 | 7,5±0,06 | 12 |
| Изодинафон | парентерал. | 100 | 7,12±0,09 | 12 |
Результаты, приведенные в таблице, говорят о том, что гидрохлорид стимулирует фагоцитарную активность макрофагов в большей степени, чем изодинафон при любом способе введения.
г) Иммунокорригирующая способность гидрохлорида была определена на модели иммунодефицита, вызванного облучением мышей F1 (СВА х С57BI6) в дозе 4 Грэя.
Показано, что облучение мышей в дозе 4 Грэя уменьшает иммунный ответ в 15-20 раз, его восстановление начинается на 6-8 сутки и заканчивается к 30 суткам (Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф., Филатов П.П. Действие ионизирующей радиации на соотношение популяций лимфоидных клеток у мышей, Радиобиология, 1976 г., т. 16, №3, стр. 451-454). При использовании этой модели подопытным животным вводили испытуемые препараты в дозах 500 мкг/мышь перорально в 0,5 мл крахмальной суспензии и 100 мкг/мышь парентерально в 0,2 мл физраствора. Препараты вводили трижды на 6,7,8 сутки после облучения. Контрольная группа животных получала 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора. На 15 сутки у этих животных определяли количество АОК в селезенке методом локального гемолиза в геле.
Полученные данные представлены в таблице 4.
| Таблица 4. Влияние гидрохлорида на восстановление процесса формирования антителообразующих клеток селезенки у облученных животных. | |||||
| Препарат | Способ введения | Дозы мкг/мышь | Кол-во животных | АОК на селезенку | Индекс стимуляции |
| Облученный контроль | 12 | 309±36 | |||
| Гидрохлорид | Перорально | 500 | 12 | 1080±39 | 3,5±0,4 |
| Изодинафон | Перорально | 500 | 12 | 995±12 | 3,2±0,5 |
| Контроль физ. раствор | Парентерально | 0,2 мл | 12 | 312±40 | |
| Гидрохлорид | Парентерально | 100 | 12 | 1200±54 | 4,0±0,2 |
| Изодинафон | Парентерально | 100 | 12 | 1074±12 8 | 3,5±0,5 |
На основании полученных данных по восстановлению иммунного ответа после облучения можно сделать вывод, что гидрохлорид проявляет большую иммунокорригирующую активность чем у препаратов сравнения.
Определение противотуберкулезной активности гидрохлорида.
Активность проверялась в сравнении с изодинафоном. Для заражения использовались лабораторные штаммы микобактерий туберкулеза Н37RV обычный и тубазидоустойчивый до 100 мг. 230 мышей линии СВА заражали внутривенно 0,25 мг культуры микробактерий туберкулеза в 0,5 мл физраствора. Опыт продолжался 2 месяца. Под наблюдением находилось 20 групп животных по 15 мышей в каждой группе, все животные содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе. Контрольные группы получали в течение всего опыта через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора парентерально. Опытные группы животных получали препараты перорально в различных дозах в 0,5 мл крахмальной суспензии или в 0,2 мл физраствора парентерально. Все животные, как павшие, так и забитые, по окончании опыта взвешивались, также взвешивались их внутренние органы, определялась степень поражения внутренних органов, оцениваемая в «+», кроме этого о действии препарата судили по средней продолжительности жизни (СПЖ).
Результаты экспериментов приведены в таблице 5.
| Таблица 5. Влияние исследуемых веществ на противотуберкулезную активность. | ||||||
| Препараты, дозы, способ введения | Н37RV | H37RV-тубазидоустойчивость | ||||
| СПЖ, сутки | Вес легкого, мг | Индекс поражения | СПЖ, сутки | Вес легкого, мг | Индекс поражения | |
| Контроль 0,5 мл крах. | 24,2 | 619,2 | 2,48 | 23,8 | 632,4 | 2,42 |
| суспензии перорально | ±2,7 | ±50,4 | ±0,22 | ±0,22 | ±70,2 | ±0,19 |
| Гидрохлорид 100 | 3,5 | 500± | 105 | 37,3 | 450,5 | 1,7 |
| мкг/мышь перорально | ±5,0 | 51,2 | ±0,13 | ±3,8 | ±51,7 | ±0,2 |
| Изодинафон 100 | 33,4 | 526,1 | 2,01 | 32,4 | 492,8 | 1,96 |
| мкг/мышь перорально | ±5,1 | ±47,2 | ±0,12 | ±3,5 | ±63,4 | ±0,21 |
| Контроль 0,2 мл | 22,8 | 628,3 | 2,52 | 24,1 | 648,2 | 2,72 |
| физраствора парентерально | ±2,2 | ±61,4 | ±0,21 | ±4,0 | ±71,4 | ±0,21 |
| Гидрохлорид | 31,2 | 530 | 1,7 | 33,4 | 590,3 | 1,9 |
| 50 мкг/мышь парентерально | ±2,1 | ±21,5 | ±0,03 | ±3,2 | ±75,5 | ±0,1 |
| Изодинафон | 30,5 | 580,2± | 1,80 | 31,6 | 607,8 | 2,03 |
| 50 мкг/мышь парентерально | ±4,6 | 46,2 | ±0,09* | ±3,1 | ±59,2 | ±0,21* |
| * Величины, достоверно отличающиеся от контроля, Р<0,05 |
Вышеизложенные результаты показывают, гидрохлорид обладает выраженным противотуберкулезным действием как на микобактерии, чувствительные к большинству противотуберкулезных препаратов, так и на микобактерии, резистентные к тубазиду. Судя по индексу поражения легких, зараженных животных, противотуберкулезная активность гидрохлорида проявляется в большей степени, чем у препаратов сравнения.
Определение противолепрозной активности гидрохлорида в сравнении с изодинафоном.
Противолепрозная активность гидрохлорида в сравнении с изодинафоном изучалась на мышах самцах линии СВА, зараженных лабораторным штаммом Кур-4 микобактерии лепры, взятыми в количестве 5000 и введенными интраплантарно по методу Шепарда. Опыт продолжался 6 месяцев. Под наблюдением находилось 5 групп по 20 мышей в каждой группе. Все мыши содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе.
Первая группа - контрольная: в течение 6 месяцев мыши этой группы получали через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии. В другой серии опытов контрольным животным парентерально в исследуемые сроки вводили 0,2 мл физраствора, а опытным - препараты, разведенные в физрастворе.
Через 6 месяцев животные были забиты цервикальным смещением позвоночника, органы были подвергнуты бактериоскопическому исследованию, никаких патологических отклонений, характерных для какой-либо группы, не обнаружено. При бактериоскопическом исследовании места заражения (лапку) растирали в 2 мл 0,1% раствора альбумина, из 0,01 мл суспензии делали мазок, окрашивали по Цилю-Нильсену и подсчитывали количество микобактерий на 1 мышь в каждой группе.
Результаты исследований представлены в таблице 6.
| Таблица 6. Влияние исследуемых веществ на противолепрозную активность (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме). | ||||
| Группа | Доза мкг/мышь | Кол-во мышей в группе | Кол-во микобактерий в лапке х106 | % инфицированных животных |
| Контроль | 0,5 мл крах. сусп. перор. | 20 | 1,14±0,12 | 100 |
| Гидрохлорид | 50 | 20 | - | 0 |
| Изодинафон | 50 | 20 | - | 0 |
| Контроль | 0,2 мл физраствора парентерально | 20 | 1,27±0,14 | 100 |
| Гидрохлорид | 25 | 20 | - | 0 |
| Изодинафон | 25 | 20 | - | 0 |
Как следует из приведенных данных, гидрохлорид во всех исследуемых дозах и способах применения проявляет выраженную противолепрозную активность так же, как и изодинафон в дозе 25 мкг/мышь.
Изучение антимикробного действия гидрохлорида
Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изодинафоном исследовалось на культурах Bacillus cereus и Staphylococcus aureus. Для определения антимикробного действия препаратов на В. cereus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие 1 мл расплавленной среды №1 (Государственная Фармакопея СССР, изд-е XI, вып.1, т.2, стр.200) и 1 мл суточной бульонной культуры В. cereus, разведенной в 1000 раз физ-раствором. Содержимое пробирки сразу выливали на чашку Петри, содержащую 15 мл застывшей среды №1, чашки ставили в термостат при температуре от 30 до 35°С.
Для определения антимикробного действия препаратов на St. aureus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в среде №8 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной среды №10 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и 1 мл суточной бульонной культуры Staphylococcus aureus, разведенной физраствором в 1000 раз. Содержимое пробки сразу же выливали в чашки Петри, содержащие 15 мл застывшей среды №10, чашки ставили в термостат с температурой от 30 до 35°С. Эксперимент длился 5 суток.
В случае отсутствия роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие препаратов. Результаты эксперимента представлены в таблице 7.
| Таблица 7. Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изоди-нафоном. | ||||||
| Тест-культура | Гидрохлорид | Изодинафон | ||||
| 24ч. | 48ч. | 5 сут. | 24ч. | 48ч. | 5 сут. | |
| S. cereus | - | - | - | - | - | - |
| St. aureus | - | - | - | - | - | ± |
+ - наличие роста микроорганизмов
- - отсутствие роста микроорганизмов
± - незначительный рост микроорганизмов
Как показывают результаты проведенных экспериментов, гидрохлорид обладает бактерицидным действием на микроорганизмы В. cereus и выраженным бактериостатическим действием на St. aureus.
Способ получения предложенных соединений формулы (I) иллюстрируется следующим примером.
Пример
Смешивают 1,26 г (0,01 моль) гидразида изоникотиновой кислоты и 2,245 г (0,01 моль) 6-метилурацил-5-сульфохлорида в ацетонитриле при температуре кипения растворителя в течение 5 часов.
Фильтруют, выпавший в осадок гидрохлорид и очищают в несколько стадий следующим образом: 0,5 г гидрохлорида кипятят в 15 мл спирта в течение 10 минут, далее фильтруют, промывают осадок 6 мл спирта, сушат на воздухе. Так повторяют еще один или два раз до момента, когда останутся только следовые количества примесей.
Получают 3,115 г 6-метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацил-гидрохлорида (примерно выход 90%), который представляет собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета. Тпл= 253-254°С
Примеры рецептур фармацевтических композиций
Капсулы
Гидрохлорид в желатиновых капсулах по 0,1 г и по 0,2 г получают фасованием ручным способом в капсулы №1 и №0 с помощью капсульниц с запорным устройством. Состав: гидрохлорид - 0,1 г и 0,2 г без наполнителей и консервантов.
Навеску гидрохлорида 10,0 г помещают на пластину капсульницы, распределяют по поверхности пластины и далее в соответствии с описанием процесса работы с капсульницей.
Желатиновые капсулы состоят из: хинолина эпу - 0,05%, титана диоксида-1,0%, желатина - до 100%. Входящие в состав капсул вещества разрешены к медицинскому применению в России.
Таблетки
Активное вещество - соединение формулы (I) в количестве 100 мг, 200 мг - массовая часть 40%. Целевые добавки (лактоза, аэросил, стеарат кальция) - массовая часть 60%.
Смешивают основное и вспомогательные вещества в соотношениях, указанных в таблице 8 (расчет на массу таблетки):
| Таблица 8 | ||
| Масса таблетки (Мт), г | Массовый состав, % | |
| 0,250 | 0,500 | |
| Гидрохлорид - 0,1 | гидрохлорид - 0,2 | 40 |
| Лактоза - 0,144 | Лактоза - 0,288 | 57,6 |
| Аэросил - 0,004 | Аэросил - 0,008 | 1,6 |
| Стеарат Са - 0,002 | Стеарат Са - 0,004 | 0,8 |
Диаметр шаров - 5 мм. Масса шаров на 100г готовой формы - 500 г.
Прессование таблеток осуществляют на прессе РТМ-12. На таблетки наносят покрытие на основе ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ) на аппарате "Strea-1". Состав покрытия (массовые части): ацетон - 56,4; этиловый спирт 96% - 37,6; касторовое масло - 1,0; АФЦ - 5,0; тропеолин - добавляют до светло-коричневой окраски раствора. Расход покрытия: количество покрытия (мл) = 50% от массы таблеток (г).
Раствор для инъекции
Гидрохлорид для инъекций представляет собой рассыпку порошка лекарственного средства, включающее активное вещество и его фармацевтически приемлемые соли в дозировке 0,1-0,5 г.
Конкретные составы указаны в таблице 9.
| Таблица 9 | ||||
| Составляющие | Количество, мл | |||
| 1 | 2 | 3 | ||
| соединение формулы (I), г | 0,1 | 0,2 | 0,5 | |
| Растворитель | Приемлемый растворитель | 5 | - | |
| Приемлемый растворитель | - | 5 | ||
| Приемлемый растворитель | 5 |
Эксперимент на животных (кроликах) показал, что около 50% этого соединения в неизменном видеобнаруживается в продуктах их жизнедеятельности. Биологические же испытания гидрохлорида (I) показали, что его действие на гуморральный иммунитет при приеме перорально незначительно выше, чем у соединения (В), тогда как при парентеральном введении одинаковый эффект достигается при введении в 8 раз меньших доз гидрохлорида.
Гидрохлорид по сравнению с вышеуказанным соединением (В) показал антимикробную активность, в случае с В. cereus - бактерицидную, а в случае с St. aureus - бактериостатическую, о чем свидетельствуют данные таблицы 10.
1. 6-Алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I)
где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.
2. Гидрохлорид по п.1, проявляющий антимикобактериальную и иммунотропную активность.
3. Фармацевтическая композиция, обладающая антимикобактериальной и иммунотропной активностью, включающая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I) по п.1 в эффективном количестве.
