Способ секреторной продукции белка

Изобретение относится к биотехнологии. Гетерологичный белок получают культивированием штамма Corynebacterium glutamicum AJ 12036, не продуцирующим белок клеточной поверхности и содержащим генную экспрессирующую конструкцию, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид белка клеточной поверхности Corynebacterium glutamicum или С. ammoniagenes, соединена в прямом направлении с последовательностью промотора, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гетерологичный белок, связана в прямом направлении с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид. Далее выделяют секретированный из клеток гетерологичный белок. Данное изобретение позволяет получать гетерологичный белок с высокой степенью эффективности. 5 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к способу эффективного получения гетерологичного белка секреторной продукции.

Ранее сообщалось о ряде способов секреторной продукции гетерологичных белков, таких как описаны в обзоре по секреторной продукции гетерологичного белка бактерий, относящихся к роду Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], в обзоре по секреторной продукции гетерологичного белка метилотрофными дрожжами Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)] и в сообщении о промышленном получении гетерологичных белков с использованием плесени, относящейся к роду Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976-981 (1991)].

Трансглютаминаза, получаемая секреторной продукцией по одному воплощению настоящего изобретения, представляет собой фермент, который катализирует реакцию переноса ацила γ-карбоксиламидных групп в пептидной цепи белка. Когда фермент взаимодействует с белком, то может иметь место образование поперечной связи ε-(γ-Glu)-Lys и замещение Gln на Glu в результате дезамидирования. Трансглютаминазу применяют для производства желированных пищевых продуктов, таких как желе, йогурт, сыр, и желированных косметических средств и других, а также для улучшения качества мяса и тому подобное (публикация прошедшей экспертизу заявки на выдачу патента Японии №1-50382). Более того, трансглютаминаза представляет собой фермент, имеющий высокую промышленную применимость в отношении использования для производства веществ для термостабильных микрокапсул, носителей для иммобилизованных ферментов и т.п.

Ранее были известны трансглютаминазы, полученные из животных и из микроорганизмов (микробная трансглютаминаза: в последующем относится к «MTG»). Первая представляет собой зависимый от ионов кальция фермент, который имеется в органах, коже, крови животных и т.п. Примеры включают печеночную трансглютаминазу морской свинки (K.Ikura et al., Biochemistry 27, 2898 (1988)), эпидермальную кератиноцитарную трансглютаминазу человека (M.A.Phillips et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)), фактора свертывания крови XIII человека (A.Ichinose et al., Biochemistry 25, 6900 (1990)) и другие.

К настоящему времени обнаружены независимые от ионов кальция трансглютаминазы, происходящие из бактерий, относящихся к роду Streptoverticillium, которые включают, например, Streptoverticillium gliseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum подвид cinnamoneum (в последующем в сокращенном виде они могут быть обозначены как S. cinnamoneum) IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (в последующем сокращенном виде они могут быть обозначены, как S. mobaraense) IFO13819 и другие (публикация не прошедшей экспертизу заявки на выдачу патента Японии (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №64-27471)). В результате картирования пептидов и структурного анализа генов было установлено, что первичная структура трансглютаминазы, продуцируемой данными микроорганизмами, не имеет гомологии с трансглютаминазами от животных (публикация заявки на Европейский патент №0481504 А1).

Поскольку происходящие из микроорганизмов трансглютаминазы (MTG) получают выделением из культур микроорганизмов, таких как описаны выше, возникают проблемы в плане количества и эффективности и тому подобное. Предпринималась попытка получения трансглютаминазы с использованием генно-инженерных способов. Сообщалось о белках и генах трансглютаминаз, например в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92 (1994), Biochimie, 80, 313-319 (1998), Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998), WO 96/06931, WO 96/22366 и т.д., в этих источниках приводятся данные об экспрессии и продукции трансглютаминазы в системах хозяин-вектор, таких как Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae и Escherichia coli. В дополнение к этой информации сообщалось о способе, в котором трансглютаминазу получают секреторной продукцией в микроорганизмах, таких как E.coli и дрожжи (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №5-199883), и о способе, в котором активную MTG получают экспрессией MTG в виде неактивного слитого белка в виде включения в E.coli, последующей солюбилизацией включения с использованием денатурирующих белок агентов и затем его восстановлением посредством удаления денатурирующих агентов (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-30771). Однако при этом отмечалась проблема, заключающаяся в том, что уровень экспрессии был очень низким при секреторной продукции такими микроорганизмами, как E.coli или дрожжи.

С другой стороны, имеются предшествующие примеры эффективной секреторной продукции гетерологичных белков с использованием коринеформных бактерий, включая секрецию нуклеаз и липаз (патент США №4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)] и секрецию протеаз, таких как субтилизин [Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)], с использованием Corynebacterium glutamicum (в последующем в сокращенном виде они могут быть обозначены, как С. glutamicum), секрецию белков клеточной поверхности коринеформных бактерий [заявка на международный патент, опубликованная в патенте Японии №6-502548], секрецию связывающегося с фибронектином белка с использованием данного исследования [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], также имеется сообщение, в котором секрецию белков усиливали с использованием мутантного секреторного аппарата [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №11-169182] и т.д., но в целом имеется ограниченное число сообщений по ограниченным белкам. Что касается накапливающегося количества белка в Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) описывается, что накапливалось примерно 2,5 мг/мл белка при экспрессии гена щелочной протеазы из Dichelobacter nodosus в С. glutamicum с использованием промотора гена субтилизина (аргЕ) из Bacillus subtilis, связывающегося с рибосомами сайта и последовательности сигнального пептида, но в патенте США №4965197, не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №6-502548 и не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №11-169182 конкретно не описываются значения количества секретируемых и накапливающихся белков. Более того, в случае связывающегося с фибронектином белка [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], секреторное накопление белка составило примерно 2,5 мкг/л. Таким образом, отсутствуют сообщения о том, что гетерологичные белки могут эффективно накапливаться в среде в концентрации, имеющей практическое значение.

Кроме того, технология генной инженерии для коринеформных бактерий была разработана в системе с использованием плазмиды и фага, такой как проведение трансформации протопластом [J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Bacteriol., 161, 463-467 (1985)], разработка различных типов векторов [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984); J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246 (1984); Gene, 47, 301-306 (1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69 (1989)], разработка способа регуляции экспрессии генов [Bio/Technology, 6, 428-430 (1988)] и разработка космиды [Gene, 39, 281-286 (1985)]. Кроме того, имеются сообщения по клонированию генов, полученных из коринеформных бактерий [Nucleic Acids Res., 14, 10113-1011 (1986); J. Bacteriol., 167, 695-702 (1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598 (1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922 (1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859 (1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531 (1988); Mol. Microbiol., 2, 63-72 (1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339 (1989); Gene, 77, 237-251 (1989)].

Позднее также сообщалось о мобильном генетическом элементе, полученном из коринеформных бактерий [WO 93/18151; Европейский патент 0445385; не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6 (1995); не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №7-107976].

Мобильный генетический элемент представляет собой фрагмент ДНК, который можно переносить в хромосому и который, как известно, имеется у широкого ряда микроорганизмов от прокариотов до эукариотов. Были разработаны транспозоны с использованием мобильных генетических элементов [WO 93/18151; не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №7-107976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №9-70291], и стало возможным экспрессировать гетерологичный ген с использованием транспозона.

Краткое описание изобретения

Объектом изобретения является способ получения гетерологичного белка при получении коринеформной бактерии, продуцирующей промышленно применимый гетерологичный белок, например трансглютаминазу, и эффективно секретирующей продукт из клетки (т.е. секреторной продукцией).

Авторы настоящего изобретения обнаружили мутанта, который обладает очень высокой продуцирующей способностью при получении гетерологичных белков, с использованием коринеформной бактерии по сравнению с диким типом Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, результатом чего явилось настоящее изобретение.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичных белков, отличающемуся тем, что слитый белок продуцируется и секретируется (секреторная продукция) мутантной коринеформной бактерией, которая обладает, по меньшей мере, в 2 раза более высокой способностью секретировать гетерологичный белок, который связан в прямом направлении с сигнальным пептидом из коринеформной бактерии, по сравнению с Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 дикого типа.

Конкретнее, изобретение относится к способу получения большого количества желаемого гетерологичного белка, например трансглютаминазы, введением генетической экспрессирующей конструкции в коринеформную бактерию, культивированием трансформированной таким образом коринеформной бактерии, эффективным внеклеточным секретированием полученного белка и выделением секретированного белка, в котором генная экспрессирующая конструкция включает последовательность гена, кодирующего желаемый белок, которая лигирована в прямом направлении с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, полученный из коринеформной бактерии, особенно сигнальный пептид клеточного поверхностного белка.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «секреция» белка или пептида относится к транспорту молекулы белка или пептида из бактериальной клетки (внеклеточный транспорт), включая случай, когда молекула белка или пептида в конечном итоге находится в полностью свободной форме в среде, а также случай, когда только часть молекулы белка или пептида находится вне клетки, и случай, когда они расположены на поверхности клетки.

Описание предпочтительных воплощений

В способе по изобретению коринеформную бактерию используют в качестве векторной системы-хозяина и можно получить большое количество внеклеточно секретируемого интересующего белка получением экспрессирующей конструкции, в которой ген, кодирующий интересующий белок, лигирован в прямом направлении с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии, введением конструкции в коринеформную бактерию и ее экспрессией.

Белки, которые можно получить секреторной продукцией способом по настоящему изобретению включают ферменты, физиологически активные белки и пептиды, которые являются промышленно применимыми. Трансглютаминазу, которую получают секреторной продукцией в одном воплощении настоящего изобретения, широко используют при обработке продуктов питания, производстве фармацевтических препаратов и тому подобное.

Известно, что секреторный белок, как правило, транслируется в виде препептида или препропептида и затем превращается в зрелый белок. То есть, как правило, он транслируется в виде препептида или препропептида, затем сигнальный пептид (преобласть) отщепляется, и таким образом он превращается в зрелый пептид или пропептид дальнейшим отщеплением прообласти под действием протеазы. В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «сигнальная последовательность» относится к последовательности, которая расположена в N-конце предшественника секретируемого белка и которая отсутствует в нативном зрелом белке, а «сигнальный пептид» относится к пептиду, который отщепляется от такого предшественника белка. Как правило, сигнальная последовательность отщепляется одновременно с секрецией из клетки под действием протеазы (обычно относится к сигнальной пептидазе). Несмотря на то, что для сигнального пептида характерны некоторые общие свойства последовательности среди организмов разных видов, сигнальный пептид, который обладает секреторной функцией у одного вида, необязательно обладает такой же секреторной функцией у другого вида.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, белок, который включает как сигнальный пептид, так и прообласть, т.е. первичный продукт трансляции называют «препробелком», и белок, который не включает сигнальный пептид, но включает прообласть, называют «пробелком». Прообласть пробелка называют «проструктурной областью» или «проструктурой». Термин «проструктурная область/проструктура» белка можно использовать здесь взаимозаменяемо с термином «прообласть» белка. Сигнальный пептид в препробелке или пребелке можно получить из другого белка или он может быть сигнальным пептидом, естественно присутствующим в желаемом белке и предпочтительно полученным из подлежащего применению секреторного белка хозяина. Альтернативно его можно модифицировать с включением оптимального кодона в зависимости от характера использования кодонов, применяемых хозяином.

Более того, сигнальный пептид, который можно использовать для целей изобретения, может включать часть N-концевой аминокислотной последовательности нативного зрелого белка, из которого получен сигнальный пептид. В частности, препробелок можно назвать «гетерологично слитым препробелком», когда сигнальный пептид получен из другого белка. Например, когда белок представляет собой трансглютаминазу, то он соответственно называется «препротрансглютаминазой», «протрансглютаминазой» и «гетерологино слитой препротрансглютаминазой». Белком, в котором «прообласть отщеплена», называется белок, в котором, по меньшей мере, одна или несколько аминокислот, которые составляют его прообласть, удалены при расщеплении пептидной части, включая белок, имеющий аналогичную N-концевую аминокислоту с нативным белком, кроме того, этот термин относится к белку, имеющему одну или несколько дополнительных аминокислот в N-конце, происходящих из прообласти нативного белка, а также к белку, имеющему более короткую аминокислотную последовательность по сравнению с нативным зрелым белком, при условии, что во всех случаях белок обладает активностью желаемого белка.

Как уже отмечалось в разделе «Предпосылки изобретения», в ограниченном числе сообщений было показано, что внеклеточная секреторная продукция гетерологичного белка из клетки достигалась с использованием коринеформных бактерий, а технология секреторной продукции не была разработана. Кроме того, оставалось неизвестным, что коринеформные бактерии сами по себе секретируют из клетки такой белок, как протеаза. Известные примеры представляют собой эндогенную ДНКазу [патент США №4965197], и сведения, что белок клеточной поверхности, используемый в настоящем изобретении, отделяется от клеточной поверхности во внешнюю среду [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548]. Однако был не известен какой-либо сигнальный пептид, который участвует в секреции белка коринеформной бактерии, за исключением белков клеточной поверхности. К настоящему времени единственными известными белками клеточной поверхности коринеформных бактерий являются продукты генов PS1 и PS2, белков клеточной поверхности Corynebacterium glutamicum [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548], и продукта гена SlpA, клеточного поверхностного белка Corynebacterium ammoniagenes (которые в последующем в сокращенном виде могут быть обозначены, как С. ammoniagenes) [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675]. Среди этих белков PS1 и SlpA обладают некоторой гомологией (примерно на 30%), но у других гомология практически отсутствует, и, кроме того, не было установлено гомологии в домене сигнальной последовательности. В качестве примеров сигнальных последовательностей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 представлены сигнальные последовательности PS1 и PS2 Corynebacterium glutamicum и в SEQ ID NO: 3 показана сигнальная последовательность SlpA из Corynebacterium ammoniagenes.

Следовательно, авторы настоящего изобретения клонировали ген белка PS2 из С. glutamicum (раньше Brevibacterium lactofermentum) штамма АТСС13869 и определили последовательность. Было установлено, что различия в домене сигнальной последовательности из известной последовательности С. glutamicum отсутствовали, но имелись две различные аминокислоты в последовательности 38 N-концевых аминокислотных остатков зрелого клеточного поверхностного белка (остаток Asn на Thr в положении 40 и остаток Glu на Gly в положении 55 в аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 5).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая 68 остатков, включая 30 аминокислотных остатков сигнального пептида, и 38 аминокислотных остатков N-конца зрелого клеточного белка и его области в 5'-направлении, включая промотор, показана в SEQ ID NO: 4, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 5.

Затем авторы настоящего изобретения исследовали секрецию гетерологичного белка с использованием области, включающей промотор или область сигнального пептида клеточного поверхностного белка, для определения того, можно ли получить у коринеформных бактерий внеклеточную секреторную продукцию гетерологичного белка в больших количествах.

Поскольку ген трансглютаминазы из актиномицета имеет высокое содержание GC, и ген из коринеформной бактерии обладает близким уровнем GC с геном из актиномицетов, и также они обладают примерно одинаковым характером использования кодона, то можно с преимуществом непосредственно использовать ген из актиномицетов. Следовательно, авторы исследовали вероятность прямого использования гена трансглютаминазы из актиномицетов и установили, что сигнальный пептид трансглютаминазы из актиномицетов не функционирует эффективно в коринеформной бактерии. Однако было установлено, что ген трансглютаминазы, кодирующий зрелый белок, содержащий проструктурную область из актиномицетов, слитую с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии, эффективно функционировал без какой-либо модификации и эффективно секретировался из клетки в виде пробелка, включающего проструктурную область. Когда использовали ген трансглютаминазы с проструктурной областью, которая дополнительно включает 30 аминокислотных остатков из клеточного поверхностного белка и 38 аминокислотных остатков из N-концевого домена зрелого клеточного поверхностного белка, т.е. когда использовали ген трансглютаминазы, слитой с N-концевым доменом зрелого клеточного поверхностного белка, то эффективность секреции трансглютаминазы из клетки дополнительно повышается.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, коринеформная бактерия представляет собой аэробную грамположительную бациллу, которая включает бактерии, ранее классифицированные, как Brevibacterium, но в настоящее время определяемые, как Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), включая Brevibacterium, которые очень близки к Corynebacterium. Применение Corynebacterium является преимущественным в том плане, что им свойственна секреция значительно меньшего количества белков из клеток по сравнению с плесенью, дрожжами или бактериями, относящимися к Bacillus, которые ранее были признанными в качестве применимых для секреции гетерологичного белка, что облегчает и сокращает процесс выделения продукта при секреторной продукции, и это выгодно в плане стоимости сред, метода и выхода культивирования, поскольку они хорошо растут на простых культуральных средах, включающих аммиак, неорганические соли и так далее.

Примерами Corynebacterium, которые можно использовать в качестве хозяина-бактерии в настоящем изобретении, являются мутанты, обладающие, по меньшей мере, в 2 раза более высокой способностью секретировать гетерологичные белки по сравнению с Corynebacterium glutamicum дикого типа. Данные мутанты можно получить из штаммов дикого типа, включая Brevibacterium saccharolyticum АТСС14066, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, Brevibacterium roseum ATCC13825, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC15990, Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 или из их мутантов. Мутанты по настоящему изобретению включают мутантные штаммы, дефектные по их способности продуцировать глутамат, мутантные штаммы по продукции аминокислот, таких как лизин и тому подобное, и мутантные штаммы по продукции других соединений, таких как нуклеиновые кислоты, например инозин. Мутанты по настоящему изобретению можно получить при отборе штаммов, обладающих повышенной способностью к секреторной продукции белков, после облучения УФ-светом или обработки бактерий химическим мутагеном, таким как N-метил-N'-нитрозогуанидин.

В частности, Corynebacterium glutamicum (С. glutamicum) AJ12036 (FERM BP-734) (первоначально помещенный на хранение 26 марта 1984 г.) (в настоящее время Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan) обладает в 2-3 раза более высокой способностью к секреторной продукции гетерологичных белков по сравнению с исходным штаммом (штаммом дикого типа) в оптимальных условиях культивирования, что количественно оценивали по накоплению, это может иметь место за счет мутации функционных генов, ответственных за секрецию белков. Таким образом, данный штамм применим в качестве хозяина. Кроме того, особенно предпочтительно использовать штамм, который получен из такого мутанта и который модифицирован таким образом, что он не продуцирует клеточные поверхностные белки, поскольку при этом облегчается выделение секретированных гетерологичных белков. Подобные модификации можно проводить введением мутации в области, кодирующие клеточные поверхностные белки или области, регулирующие их экспрессию, имеющиеся в геноме, мутагенезом или применением методов рекомбинации генов.

Генетическая конструкция, которую можно использовать в настоящем изобретении, как правило, включает промотор, последовательность, кодирующую правильный сигнальный пептид, и участок нуклеиновой кислоты, кодирующий желаемый белок, и регуляторную последовательность (оператор или терминатор и т.д.), необходимые для экспрессии гена желаемого белка в коринеформной бактерии, в правильном положении, чтобы они могли функционировать. Желаемый белок может иметь проструктурную область в N-конце. Векторы, которые можно использовать для этой конструкции, особым образом не ограничиваются и включают векторы, которые могут функционировать в коринеформной бактерии, и они могут представлять таковые, которые автономно размножаются, такие как плазмиды или векторы, которые вставлены в хромосому бактерии. Особенно предпочтительными являются плазмиды, полученные из коринеформной бактерии. Они включают, например, рНМ1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), рАМ330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)) и плазмиды, полученные их модификацией, которые включают ген устойчивости к лекарственным препаратам.

Можно также использовать искусственные транспозоны. В случае, когда используют транспозон, то желаемый ген вводят в хромосому посредством гомологичной рекомбинации или ее собственной способности к транспозиции.

Промоторы, которые можно использовать по изобретению, особым образом не ограничиваются. Как правило, можно использовать любой промотор, который может функционировать в клетке коринеформной бактерии. Также это может быть промотор, полученный из других видов, например промотор, полученный из E.coli, такой как tac-промотор и т.д. Среди подобных промоторов более предпочтительным является сильный промотор, включая tac-промотор и т.д.

Примеры промоторов, полученных из коринеформной бактерии, включают промоторы генов белков клеточной поверхности PS1, PS2 и SlpA, промоторы генов в биосинтезе различных аминокислот, например гена глютаматдегидрогеназы, участвующей в биосинтезе глутаминовой кислоты, гена глютаминсинтетазы, участвующей в синтезе глутамина, гена аспартаткиназы, участвующей в биосинтезе лизина, гена гомосериндегидрогеназы, участвующей в биосинтезе треонина, гена ацетогидроксилатсинтазы, участвующей в биосинтезе изолейцина и валина, гена 2-изопропилмалатсинтазы, гена глутаматкиназы, участвующих в синтезе пролина и аргинина, гена фосфорибозил-АТФ-пирофосфорилазы, участвующей в синтезе гистидина, гена дезоксиарабиногептуроновой кислоты-фосфат (DAHP)-синтазы, участвующей в синтезе ароматических аминокислот, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин и т.д., гена фосфорибозилпирофосфат(PRPP)амидотрансферазы, гена инозинатдегидрогеназы и гена гуанилатсинтазы, участвующих в биосинтезе производных нуклеиновой кислоты, таких как инозинат и гуанилат.

Сигнальный пептид, который используется в настоящем изобретении, представляет собой сигнальный пептид секреторного белка из хозяина, коринеформной бактерии, и предпочтительно представляет собой сигнальный пептид клеточного поверхностного белка из коринеформной бактерии. Клеточные поверхностные белки включают PS1 и PS2, полученные из С. glutamicum (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №6-502548), и SlpA, полученный из С. ammoniagenes (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675). Аминокислотная последовательность PS1 представлена в SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность PS2 - в SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность SlpA показана в SEQ ID NO: 3. Кроме того, сообщалось, что ДНКаза из коринеформной бактерии также обладает сигнальным пептидом, как описано в патенте США №4965197, который также можно использовать в настоящем изобретении.

С сигнальным пептидом может быть соединен участок N-концевой аминокислотной последовательности секреторного белка, из которого получен сигнальный пептид. Сигнальную последовательность отщепляют сигнальной пептидазой во время секреции из клетки транслированного продукта. Кроме того, можно также использовать ген, кодирующий сигнальный пептид, либо в нативной форме, либо в модифицированной форме, включающей оптимальные кодоны в зависимости от характера использования кодонов у хозяина, который применяется.

В случае, когда используются данные сигнальные пептиды, то гены, кодирующие желаемые белки, соединяют с 3'-концом генов, кодирующих сигнальные пептиды, и располагают таким образом, что они подвергаются регуляции экспрессии промоторами, описанными выше.

Применимые белки, которые можно получить секреторной продукцией по настоящему изобретению, в основном представляют собой без ограничения все секреторные белки, полученные из животных, растений и микроорганизмов. Например, можно получить секрецией по настоящему изобретению такие белки, как протеаза, экзопептидаза, аминопептидаза, карбоксипептидаза, коллагеназа и хитиназа. Белки, которые получают секреторной продукцией по настоящему изобретению, предпочтительно являются нативными секреторными белками, более предпочтительно белками, имеющими дополнительные проструктурные области. Трансглютаминаза является особенно предпочтительной в качестве применимого белка, получаемого секреторной продукцией по настоящему изобретению. В качестве генов трансглютаминазы для целей настоящего изобретения можно использовать гены трансглютаминазы секреторного типа, полученные из актиномицетов, например S. mobaraense IFO13819, S. cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptomyces lydicus [WO 9606931] и т.д., и плесени, такой как Oomycetes [WO 9622366] и т.д. Гены, кодирующие данные белки, можно модифицировать в зависимости от типа хозяина, который используется для достижения желаемой активности, и модификации могут включать добавление, делецию, замену одного или несколько аминокислотных остатков и необязательно можно оптимизировать их кодонный состав в зависимости от частоты использования кодонов у хозяина.

Когда белок, полученный секреторной продукцией по настоящему изобретению, представляет собой белок, экспрессируемый в естественных условиях в виде препропептида, то предпочтительно использовать фрагмент гена, кодирующий пробелок, включающий проструктурную область (прообласть), хотя это не является существенным. Когда используется ген, кодирующий препробелок, то прообласть полученного белка в результате экспрессии гена можно отщепить подходящими способами, например, протеазой. Для этого можно использовать аминопептидазы, эндопептидазы, которые расщепляют в соответствующем сайте, или несколько специфические протеазы. Предпочтительно использовать протеазы, которые расщепляют белок таким образом, что расщепленный белок будет обладать одинаковой активностью или несколько высокой активностью, чем нативный белок. Альтернативно последовательность гена, кодирующую желаемый белок или кодирующую проструктурную область желаемого белка, можно также модифицировать и сконструировать для экспрессии белка, обладающего сайтом узнавания для протеазы, специфической для желаемого положения. Общие молекулярно-биотехнологические способы, включая также методы модификации, методы клонирования генов и методы детектирования продуцированных белков, хорошо известны специалистам в данной области и их можно найти у Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and (D.N.Glover ed. 1985), F.M.Ausubel et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H.Erlich, ed., Stockton Press and etc.

N-концевая область белка, которую можно получить в конечном итоге по настоящему изобретению, необязательно является такой же, как у нативного белка и, следовательно, можно добавить от одной до нескольких аминокислот к или, напротив, удалить их из нативного белка. Когда используют протеазу, то предпочтительно, чтобы полученный белок расщеплялся примерно по тому же положению, что и нативный белок в отношении активности, и является более предпочтительным, если она является такой же, как у зрелого пептида нативного белка. Следовательно, специфические протеазы, которые расщепляют пропептид в таком положении, что в результате получают такой же белок, что и нативный белок, как правило, являются наиболее предпочтительными. Однако для определенной цели пептиды, имеющие более длинную или несколько короткую последовательность аминокислотного остатка, отличающуюся на один или несколько остатков в N-конце по сравнению с N-концом нативного белка, могут обладать более подходящей активностью. Подобные протеазы включают, например, диспазу (производства Boehringer Manheim Co.), которая промышленно доступна, и протеазы, полученные из культуральной среды микроорганизмов, такой как, например, культуральная среда актиномицетов. Такие протеазы можно использовать в неочищенной форме или необязательно можно использовать после очистки до соответствующей чистоты.

Другим примером подходящих протеаз для удаления прообласти протрансглютаминаз из Streptomyces, является SAMP45, сериновая протеаза, продуцируемая Streptomyces albogriseolus (в последующем в сокращенной форме S. albogriseolus). Последовательность гена и кодируемая полноразмерная аминокислотная последовательность (1-13: сигнальная последовательность, 32-76: прообласть, 77-407: зрелая трансглютаминаза) для трансглютаминазы S. mobaraense представлены соответственно в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. В случае протрансглютаминазы S. mobaraense, то поскольку SAMP45 расщепляет между Ser⁷² и Phe⁷³ в проструктурной области, то полученный белок имеет структуру, в которой дополнительные 4 аминокислоты (Phe-Arg-Ala-Pro, SEQ ID NO: 60) с С-конца прообласти соединены с N-концом нативной зрелой трансглютаминазы. Авторы настоящего изобретения установили, что такие белки обладают активностью трансглютаминазы. Уже определена последовательность гена SAPM45, и аминокислотная последовательность белка с дополнительной проструктурной областью (npoSAMP45) представлена в SEQ ID NO: 8 (J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)).

Кроме того, зрелую трансглютаминазу, идентичную нативной трансглютаминазе, можно получить при использовании пролиновой специфической пептидазы, продуцируемой S. mobaraense (svPEP), которая была обнаружена заявителями наряду с SAMP45, что приводит к удалению четырех аминокислот Phe-Arg-Ala-Pro, добавленных в N-конец.

Данная svPEP представляет собой фермент, который специфически расщепляет пептиды или аналоги пептидов, представленные последующей формулой (I) в сайте, обозначенном в формуле *, т.е. с карбоксильной концевой стороны третьего или четвертого остатка пролина с N-конца:

Y-Pro-*-Z (I),

в которой Y представляет собой олигопептид, состоящий из двух или трех аминокислотных остатков, и Z представляет собой аминокислоту, пептид, амид или эфир.

Нуклеотидная последовательность гена svPEP и кодируемая полная аминокислотная последовательность представлены соответственно в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В случае, когда svPEP взаимодействует с протрансглютаминазой вместе с протеазой, находясь в виде бульона S. mobaraense или клеток S. mobaraense, то проструктурная область может быть полностью отщеплена с получением зрелой трансглютаминазы, из которой полностью удалена проструктурная область. Альтернативно зрелую трансглютаминазу, из которой полностью удалена проструктурная область, можно также получить культивированием коринеформной бактерии, где ген препроsvPEP вместе с геном протеазы вводят в саму коринеформную бактерию, которая секретирует протрансглютаминазу при секреторной продукции. Кроме того, зрелую трансглютаминазу, имеющую такую же структуру, как естественная форма, можно эффективно получить одновременным введением гена SAMP45 и гена svPEP в коринеформную бактерию, в которую был введен ген протрансглютаминазы, и секрецией бактерией протрансглютаминазы и SAMP45, а также svPEP внеклеточно или на поверхность клеток.

Способ введения генетических конструкций в коринеформную бактерию, который можно использовать в настоящем изобретении, не ограничивается определенными способами и, как правило, используемые способы включают, например, способ протопластов (Gene, 39, 281-286 (1985)), электропорацию (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)) и т.д. Полученный трансформант можно культивировать обычными методами и в обычных условиях. Например, трансформант можно культивировать в обычной среде, содержащей источники углерода, источники азота и источники неорганических солей. Необязательно можно добавить в среду следовые количества органических питательных веществ, таких как витамины и аминокислоты, для достижения более высокого уровня роста.

В качестве источника углерода можно использовать углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и можно использовать органические кислоты, такие как уксусная кислота, спирты и другие. В качестве источника азота можно использовать газообразный аммиак, водный раствор аммиака, соли аммония и другие. В качестве неорганических ионов, когда необходимо, необязательно можно использовать ион кальция, ион магния, ион фосфора, ион калия, ион двухвалентного или трехвалентного железа и другие. Культивирование можно проводить в течение примерно 1-7 суток в аэробных условиях при значении рН в соответствующих пределах между 5,0 и 8,5 и при температуре от 15°С до 37°С. При культивировании трансформанта в таких условиях продуцируется внутри клетки и эффективно секретируется из клетки большое количество желаемого белка. Известно, что, как правило, трансглютаминаза приводит к гибели, когда накапливается в больших количествах в клетках микроорганизмов, но по настоящему изобретению трансглютаминаза непрерывно продуцируется, не приводя к летальному действию, поскольку продуцированная внутри клеток трансглютаминаза выделяется из клеток.

Белки, которые секретировались в среду по настоящему изобретению, можно выделить и очистить из инкубационной культуральной среды способами, хорошо известными специалистам в данной области. Например, белки можно выделить и очистить удалением клеток из среды центрифугированием и т.д. и затем использованием известных соответствующих способов, таких как высаливание, осаждение этанолом, ультрафильтрация, гель-фильтрация, ионообменная колоночная хроматография, аффинная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, обратнофазовая хроматография, гидрофобная хроматография или их комбинация. Белки, секретированные на поверхность клеток по настоящему изобретению, можно выделить и очистить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например их солюбилизацией при повышенных концентрациях соли или поверхностно-активными веществами, и затем с применением способов, аналогичных для белков, секретированных в среду. Кроме того, в некоторых случаях белки, секретированные на поверхность клеток, можно использовать без солюбилизации, например, в виде иммобилизованных ферментов.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение иллюстрируется последующими примерами, но данные примеры не следует рассматривать в качестве ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Экспрессия препротрансглютаминазы, полученной из S. mobaraense IFO13819, в С. glutamicum ATCC13869

(1) Получение гена трансглютаминазы из S. mobaraense IFO13819

Последовательность гена трансглютаминазы из S. mobaraense DSMZ уже определена [Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998)]. Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, синтезировали на основе последовательности, и область, кодирующую последовательность зрелой трансглютаминазы, амплифицировали с использованием ПЦР с хромосомной ДНК S. mobaraense IFO13819, полученной обычным способом - способ Саито и Миура [Biochim., Biophys. Acta, 72, 619(1963)]. Для постановки ПЦР использовали ДНК-полимеразу Pyrobest (Takarashuzo Co. Ltd.) и условия реакции, рекомендованные изготовителем.

(SEQ ID NO: 11) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'

(SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12: праймер

Затем получали ДНК-зонд проведением реакции с использованием амплифицированного фрагмента ДНК размером примерно 1,0 т.п.н. с [α-³²P]dCTP и набора праймеров для произвольного введения метки в ДНК Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.), следуя протоколу, приложенному к набору. Было подтверждено, что ген трансглютаминазы находится в фрагменте размером примерно 4 т.п.н., вырезанном рестриктазой SacI, гибридизацией на основе саузерн-блоттинга, с использованием полученного зонда и хромосомной ДНК S. mobaraense IFO13819 обычным методом, как описано в Molecular Cloning 2^nd edition [J. Sambrook, E.F.Frisch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 9, 31 (1989)]. Следовательно, фрагмент размером примерно 4 т.п.н., полученный расщеплением хромосомной ДНК S. mobaraense IFO13819 с помощью SacI, выделяли электрофорезом в агарозном геле с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SacI, в плазмиде pUC18 (Takarashuzo Co. Ltd.), которую вводили в компетентные клетки Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.) для получения библиотеки.

Получали штамм бактерий, несущих плазмиду, в которую клонировали фрагмент гена трансглютаминазы, скринингом библиотеки с использованием ранее полученного ДНК-зонда для трансглютаминазы гибридизацией колоний, как описано в Molecular Cloning 2^nd edition [J. Sambrook, E.F.Frisch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 1, 90 (1989)]. Из этого штамма выделяли плазмиду и обозначали ее как pUITG. Определяли последовательность фрагмента, клонированного в pUITG, в результате было подтверждено, что ген трансглютаминазы из S. mobaraense IFO13819 имел ту же нуклеотидную последовательность, что и ген трансглютаминазы из S. mobaraense штамма DSMZ.

При определении нуклеотидной последовательности было установлено, что фрагмент SacI размером 4 т.п.н. представлял неполный фрагмент ДНК, из которого была частично удалена сигнальная последовательность (преобласть). Следовательно, проводили клонирование промотора и области полной сигнальной последовательности. Клонирование проводили с использованием набора для клонирования in vitro TAKARA LA PCR (Takarashuzo Co. Ltd.) и синтезировали праймеры, представленные в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, следуя прилагаемой методике.

(SEQ ID NO: 13) 5'-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3'

(SEQ ID NO: 14) 5'-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14: праймеры для ПЦР для промотора и сигнальной последовательности S. mobaraense

В результате, когда использовали кассетный праймер SaII, то получали амплифицированный ПЦР-фрагмент размером примерно 800 п.н. и секвенирование фрагмента подтверждало, что фрагмент включал промотор гена трансглютаминазы и сигнальную последовательность. Следовательно, амплифицированный ПЦР фрагмент размером примерно 800 п.н. вставляли в сайт Smal в плазмиде pVC7, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением плазмиды pVITGS5. Дополнительно плазмиду pUITG расщепляли SacI и выделяли фрагмент размером примерно 4 т.п.н. электрофорезом в агарозном геле, и фрагмент вставляли в сайт SacI в плазмиде pVITGS5 для конструирования плазмиды pVITGC, которая включала полноразмерный ген трансглютаминазы. Определение нуклеотидной последовательности проводили с использованием набора для секвенирования с терминатором циклов (РЕ Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373А (РЕ Applied Biosystems). Последовательность гена препротрансглютаминазы представлена в SEQ ID NO: 6. Было сделано предположение, что N-концевая последовательность из 31 аминокислоты (№1-31) была сигнальной последовательностью (преобластью), N-концевая последовательность из 45 аминокислот (№32-76) была прообластью и N-концевая последовательность из 331 аминокислоты (№77-407) представляла зрелую трансглютаминазу.

(2) Конверсия промотора гена трансглютаминазы

Последовательность гена PS2, который представляет собой поверхностный белок С. glutamicum, уже определена [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, синтезировали на основе этой последовательности, и амплифицировали область, включающую промотор, расположенный в области в 5'-направлении от кодона инициации гена белка PS2, с использованием ПЦР из хромосомной ДНК С. glutamicum ATCC13869, полученной обычным методом.

(SEQ ID NO: 15)

5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'

(SEQ ID NO: 16)

5'-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16: праймеры для ПЦР

С другой стороны, синтезировали праймеры, представленные в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 17, на основе последовательности гена трансглютаминазы, определенной в примере 1 (1), и амплифицировали область гена препротрансглютаминазы с использованием ПЦР из pUITG, полученной в примере 1 (1).

(SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'

(SEQ ID NO: 17) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 12 и 17: праймеры для ПЦР

Затем слитый ген трансглютаминазы, слитой с дополнительной препроструктурной областью, который лигировали с областью, включающей промотор гена клеточного поверхностного белка из С. glutamicum ATCC13869, амплифицировали перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси 1 мкл каждого из растворов для ПЦР амплифицированной области, включающей промотор гена PS2 С. glutamicum ATCC13869, и амплифмцированной области гена препротрансглютаминазы, в качестве матриц. Амплифицированный фрагмент размером примерно 1,8 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с помощью EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SamI в плазмиде pVC7, как описано в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением плазмиды pVKPTGO. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли методом, описанным выше, и в результате, как и предполагалось, было подтверждено, что слитый ген был сконструирован.

(3) Экспрессия гена препротрансглютаминазы в С. glutamicum АТСС13869

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали плазмидой pVITGC, сконструированной в примере 1 (1) (оба - промотор и ген препротрансглютаминазы получали из S. mobaraense), или плазмидой pVKPTGO, сконструированной в примере 1 (2) (промотор получали из гена PS2 С. glutamicum ATCC13869 и ген препротрансглютаминазы получали из S. mobaraense), и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола (10 г дрожжевого экстракта, 10 г триптона, 5 г сахарозы, 5 г NaCl, 5 г агара на литр дистиллированной воды). Отобранные клетки С. glutamicum ATCC13869, несущие pVITGC или pVKPTGO, культивировали в культуральной среде ММ (30 г глюкозы, 0,4 г сульфата магния гептагидрата, 30 г сульфата аммония, 1 г первичного кислого фосфата калия, 0,01 г сульфата железа (II) гептагидрата, 0,01 г сульфата марганца (II) пентагидрата, 200 мкг тиамина гидрохлорида, 500 мкг биотина, 0,15 г DL-метионина, 50 г карбоната кальция на литр дистиллированной воды, рН доводили до 7,5), содержащей 5 мг/л хлорамфеникола, соответственно при 30°С в течение 48 ч. После окончания инкубации 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем вестерн-блоттингу с использованием антител против трансглютаминазы, как описано в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994), обычным методом (например, общей методикой, как описано у Sambrook et al. (1989) (выше)).

В результате секрецию трансглютаминазы невозможно было детектировать. На основании представленных выше данных было подтверждено, что сигнальная последовательность трансглютаминазы из S. mobaraense не функционирует в С. glutamicum ATCC13869.

Пример 2: Секреторная продукция зрелой трансглютаминазы с использованием слитого гена, кодирующего сигнальный пептид клеточного поверхностного белка Corynebacterium glutamicum (С. glutamicum ATCC13869) и зрелую трансглютаминазу из S. mobaraense IFO13819

(1) Конструирование гена трансглютаминазы, включающего сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869

Последовательность гена PS2, который представляет собой белок клеточной поверхности С. glutamicum, уже определена [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 18, синтезировали на основе последовательности, и область, кодирующую 44 N-концевых аминокислотных остатков (30 аминокислотных остатков сигнального пептида и 14 аминокислотных остатков зрелого клеточного поверхностного белка) белка, соответствующего PS2, и область в 5'-направлении, включающую промотор, амплифицировали ПЦР с хромосомной ДНК С. glutamicum ATCC13869, полученной методом, описанным в примере 1 (2). Праймер, представленный в SEQ ID NO: 18, также включает последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность от N-концевой области зрелой трансглютаминазы, для конструирования слитого гена, слитого с трансглютаминазой.

(SEQ ID NO: 15)

5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'

(SEQ ID NO:18)

5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 15 и 18: праймеры для ПЦР

С другой стороны, праймеры, представленные в SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, синтезировали на основе последовательности гена трансглютаминазы, определенной в примере 1 (1), и область гена зрелой трансглютаминазы амплифицировали с использованием ПЦР с pUITG, полученной в примере 1 (1).

Слитый ген зрелой трансглютаминазы, который был соединен с областью, кодирующей 44 N-концевых аминокислотных остатков С. glutamicum ATCC13869 и с областью в 5'-направлении, включающей промотор гена клеточного поверхностного белка, амплифицировали перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, кодирующей 44 N-концевых аминокислотных остатков белка, соответствующего PS2 С. glutamicum, и амплифицированной области в 5'-направлении, включающей промотор, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области гена зрелой трансглютаминазы, в качестве матриц.

Амплифицированный фрагмент размером примерно 1,7 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт Smal в плазмиде pVC7, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением плазмиды pVKPTG3. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли методом, описанным выше, и в результате было подтверждено, что предполагаемый слитый ген сконструирован.

Кроме того, слитый ген зрелой трансглютаминазы размером примерно 1,7 т.п.н., который лигировали с областью, кодирующей 44 N-концевых аминокислотных остатков из С. glutamicum АСТТ13869, и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена клеточного поверхностного белка, вырезали расщеплением pVKTG3 с помощью KpnI и XbaI и выделяли электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент вставляли в сайт KpnI-XbaI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с конструированием плазмиды pPKTG3.

(2) Секреция зрелой трансглютаминазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали сконструированными плазмидами pVKTG3 или pPKTG3 (в обоих случаях ген, включающий промотор, и ген, кодирующий сигнальный пептид и 44 N-концевых аминокислотных остатков, получали из С. glutamicum ATCC13869, и ген зрелой трансглютаминазы получали из S. mobaraense), и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина. Затем отобранные клетки С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиду pVITG3 или pVKPTG3, культивировали в жидкой культуральной среде ММ, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина соответственно при 30°С в течение 48 ч. После окончания инкубации 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг обычным методом с использованием антител против трансглютаминазы, как описано в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994). В результате в супернатанте культуры обоих штаммов обнаруживали небольшое количество секретированной трансглютаминазы, имеющей такую же молекулярную массу, что и зрелая трансглютаминаза.

Пример 3: Секреторная продукция протрансглютаминазы с использованием слитого гена протрансглютаминазы (слитого гена гетерологично слитой препротрансглютаминазы) из S. mobaraense IFO13819, лигированного с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869

(1) Конструирование гена трансглютаминазы (слитого гена гетерологично слитой препротрансглютаминазы), содержащей дополнительную проструктурную область с сигнальным пептидом клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22, синтезировали на основе последовательности гена PS2, который представляет собой белок клеточной поверхности С. glutamicum [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Кодирующую область N-концевых аминокислотных остатков 30, 31, 44 и 68 (область, включающая 30 аминокислотных остатков сигнального пептида) и область в 5'-направлении, включающую промотор белка, соответствующего PS2, амплифицировали ПЦР с использованием соответственно комбинации SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 22 из хромосомной ДНК С. glutamicum ATCC13869, полученной методом, описанным в примере 1 (2).

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO; 21 и SEQ ID NO: 22, включали последовательности, кодирующие N-концевые аминокислоты протрансглютаминазы, для того, чтобы сконструировать слитый ген, слитый с трансглютаминазой, имеющей проструктурную область.

(SEQ ID NO: 15)

5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'

(SEQ ID NO: 19)

5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3'

(SEQ ID NO: 20)

5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3'

(SEQ ID NO: 21)

5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'

(SEQ ID NO: 22)

5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 15, 19, 20, 21 и 22: праймеры для ПЦР

С другой стороны, праймеры, представленные в SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 12, синтезировали, на основе последовательности гена трансглютаминазы, определенной в примере 1 (1), и область гена протрансглютаминазы амплифицировали с использованием ПЦР с pUITG, полученной в примере 1 (1).

(SEQ ID NO:12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'

(SEQ ID NO:23) 5'-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 22 и 23: праймеры для ПЦР

Затем ген гетерологично слитой протрансглютаминазы, лигированный с соответствующей областью, кодирующей ее 30, 31, 44 или 68 N-концевых аминокислотных остатков, и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена белка, соответствующего PS2 из С. glutamicum ATCC13869, т.е. фрагменты генов гетерологично слитой препротрансглютаминазы, которые лигировали с промотором гена клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси, которая включала 1 мкл раствора для ПЦР области в 5'-направлении, содержащей промотор гена белка, соответствующего PS2 С. glutamicum ATCC13869, и одной из амплифицированных областей, кодирующей 30, 31, 44 или 68 N-концевых аминокислотных остатков белка, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области гена трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, в качестве матриц.

Амплифицированные фрагменты размером в пределах примерно 1,8 т.п.н.-1,9 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данные фрагменты выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SmaI в плазмиде pVC7, как описано в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением соответственно плазмид pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 и pVKPTG4. Нуклеотидные последовательности вставленных фрагментов определяли вышеуказанным методом и в результате было подтверждено наличие предполагаемых слитых генов.

Кроме того, слитые гены размером в пределах примерно 1,8 т.п.н.-1,9 т.п.н. трансглютаминазы, имеющей проструктурные области, которые лигировали с соответствующей областью, кодирующей 30, 31, 44 или 68 аминокислотных остатков, и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена белка, соответствующего PS2 С. glutamicum, вырезали расщеплением плазмид pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 или pVKPTG4 с помощью соответственно KpnI и XbaI и выделяли электрофорезом в агарозном геле. Данные фрагменты вставляли в сайт KpnI-XbaI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с конструированием pPKPTG1, pPKPTG2, рРКРТС3 или pPKPTG4.

(2) Секреция протрансглютаминазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. glutamicum АТСС13869

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали сконструированными плазмидами pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 или pPKPTG4 и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиды pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 или pPKPTG4, культивировали в культуральной среде MM, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина соответственно при 30°С в течение 48 ч. После окончания инкубации 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг обычным методом с использованием антител против трансглютаминазы, как описано в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994). В результате обнаруживали секрецию в одинаковых количествах трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, для обоих векторов, pVC7 или рРК4, и в зависимости от длины N-концевых аминокислотных остатков зрелой формы белка, соответствующего PS2, наблюдали достоверные различия в секретируемых количествах. Типичные секретированные количества представлены в таблице 1.

Таблица 1 Секретированные количества протрансглютаминазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869
Плазмида	Протрансглютаминаза (мг/л)
pPKPTG1	78
pPKPTG4	210

Пример 4: Секреторная продукция протрансглютаминазы с использованием слитого гена, включающего последовательность, кодирующуюсигнальнуюпоследовательностьклеточного поверхностного белка С. ammoniagenes и протрансглютаминазу из S. mobaraense IFO13869

(1) Конструирование гена трансглютаминазы, включающей дополнительную проструктурную область и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes (слитого гена гетерологично слитой препротрансглютаминазы)

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, синтезировали на основе последовательности гена клеточного поверхностного белка (SlpA) [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675] С. ammoniagenes, и область в 5'-направлении, включающую промотор гена клеточного поверхностного белка (SlpA), и область, включающую 25 N-концевых аминокислотных остатков (сигнальный пептид) SlpA, амплифицировали с использованием ПЦР из хромосомной ДНК С. ammoniagenes, полученной обычным методом. Праймер, представленный в SEQ ID NO: 25, также включал последовательность, кодирующую N-концевые аминокислоты протрансглютаминазы для конструирования слитого гена, слитого с протрансглютаминазой.

(SEQ ID NO: 24)

5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'

(SEQ ID N0: 25)

5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 23 и 24: праймеры для ПЦР

Слитый ген трансглютаминазы, включающей дополнительную проструктурную область, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков С. ammoniagenes, и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена клеточного поверхностного белка (SlpA) (ген гетерологично слитой препротрансглютаминазы), амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси, в качестве матриц, содержащей 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области в 5'-направлении, включающей промотор гена клеточного поверхностного белка (SipA), и область, кодирующую 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, и 1 мкл раствора ПЦР области гена трансглютаминазы, включающей дополнительную проструктурную область, которая была амплифицирована в примере 3 (1). Амплифицированный фрагмент размером примерно 1,7 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SmaI в плазмиде pVC7 с получением плазмиды pVSPTG1.

(2) Конверсия промотора: лигирование промотора гена клеточного поверхностного белка С. glutamicum ATCC13869

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 26 синтезировали на основе последовательности гена PS2, который представляет собой белок клеточной поверхности С. glutamicum [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Область в 5'-направлении, включающую промотор гена белка, соответствующего PS2, амплифицировали с использованием ПЦР из хромосомной ДНК С. glutamicum ATCC13869, полученной методом, описанным в примере 1 (2). Праймер, представленный в SEQ ID NO: 26, также включает последовательность, кодирующую N-концевые аминокислоты сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes для конструирования слитого гена с геном трансглютаминазы, включающей проструктурную область, соединенную с сигнальной последовательностью клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes (слитый ген гетерологично слитой препротрансглютаминазы).

(SEQ ID NO: 15)

5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'

(SEQ ID NO: 26)

5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 15, 26: праймеры для ПЦР

С другой стороны, праймеры, представленные в SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 12, синтезировали на основе последовательности слитого гена трансглютаминазы, имеющей дополнительную проструктурную область и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes. Затем область трансглютаминазы, имеющую дополнительную проструктурную область, амплифицировали ПЦР из плазмиды pVSPTG1, полученной в примере 4 (1) с помощью праймеров.

(SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'

(SEQ ID N0: 27) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 12 и 27: праймеры для ПЦР

Затем слитый ген трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, и с областью в 5'-направлении, включающей промотор гена белка, соответствующего PS2 С. glutamicum АТСС13869, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси, содержащей 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области в 5'-направлении, включающей промотор гена белка, соответствующего PS2 С. glutamicum, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области гена трансглютаминазы, включающей проструктурную область, которая включала сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes (ген гетерологично слитой препротрансглютаминазы).

Амплифицированный фрагмент размером примерно 1,8 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SamI в плазмиде pVC7, как описано в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением плазмиды pVKSPTG1. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли вышеуказанным методом, и в результате было подтверждено, что предполагаемый слитый ген сконструирован.

Слитый ген размером примерно 1,8 т.п.н. трансглютаминазы, имеющей проструктуру, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков (сигнальный пептид) клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, и который включал область в 5'-направлении, содержащую промотор гена белка, соответствующего PS2 С. glutamicum ATCC13869, вырезали расщеплением pVKSPTG1 с помощью KpnI и XbaI, и фрагмент выделяли электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент вставляли в сайт KpnI-XbaI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с конструированием плазмиды pPKSTG1. Обе плазмиды, pVKSPTG1 и pPKSPTG1, включали промотор, полученный из гена PS2 С. glutamicum ATCC13869, ген сигнального пептида из SlpA С. ammoniagenes и ген трансглютаминазы из S. mobaraense.

(3) Конверсия в tac-промотор Е. coli

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, синтезировали на основе последовательности плазмиды рКК223-3 (Amersham Pharmacia Co. Ltd.), в которую клонировали tac-промотор Е. coli. Область, соответствующую tac-промотору, амплифицировали с использованием ПЦР из ДНК плазмиды рКК223-3. Праймер, представленный в SEQ ID NO: 29, также включает последовательность, кодирующую последовательность N-концевых аминокислот сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, для конструирования слитого гена, имеющего проструктурную область, который включал сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes (ген гетерологично слитой препротрансглютаминазы).

(SEQ ID NO: 28)

5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3'

(SEQ ID NO: 29)

5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 28 и 29: праймеры для ПЦР

Слитый ген трансглютаминазы, имеющей дополнительную проструктурную область, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, и который включал tac-промотор (ген гетерологично слитой препротрансглютаминазы), амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 12 с использованием смеси 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, соответствующей tac-промотору, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области гена трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, которая включала сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, в качестве матриц. Амплифицированный фрагмент размером примерно 1,5 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) и вставляли в сайт SamI в плазмиде pVC7, как описано в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-070291, с получением плазмиды pVTSPTG1. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли вышеуказанным способом, и в результате было подтверждено, что предполагаемый слитый ген сконструирован.

Слитый ген размером примерно 1,5 т.п.н. трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes и tac-промотор, вырезали расщеплением pVTSPTG1 с помощью KpnI и XbaI и выделяли электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент вставляли в сайт KpnI-XbaI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с конструированием pPTSPTG1. Обе плазмиды, pVTSPTG1 и pPTSPTG1, включали tac-промотор, полученный из гена Е. coli, ген сигнального пептида, полученный из SlpA С. ammoniagenes и ген протрансглютаминазы, полученный из S. mobaraense.

(4) Секреция протрансглютаминазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали сконструированными плазмидами pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 или pPTSPTG1 и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиды pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 или pPTSPTG1, культивировали в вышеуказанной культуральной среде ММ, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола или 25 мг/л канамицина соответственно при 30°С в течение 48 ч. После окончания инкубации 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг с использованием антител против трансглютаминазы обычным методом, как описано в Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994). В результате обнаруживали одинаковые количества секретированной трансглютаминазы для каждого из векторов pVC7 или рРК4. Типичные секретированные количества представлены в таблице 2.

Таблица 2 Секретированные количества протрансглютаминазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes ATCC13869
Плазмида	Протрансглютаминаза (мг/л)
pPKSPTG1	102
pPTSPTG1	74

Пример 5: Секреторная продукция протрансглютаминазы с использованием слитого гена, включающего последовательность, кодирующуюсигнальнуюпоследовательностьклеточного поверхностного белка С. ammoniagenes и протрансглютаминазу из Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852

(1) Конструирование слитого гена, включающего последовательность, кодирующую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes, и последовательность, кодирующую протрансглютаминазу из S. cinnamoneum IFO12852

Последовательность гена трансглютаминазы S. cinnamoneum IFO12852 уже определена [заявка на выдачу патента Японии №11-295649]. Полагается, что область от положения 1 до положения 32 в аминокислотной последовательности является последовательностью преобласти, область от положения 33 до положения 86 является последовательностью прообласти и область от положения 87 до положения 416 представляет собой последовательность зрелой трансглютаминазы. Нуклеотидная последовательность и полная аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представлены в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31. Кроме того, Escherichia coli AJ13669, которая была трансформирована плазмидой pUJ-MTG, включающей ген, первоначально была помещена на хранение в Национальный институт биологии и Агентство человеческой технологии по промышленной науке и технологии (в настоящее время Независимое административное агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 14 октября 1999 г., под номером FERM Р-17602 и передана на хранение по Будапештскому договору 28 августа 2000 г., под депозитным номером FERM BP-7287.

Область размером 3,5 т.п.н., включающую полноразмерный ген препротрансглютаминазы, вначале вырезали из плазмиды pUJ-MTG рестриктазой BamHI и получали плазмиду pUCSCTG, в которой область вставляли в сайт BamHI плазмиды pUC19.

Синтезировали праймеры, представленные в SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, и область гена, включающую протрансглютаминазу из S. cinnamoneum IFO12852, амплифицировали ПЦР с использованием плазмиды pUCSCTG, в качестве матрицы, как описано ранее.

(SEQ ID NO: 32)

5'-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3'

(SEQ ID N0: 33)

5'-GGC GGATCC TVG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 32 и 33: праймеры для ПЦР

Затем область, которая содержала область в 5'-направлении, включающую промотор гена PS2, который представляет собой белок клеточной поверхности С. glutamicum, и область, включающую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes, амплифицировали постановкой ПЦР с использованием комбинации SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35 из pPKSPTG1, которую сконструировали в примере 4 (2), в качестве матрицы.

Праймер, представленный в SEQ ID NO: 35, также включал последовательность, кодирующую N-концевую аминокислотную последовательность протрансглютаминазы из Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852 для конструирования слитого гена с трансглютаминазой из Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852.

(SEQ ID NO: 34)

5'-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3'

(SEQ ID NO: 35)

5'-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GGC С -3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 34 и 35: праймеры для ПЦР

Фрагмент гена гетерологично слитой препротрансглютаминазы, который лигировали с сигнальной последовательностью клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена PS2, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 33 с использованием смеси, включающей 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, кодирующей ген протрансглютаминазы из С. cinnamoneum IFO12852, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, включающей область в 5'-направлении, содержащую промотор гена PS2 и область, включающую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes, в качестве матриц.

Амплифицированный фрагмент размером 1,8 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент расщепляли EcoRI и BamHI, затем выделяли из агарозного геля и вставляли в сайт EcoRI-BamHI в плазмиде pUC19, с получением плазмиды pUKSPTG2'. Последовательность вставленного фрагмента определяли вышеуказанным методом и в результате было подтверждено, что предполагаемый ген сконструирован. Данную плазмиду pUKSPTG2' расщепляли EcoRI, «затупляли концы» набором для «затупления концов» (Takarashuzo Co. Ltd.) и затем вставляли линкер XbaI (Takarashuzo Co. Ltd.), имеющий последовательность 5'-CTCTAGAG-3', в котором 5'-конец был фосфорилирован, и подвергали повторной циклизации с конструированием плазмиды pUKSPTG2. Слитый ген препротрансглютаминазы размером примерно 1,8 т.п.н. (ген протрансглютаминазы получали из S. cinnamoneum IFO12852) вырезали расщеплением плазмиды pUKSPTG2 с помощью XbaI и выделяли электрофорезом в агарозном геле. Данные фрагменты вставляли в сайт XbaI в плазмиде рРК4, описанной ранее, с конструированием плазмиды pPKSPTG2.

Конструировали ген препротрансглютаминазы, имеющей химерную проструктурную область, в которой N-конец проструктурной области был частично замещен проструктурной областью S. mobaraense (ген зрелой трансглютаминазы и часть проструктурной области получали из S. cinnamoneum IFO12852).

Вначале фрагмент размером примерно 1,8 т.п.н., включающий ген препротрансглютаминазы EcoRI-BamHI, вырезали из плазмиды pPKSPTG1 (для экспрессии протрансглютаминазы из S. mobaraense IFO13819), которую конструировали в примере 4 (2), и фрагмент вставляли в сайт EcoRI-BamHI в плазмиде pUC19 (pUKSPTG1). Фрагмент размером примерно 1,2 т.п.н. вырезали расщеплением плазмиды pUKSPTG1 с помощью Aatll, и плазмиду pUKSPTG2' также расщепляли с помощью Aatll с получением фрагмента размером примерно 3,3 т.п.н. с удалением фрагмента размером 1,2 т.п.н. Данный фрагмент размером примерно 3,3 т.п.н. лигировали с фрагментом Aatll размером примерно 1,2 т.п.н., полученным из pUKSPTG1, и отбирали клоны со вставленным фрагментом Aatll обычными методами генной инженерии. Для того чтобы определить ориентацию вставленного фрагмента Aatll в клонах, клоны серийно секвенировали и отбирали клоны, в которые фрагмент был вставлен в желаемой ориентации (для кодирования препротрансглютаминазы) (pUKSPTG3').

Кроме того, у сайта EcoRI в плазмиде pUKSPTG3' также «затупляли концы», как описано для плазмиды pUKSPTG2', и вставляли линкер XbaI с конструированием плазмиды pUKSPTG3.

Дополнительно фрагмент размером 1,8 т.п.н., вырезанный из плазмиды pUKSPTG3, вставляли в сайт XbaI в плазмиде рРК4 конструированием pPKSPTG3.

(2) Секреция протрансглютаминазы из Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852 с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали плазмидами pPKSPTG2 или pPKSPTG3 и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, описанной выше, содержащей 25 мг/л канамицина. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиду pPKSPTG2 или рРКSРТС3, культивировали соответственно в жидкой культуральной среде MMTG (60 г глюкозы, 0,4 г сульфата магния гептагидрата, 30 г сульфата аммония, 1 г первичного кислого фосфата калия, 0,01 г сульфата железа (II) гептагидрата, 0,01 г сульфата марганца (II) пентагидрата, 450 мкг тиамина гидрохлорида, 450 мкг биотина, 0,15 г DL-метионина, 50 г карбоната кальция на литр дистиллированной воды, рН доводили до 7,5), содержащей 25 мг/л канамицина при 30°С в течение 3 суток. После окончания инкубации 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг обычным методом с использованием антител против трансглютаминазы, как описано ранее. Данные антитела представляли антитела против трансглютаминазы, полученной из S. mobaraense, но было показано, что они также проявляют реактивность в отношении трансглютаминазы из S. cinnamoneum. В результате подтверждали секрецию трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, полученную из S. cinnamoneum IFO12852 (примерно 30-50 мг/л).

Пример 6: Клонирование гена сериновой протеазы (SAMP45) и конструирование и оценка экспрессирующих плазмид

(1) Конструирование гена сериновой протеазы (SAMP45), имеющей проструктурную область и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes (гена гетерологично слитой препросериновой протеазы (SAMP45)

Последовательность гена SAMP45, которая представляет собой сериновую протеазу, продуцированную S. albogriseolus [J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)], уже определена. Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, синтезировали на основе данной последовательности, и область гена, включающую N-концевую проструктурную область SAMP45, зрелую SAMP45 и С-концевую проструктурную область амплифицировали с использованием ПЦР методом, описанным ранее.

(SEQ ID NO: 36)

5'-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3'

(SEQ ID NO: 37)

5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 36 и 37: праймеры для ПЦР

Область, включающую область в 5'-направлении, содержащую промотор гена клеточного поверхностного белка PS2 из С. glutamicum и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA из С. ammoniagenes, аналогично амплифицировали с использованием ПЦР с комбинацией SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39 с использованием плазмиды pPKSPTG1, сконструированной в примере 4 (2), в качестве матрицы.

Праймер, представленный в SEQ ID NO: 39, включает последовательность, кодирующую N-концевые аминокислоты просериновой протеазы, с конструированием слитого гена, включающего сериновую протеазу, имеющую проструктурную область.

(SEQ ID NO: 38)

5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'

(SEQ ID NO: 39)

5'-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 38 и 39: праймеры для ПЦР для конструирования слитого гена просериновой протеазы

Затем фрагмент гена гетерологично слитой препросериновой протеазы, который лигировали с сигнальной последовательностью клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes и областью в 5'-направлении, включающей промотор гена PS2, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 37 с использованием смеси, в качестве матриц, которая включала соответственно 1 мкл раствора ПЦР амплифицированной области, содержащей ген N-концевой проструктуры SAMP45, зрелую SAMP45 и С-концевую проструктуру, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, включающей область в 5'-направлении, содержащей промотор гена PS2 и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes.

Амплифицированный фрагмент размером примерно 3,9 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Продукт ПЦР расщепляли HindIII и EcoRI, затем подвергали электрофорезу в агарозном геле, из агарозного геля выделяли фрагмент размером примерно 3,9 т.п.н. и вставляли в сайт HindIII-EcoRI вышеуказанной плазмиды pVC7 с получением соответственно плазмиды pVSS1. Последовательность вставленного фрагмента определяли вышеуказанным методом и в результате было подтверждено, что предполагаемый слитый ген сконструирован.

(2) Секреция сериновой протеазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали плазмидой pVSS1 и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиду pVSS1, культивировали в культуральной среде MMTG, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола при 30°С в течение 70 ч. 1 мл культуральной среды разделяли на супернатант культуральной среды и клетки центрифугированием. Клетки суспендировали в 0,1 М натриевом фосфатном буфере (рН 7,0). Активность сериновой протеазы определяли следующим образом: 50 мкл супернатанта культуральной среды или клеточной суспензии добавляли к 20 мМ натриевому фосфатному буферу (рН 7,0), содержащему 0,25 мМ Bz-Phe-Val-Arg-pNA (Bachem Co. Ltd.) с получением общего объема, равного 0,6 мл, смесь выдерживали при 30°С в течение 20 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 0,4 мл 50% уксусной кислоты. Поглощение определяли при 410 нм и активность фермента определяли по количеству выделенного p-NA (п-нитроанилида). За одну единицу фермента принимали количество фермента, которое выделяет 1 мкмоль pNA в одну минуту. В результате активность сериновой протеазы не определяли в супернатанте культуральной среды, но обнаруживали в клеточной суспензии. По значениям установленной активности и значениям удельной активности, имеющимся в литературе [J. Bacteriol., 179, 430-438 (1997)], было установлено, что на поверхности клеток экспрессируется и секретируется примерно 9 мг/л сериновой протеазы.

Пример 7: Клонирование гена пролиновой специфической пептидазы (svPEP), конструирование и оценка экспрессирующих плазмид

(1) Очистка и анализ N-концевых аминокислот пролиновой специфической пептидазы (svPEP), продуцированной S. mobaraense IFO13819

800 мл жидкой культуральной среды ISP2 (4 г дрожжевого экстракта, 10 г солодового экстракта, 4 г глюкозы, доведенных до 1 л водой, рН доводили до 7,3) помещали в колбу Сакагуши емкостью 5 л, высевали S. mobaraense IFO13819 с чашки в колбу и культивировали при встряхивании колбы при 30°С в течение 48 ч со скоростью 120 об/мин.

Культуральную среду центрифугировали для удаления супернатанта культуры и собирали клетки. После промывания клеток 20 мМ Трис-HCl буфером, содержащим 25 мг/л канамицина, полученные клетки суспендировали в 0,1 М натриевом фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 25 мг/л канамицина. Суспензию встряхивали на льду в течение 4 ч и центрифугировали с получением супернатанта, который собирали. После стерилизации супернатанта фильтрованием с использованием нитроцеллюлозного фильтра (размер пор 0,22 мкм, Sartrius Co. Ltd.) супернатант пропускали через колонку (1,6ϕ×10 см) с бутил-сефарозой 4FF (Amersham Pharmacia Co. Ltd.), которую предварительно уравновешивали 1,5 М сульфатом аммония/50 мМ фосфатным буфером (рН 7,0) с использованием ВЭЖХ (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) и элюировали в линейном градиенте сульфата аммония 1,5 до 0 М в том же буфере. Собирали фракции, содержащие активные компоненты, пропускали через колонку с фенил-сефарозой HP (1 мл, Amersham Pharmacia Co. Ltd.) в тех же условиях и собирали активные фракции и диализовали в течение ночи против 50 мМ натриевого фосфатного буфера (рН 7,0) при 4°С с получением раствора частично очищенного фермента. Раствор частично очищенного фермента подвергали обратнофазовой хроматографии для дополнительной очистки. Условия проведения обратнофазовой хроматографии были следующими:

Прибор для ВЭЖХ: насос: HITACHI L-6300, детектор: L-4000H

Колонка: PROTEIN C4 214ТР5410 (VYDAC Co. Ltd.)

Элюирование: элюирование проводили в линейном градиенте смеси ацетонитрил 24-40%/0,1% трифторуксусная кислота (20 мин) при комнатной температуре

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Длина волны определения: 280 нм.

Пробу фермента, которую очищали в условиях, описанных выше, переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) с использованием мембранного картриджа (Perkin Elmer Co., Ltd.) и N-концевую аминокислотную последовательность определяли с использованием газофазного белкового секвенатора PPSQ-10 (Shimazu Seisakusho Co., Ltd.). В результате определяли 20 N-концевых аминокислотных остатков, которые представлены в SEQ ID NO: 40.

(2) Получение гена пролиновой специфической пептидазы (svPEP) из S. mobaraense IFO13819

Отбирали область, которую вывели на основе установленной N-концевой аминокислотной последовательности svPEP и которая обладала меньшей вырожденностью, Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 41), и получали синтетический олигонуклеотид, представленный в SEQ ID NO: 42. Хромосомную ДНК S. mobaraense IFO13819, полученную обычным методом, расщепляли различными рестриктазами, которые «узнают» последовательность из 6 нуклеотидов, и затем анализировали гибридизацией на основе саузерн-блоттинга с использованием данного синтетического олигонуклеотида в качестве зонда и при этом обнаруживали одну полосу, соответствующую размеру примерно 6 т.п.н. при расщеплении SacI. Соответственно хромосомную ДНК S. mobaraense IFO13819, полученную вышеуказанным методом, расщепляли SacI и выделяли фрагмент размером примерно 6 т.п.н. электрофорезом в агарозном геле с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.). Выделенный фрагмент вставляли в сайт SacI в плазмиде pUC18, которую вводили в компетентные клетки Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.) с получением таким образом библиотеки. Полученную таким образом библиотеку подвергали скринингу на штамм, несущий плазмиду, в которую клонировали фрагмент гена svPEP, скринингом библиотеки гибридизацией колоний с использованием ³²Р-меченого синтетического олигонуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 38, в качестве зонда, с получением желаемого гена. Плазмиду, полученную из данного штамма, обозначали pUMP1.

(SEQ ID N0: 42)

5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 42: зонд для svPEP

Определяли нуклеотидную последовательность фрагмента, который клонировали в виде pUMPl. Выводили аминокислотную последовательность, кодируемую данным геном, устанавливали ранее определенную N-концевую аминокислотную последовательность (20 остатков), основываясь на белке фермента, и определяли полную первичную аминокислотную последовательность, включающую предполагаемую сигнальную последовательность и проструктурную область svPEP, которая представлена в SEQ ID NO: 9. Предполагается, что аминокислотная последовательность, положения 1-25, является сигнальной последовательностью, положения 26-33 представляют собой проструктуру и положения 34-477 представляют собой зрелую svPEP.

Escherichia coli AJ13669, которую трансформировали плазмидой pUMP1, первоначально была помещена на хранение в Национальный институт биологии и Агентство человеческой технологии по промышленной науке и технологии (в настоящее время Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 15 мая 2000 г., под номером FERM ВР-7160 по Будапештскому договору.

(3) Конструирование гена пролиновой специфической пептидазы (svPEP), включающей проструктурную область с сигнальной последовательностью клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes (гена гетерологично слитой препропролиновой специфической пептидазы (svPEP))

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, синтезировали на основе последовательности svPEP, определенной в примере 7 (2), и область гена, включающую прообласть svPEP и зрелую svPEP, амплифицировали ПЦР таким же образом, как описано ранее с использованием плазмиды pUMP1, сконструированной в примере 7 (2), в качестве матрицы.

(SEQ ID NO: 43)

5'-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3'

(SEQ ID NO: 44)

5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGGCGGCGGCACCCGG-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 43 и 44: праймеры для ПЦР

Затем область, которая включала область в 5'-направлении, содержащую промотор гена PS2, который представляет собой ген клеточного поверхностного белка С. glutamicum, и область, включающую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes, амплифицировали ПЦР из плазмиды pPKSPTG1, сконструированной в примере 4 (2), с использованием комбинации SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 45 в качестве матрицы.

Праймер, представленный в SEQ ID NO: 45 включает последовательность, кодирующую N-концевые аминокислоты в svPEP для конструирования слитого гена, слитого с svPEP, обладающей проструктурной областью.

(SEQ ID NO: 38)

5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGGCTGA-3'

(SEQ ID NO: 45)

5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 38 и 45: праймеры для ПЦР

Затем фрагмент гетерологично слитого гена препроsvPEP, который лигировали с сигнальной последовательностью клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes и областью в 5'-направлении, включающую промотор гена PS2, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 44 с использованием смеси, в качестве матриц, которая включала 1 мкл каждого из растворов для ПЦР области, содержащей ген, кодирующий проструктурную область svPEP и зрелую svPEP, которые были соответственно амплифицированы, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области, включающей область в 5'-направлении, содержащей промотор гена PS2 и сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка SlpA С. ammoniagenes.

(SEQ ID NO: 38)

5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTTA-3'

(SEQ ID NO: 44)

5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 44: праймеры для ПЦР

Амплифицированный фрагмент размером примерно 2,1 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Фрагмент после ПЦР расщепляли HindIII, затем подвергали электрофорезу в агарозном геле и фрагмент размером примерно 2,1 т.п.н. выделяли из агарозного геля и вставляли в сайт HindIII в плазмиде pVSS1, описанной в примере 6 (1), с получением соответственно плазмиды pVSSSP1. Последовательность вставленного фрагмента определяли обычным методом и в результате было подтверждено, что предполагаемый ген сконструирован.

(4) Секреция пролиновой специфической пептидазы с использованием сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка С. ammoniagenes

С. glutamicum ATCC13869 трансформировали сконструированной плазмидой pVSSSP1 и отбирали штаммы, выросшие на агаровой среде CM2S, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиду pVSSSP1, культивировали в культуральной среде MMTG, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола при 30°С в течение 70 ч. 10 мл культуральной среды разделяли центрифугированием на супернатант культуры и клетки. Клетки суспендировали в 0,1 М натриевом фосфатном буфере (рН 7,0). Активность svPEP определяли следующим образом: 50 мкл супернатанта культуральной среды или клеточной суспензии добавляли к 20 мМ натриевому фосфатному буферу (рН 7,0), содержащему 0,25 мМ Ala-Ala-Pro-pNA (Bachem Co. Ltd.) с получением общего объема, равного 0,6 мл, и смесь выдерживали при 30°С в течение 20 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 0,4 мл 50% уксусной кислоты. Поглощение определяли при 410 нм и активность фермента определяли по количеству выделенного p-NA (п-нитроанилида). За одну единицу фермента принимали количество фермента, которое выделяет 1 мкмоль pNA в одну минуту. В результате активность svPEP не определяли в супернатанте культуральной среды, но обнаруживали в клеточной суспензии. По значениям установленной активности и значениям удельной активности (35,5 мкг/мг), описанной в примере 7 (1), было установлено, что на поверхности клеток экспрессируется и секретируется примерно 50 мг/л svPEP.

(5) Отщепление проструктурной области трансглютаминазы, имеющей проструктуру, сериновой протеазой и пролиновой специфической протеазой, экспрессированными и секретированными С. glutamicum ATCC13869

С. glutamicum ATCC13869, несущие секреторную экспрессирующую трансглютаминазу плазмиду pPKSPTG1, имеющую проструктурную область, описанную в примере 4 (2), трансформировали сконструированной плазмидой pVSSSP1 и отбирали штаммы, выросшие на вышеуказанной агаровой среде CM2S, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола и 25 мг/л канамицина. Затем отобранные С. glutamicum ATCC13869, несущие плазмиды pVSSSP1 и pPKSPTG1, культивировали в культуральной среде MMTG, описанной выше, содержащей 5 мг/л хлорамфеникола и 25 мг/л канамицина при 30°С в течение 70 ч. После окончания культивирования 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и затем проводили вестерн-блоттинг обычным методом с использованием антител против трансглютаминазы, описанными ранее. В результате было подтверждено, что SAMP45 и svPEP нормально экспрессировались и секретировались и что проструктурная область отщеплялась от трансглютаминазы, имеющей проструктурную область, которая также секретировалась, посредством чего была подтверждена секреция трансглютаминазы, имеющей такую же молекулярную массу, что и нативная зрелая трансглютаминаза.

Активность трансглютаминазы определяли в супернатанте гидроксаматным методом, описанным ранее, с помощью чего было подтверждено, что она имела такую же удельную активность (примерно 20 Е/мг), что и нативная трансглютаминаза.

Кроме того, после проведения SDS-PAGE ее переносили для постановки блоттинга в полусухом виде на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF), как описано ранее. После блоттинга мембраны из PVDF окрашивали кумасси бриллиантовым синим, удаляли краску и высушивали на воздухе. Вырезали участок, содержащий зрелую трансглютаминазу, и определяли N-концевую аминокислотную последовательность с использованием белкового секвенатора. В результате было подтверждено, что она имела ту же N-концевую последовательность, что и нативная трансглютаминаза, полученная из S. mobaraense, начиная с Asp, находящейся в положении 77, что представлено в SEQ ID NO: 6.

Пример 8: Секреторная продукция человеческого эпидермального фактора роста (hEGF) с использованием слитого гена, включающего последовательность, кодирующую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка из Corynebacterium ammoniagenes АТСС6872, и последовательность, кодирующую человеческий эпидермальный фактор роста

(1) Конструирование гена hEGF, включающего сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка Corynebacterium glutamicum ATCC13869

Последовательность гена клеточного поверхностного белка Corynebacterium glutamicum, PS2, уже определена [Мо1. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 46 и NO: 47, синтезировали на основе данной последовательности. Область гена, включающую область в 5'-направлении и область, кодирующую 44 N-концевых аминокислотных остатков белка, соответствующего PS2, амплифицировали ПЦР из хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869, которую получали методом Саито и Миура [Biochem. Biophys. Act., 72, 619 (1963)]. Праймер, представленный в SEQ ID NO: 46, включал сайт KpnI в его 5'-конце, который был необходим для вставки области в плазмиду.

(SEQ ID NO:46)

5'-GCTCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'

(SEQ ID NO: 47)

5'-GTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 46 и 47: праймеры для ПЦР

С другой стороны, синтезировали праймеры, представленные в SEQ ID NO: 48 и NO: 49. Область, кодирующую hEGF, амплифицировали ПЦР из плазмиды pT13SΔhIL2-KS-hEGF (H3) (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №64-2583), которая включала последовательность гена hEGF. Escherichia coli AJ12354, трансформированная включающей ген плазмидой pT13SΔhIL2-KS-hEGF (H3), первоначально была помещена на хранение в Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 20 ноября 1987 г. и передана на хранение по Будапештскому договору 18 марта 2002 г. под депозитным номером FERM ВР-7966.

Праймер, представленный в SEQ ID NO: 48, включает последовательность, кодирующую С-концевые аминокислоты сигнальной последовательности PS2, для конструирования слитого гена с областью, которая содержит область в 5'-направлении и которая также включает область, кодирующую 44 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка, соответствующего PS2.

(SEQ ID N0: 48)

5'-AACATCAACAACGGCTTCAACAATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3'

(SEQ ID N0: 49)

5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 48 и 49: праймеры для ПЦР

Затем слитый ген, в котором hEGF лигировали с областью, включающей область в 5'-направлении, и область, кодирующую 44 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка Corynebacterium glutamicum, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 49 с использованием смеси, в качестве матрицы, содержащей 1 мкл раствора для ПЦР области в 5'-направлении, и области, кодирующей 44 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка Corynebacterium glutamicum, и 1 мкл раствора для ПЦР, содержащего амплифицированную область гена hEGF. Фрагмент размером примерно 0,9 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASY TRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.). Выделенную ДНК расщепляли с помощью KpnI и BamHI (Takarashuzo Со. Ltd.), очищали системой для очистки ДНК (Promega) и вставляли в сайт KpnI-BamHI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с получением pPKEGF. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли с помощью набора для секвенирования с терминатором циклов (РЕ Applied Biosystems) и секвенатором ДНК 373А (РЕ Applied Biosystems) для подтверждения того, что предполагаемый слитый ген сконструирован.

(2) Конструирование гена hEGF, включающего сигнальную последовательность Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872

Праймеры, представленные в SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 50, синтезировали на основе последовательности гена клеточного поверхностного белка (SlpA) [не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №10-108675] С. ammoniagenes, и область, включающую область в 5'-направлении, содержащую промотор гена клеточного поверхностного белка (SlpA), и область, кодирующую его 25 N-концевых аминокислотных остатков, амплифицировали с использованием ПЦР из хромосомной ДНК С. ammoniagenes, полученной методом, описанным в примере 8 (1). Праймер, представленный в SEQ ID NO: 50, также включал последовательность, кодирующую N-концевые аминокислоты hEGF, для конструирования слитого гена, слитого с hEGF.

(SEQ ID NO: 24)

5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'

(SEQ ID NO: 50)

5'-AGGGCACTCAGAATCGGAATTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 24 и 50: праймеры для ПЦР

Синтезировали праймеры, представленные в SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 49, и область, кодирующую hEGF, амплифицировали из плазмиды pT13SDhIL2-KS-hEGF (H3) (не прошедшая экспертизу заявка на выдачу патента Японии №64-2583), включающую последовательность гена hEGF.

(SEQ ID NO: 49)

5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'

(SEQ ID NO: 51)

5'-AATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 49 и 51: праймеры для ПЦР

Слитый ген, в котором ген hEGF лигировали с областью в 5'-направлении, и область, кодирующую 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) С. ammoniagenes, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 24 с использованием смеси, в качестве матриц, содержащей 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области в 5'-направлении и области, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA.) С. ammoniagenes, и 1 мкл раствора для ПЦР области гена hEGF.

Кроме того, синтезировали праймеры, указанные в SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53, и область в 5'-направлении белка, соответствующего PS2, амплифицировали ПЦР с использованием плазмиды pKEGF, полученной в примере 8 (1), в качестве матрицы. Праймер, представленный в SEQ ID NO: 53, включал 3'-концевую последовательность области в 5'-направлении белка, соответствующего PS2, и область, кодирующую N-концевые аминокислоты сигнальной последовательности клеточного поверхностного белка (SlpA) из Corynebacterium ammoniagenes.

(SEQ ID NO: 52)

5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCA-3'

(SEQ ID NO: 53)

5'-AGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAA-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 52 и 53: праймеры для ПЦР

С другой стороны, область гена hEGF, включающую сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) из Corynebacterium ammoniagenes, амплифицировали с использованием праймеров, указанных в SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 49, полученных на основе слитого гена hEGF, включающего сигнальную последовательность и область в 5'-направлении клеточного поверхностного белка (SlpA) из Corynebacterium ammoniagenes. Для постановки ПЦР использовали ДНК-полимеразу Pyrobest (Takarashuzo Со. Ltd.) и реакцию проводили в условиях, указанных в инструкции.

(SEQ ID NO: 49)

5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'

(SEQ ID NO: 54)

5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGC-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 49 и 54: праймеры для ПЦР

Затем слитый ген hEGF, который лигировали с областью, кодирующей 25 N-концевых аминокислотных остатков клеточного поверхностного белка (SlpA) из Corynebacterium ammoniagenes, и областью в 5'-направлении, кодирующей белок, соответствующий PS2 Corynebacterium glutamicum, амплифицировали постановкой перекрестной ПЦР с SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 49 с использованием смеси, содержащей 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области в 5'-направлении для белка, соответствующего PS2 Corynebacterium glutamicum, и 1 мкл раствора для ПЦР амплифицированной области гена hEGF, включающей сигнальную последовательность клеточного поверхностного белка (SlpA) из Corynebacterium ammoniagenes. Для ПЦР использовали ДНК-полимеразу Pyrobest (Takarashuzo Co. Ltd.) и реакцию проводили в условиях, указанных в инструкции. Амплифицированный фрагмент размером примерно 0,9 т.п.н. детектировали электрофорезом в агарозном геле. Данный фрагмент выделяли из агарозного геля с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Со. Ltd.), расщепляли с помощью Kpnl и BamHI (Takarashuzo Co. Ltd.) и очищали системой для очистки ДНК (Promega). Фрагмент вставляли в сайт KpnI-BamHI в плазмиде рРК4, описанной в не прошедшей экспертизу заявке на выдачу патента Японии №9-322774, с получением плазмиды pPSEGF. Нуклеотидную последовательность вставленного фрагмента определяли с использованием набора для секвенирования с терминатором циклов (РЕ Applied Biosystems) и секвенатором ДНК 373А (РЕ Applied Biosystems) для подтверждения того, что предполагаемый слитый ген был сконструирован.

(3) Получение продуцирующих hEGF штаммов

Corynebacterium glutamicum ATCC13869 трансформировали экспрессирующей hEGF плазмидой pPSEGF, сконструированной, как описано в п. (2), электропорацией с получением устойчивых к канамицину штаммов. Полученные штаммы культивировали при встряхивании при 30°С в течение 3 суток в жидкой среде MMTG (60 г глюкозы, 0,4 г сульфата магния гептагидрата, 30 г сульфата аммония, 1 г первичного кислого фосфата калия, 0,01 г сульфата железа (II) гептагидрата, 0,01 г сульфата марганца (II) пентагидрата, 450 мг тиамина гидрохлорида, 450 мкг биотина, 0,15 г DL-метионина, 50 г карбоната кальция на литр дистиллированной воды, рН доводили до 7,5), содержащей 25 мг/л канамицина. Клетки удаляли центрифугированием и 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE. Одновременно электрофорез проводили с промышленно доступным hEGF (PEPRO TECHEC LTD) в качестве стандарта и окрашивали кумасси бриллиантовым синим (СВВ). В результате было показано, что имеется полоса, положение которой соответствовало той же мобильности, что и для стандарта. В супернатанте культуры имелось еще несколько загрязняющих белков.

(4) Определение количества hEGF, продуцированного продуцирующим hEGF штаммом, несущим плазмиду pPSEGF

Супернатант культуры продуцирующего hEGF штамма анализировали на колонке для ВЭЖХ (YMC-AP203Ca300A.C18, размер частиц 5 мкм, диаметр 4,6 мм × длина 250 мм) с использованием в качестве буферов смесей 0,1% ТФУК/24% ацетонитрил, 0,1% ТФУК/44% ацетонитрил, линейный градиент 1%/мин, скорость потока 1,0 мл/мин и детектирование при 280 нм. Количественное определение проводили при сравнении площади полученного пика с площадью пика стандарта hEGF, в результате получали концентрацию, равную примерно 100 мг/л.

(5) Определение биологической активности hEGF, секретированного продуцирующим hEGF штаммом, несущим плазмиду pPSEGF

Определяли активность EGF в супернатанте культуры продуцирующего hEGF штамма. Клетки MCF-7 (A.V.Krishman, Journal of Bone and research, 6, 1099-1107, 1991) помещали в 96-луночный планшет при исходной плотности клеток 1×10⁴ на лунку и в лунки вносили 2-кратные серийные разведения культурального супернатанта продуцирующего EGF штамма. Включение тимидина определяли через 72 ч. Активность составляла 1,4×10⁹ Е/мл, что высчитывали при сравнении данного показателя для стандарта hEGF, равного 10⁷ Е/мл.

(6) Анализ N-концевой аминокислотной последовательности hEGF, секретированного продуцирующим hEGF штаммом, несушим плазмиду pPSEGF

120 мкл супернатанта культуры продуцирующего hEGF штамма наносили на колонку для ВЭЖХ и выделяли с использованием условий, описанных выше для количественного определения ВЭЖХ. Собирали фракцию, соответствующую времени элюирования пика стандарта hEGF. Определение проводили с использованием газофазового аминокислотного секвенатора PPSQ-10 (Shimadzu Co.). Результаты были следующими: Asn - первый остаток; Ser - второй остаток; Asp - третий остаток; Ser - четвертый остаток, начиная соответственно с N-конца. Результаты соответствовали N-концевой аминокислотной последовательности hEGF, представленной в SEQ ID NO: 55.

(7) Определение молекулярной массы hEGF, секретированного продуцирующим hEGF штаммом, несущим плазмиду pPSEGF

120 мкл супернатанта культуры продуцирующего hEGF штамма наносили на колонку для ВЭЖХ и выделяли с использованием условий, описанных в п. (4).

Собирали фракцию, соответствующую пику hEGF. Пробу вновь подвергали ВЭЖХ в тех же условиях для фракционирования, которым подтверждали, что проба выходит одним пиком при ВЭЖХ. Пробу анализировали масс-спектрометрией. Определение проводили с использованием MALDI-TOFMS (масс-спектрометр с лазерной деионизацией) MALDI IV (Shimadzu Co.). Среднее значение двух анализов составляло 6176. Различие данных находилось в пределах ошибки по сравнению с теоретическим значением 6217, которое было высчитано для молекулярной массы hEGF, при допущении того, что в молекуле имеется три S-S-связи. Таким образом, было подтверждено, что hEGF, полученный продуцирующим EGF штаммом, полученным описанным способом, обладает предполагаемой аминокислотной последовательностью и структурой.

Пример 9: Конструирование Corynebacterium glutamicum AJ12036 с повышенной секрецией гетерологичных белков, конструирование штамма с разрывом гена клеточного поверхностного белка (PS2), полученного из AJ12036, и определение продукции гетерологичного белка с использованием данных мутантных штаммов

(1) Получение штамма с разрывом гена клеточного поверхностного белка (PS2) из Corynebacterium glutamicum AJ12036

Устойчивый к стрептомицину (Sm) штамм АJ12036 получали из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, и AJ12036 использовали в качестве хозяина для рекомбинации генов с Corynebacterium glutamicum (патент США №4822738). Corynebacterium glutamicum (ранее Brevibacterium lactofermentum) AJ12036 была помещена на хранение в Национальный институт биологии и Агентство человеческой технологии по промышленной науке и технологии (в настоящее время Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 26 марта 1984 г., под номером FERM ВР-734.

Поскольку было установлено, что штамм AJ12036 в слабой степени секретирует белок клеточной поверхности (PS2) в культуральную среду, было высказано предположение, что эффективность секреции можно дополнительно повысить проведением разрыва гена таким образом, что он станет дефектным по продукции PS2. Следовательно, конструировали полностью дефектный по гену PS2 штамм с использованием гомологичной рекомбинации, как описано ниже.

Праймеры, описанные ниже, синтезировали на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869, полученной методом Саито и Миура [Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)], и ПЦР проводили с комбинацией SEQ ID NO: 56 и 57 и SEQ ID NO: 58 и 59. Последовательность гена PS Corynebacterium glutamicum ATCC13869 была описана в патенте США №5547864, и участок кодирующей области и ее последовательность гена в 5'-направлении представлены в SEQ ID NO: 4.

Перекрестную ПЦР каждого амплифицированного фрагмента и комбинации праймеров с последовательностью SEQ ID NO: 56 и 59 проводили для амплификации фрагмента ΔPS, где промотор и N-концевую область кодирующей области гена PS2 подвергали делеции из гена PS2. Данный фрагмент клонировали в сайт Smal в плазмиде pUC19 для конструирования pUΔPS2. Плазмиду pUΔPS2 расщепляли с помощью KpnI и XbaI для вырезания фрагмента ΔPS2, и конструировали pHSΔРS2 вставкой фрагмента в сайт KpnI-XbaI в плазмиде pHS4 (патент США №5616489), которая представляет собой чувствительный к температуре плазмидный вектор, полученный из рНМ1519. Escherichia coli AJ12570 трансформировали плазмидой pHS4, которая была помещена на хранение в Национальный институт биологии и Агентство человеческой технологии по промышленной науке и технологии (в настоящее время Независимое Административное Агентство, Национальный институт по прогрессу в промышленной науке и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 11 октября 1990 г., под номером FERM BP-3523.

(SEQ ID NO: 56)

5'-act ggg agg cta tct cca tt-3'

(SEQ ID NO: 57)

5'-atc gat ctg ate acg tta ca-3'

(SEQ ID NO: 58)

5'-tgt aac gtg ate aga teg att cac tgg teg аса ccg ttg a-3'

(SEQ ID NO: 59)

5'-acg gaa get ace ttc gag gt-3'

<Отдельный от текста список последовательностей>

SEQ ID NO: 56-SEQ ID NO: 59: праймеры для ПЦР

Плазмиду pHSΔРS2 вставляли в AJ12036 электропорацией и получали штамм с полностью дефектным геном PS2 гомологичной рекомбинацией, описанной в патенте Японии №2763054. Данный штамм обозначали, как штамм YDK010.

(2) Оценка секреторной продукции гетерологичных белков с использованием Corynebacterium glutamicum AJ12036 и штамма с разрывом гена клеточного поверхностного белка (PS2), полученного из AJ12036

Экспрессирующую протрансглютаминазу плазмиду pPKSPTG1, которая была описана в примере 4 (2), вставляли в штаммы AJ12036 и YDK010 для получения трансформантов. Данные трансформанты и контрольный штамм, полученный вставкой плазмиды pPKSPTG1 в Corynebacterium glutamicum ATCC14869 дикого типа, использовали для количественной оценки секреторной продукции.

Аналогичную количественную оценку секреторной продукции проводили для секреторной экспрессирующей SAMP45 плазмиды pVSS1, для секреторной экспрессирующей svPEP плазмиды и секреторной экспрессирующей hEGF плазмиды pPSEGF после получения трансформантов соответственно из штамма AJ12036 и штамма YDK010.

Штаммы, выросшие за ночь на агаровой среде CM2S, содержащей 25 мкг/л канамицина, при 30°С, культивировали в больших пробирках, содержащих 4 мл среды MMTG (глюкоза - 60 г/л; MgSO₄·7H₂O - 1 г/л; MnSO₄·4H₂O - 1 г/л; FeSO₄·7H₂О - 1 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 30 г/л; КН₂PO₄ - 1,5 г/л; VB1·HCl - 450 мкг/л; биотин - 450 мкг/л, DL-Met - 0,15 г/л, рН 7,5) с добавлением 5% СаСО₃ и 25 мкг/мл канамицина в течение 3 суток при 30°С.

Таблица 3 Количество внеклеточно продуцированной протрансглютаминазы мутантными штаммами
Продуцирующий штамм	Протрансглютаминаза
ATCC13869/pPKSPTG1	235 мг/л
AJ12036/pPKSPTG1	680
YDK010/pPKSPTG1	700
Таблица 4 Количество внеклеточно продуцированной SAMP45 мутантными штаммами
Продуцирующий штамм	SAMP45
ATCC13869/pVSS1	9 мг/л
AJ12036/pVSS1	20
YDK010/pVSS1	22
Таблица 5 Количество внеклеточно продуцированной svPEP мутантными штаммами
Продуцирующий штамм	SvPEP
ATCC13869/PVSSSP1	50 мг/л
AJ12036/pVSSSP1	130
YDK010/pVSSSP1	150
Таблица 6 Количество внеклеточно продуцированного hEGF мутантными штаммами
Продуцирующий штамм	SvPEP
ATCC13869/pPSEGF	100 мг/л
AJ12036/pPSEGF	280
YDK010/pPSEGF	290

Как следует из данных таблиц 3-6, имело место значительное повышение продукции SAMP45, svPEP и hEGF при замене хозяина дикого типа на резистентный к стрептомицину штамм AJ12036. Однако при полной делеции гена клеточного поверхностного белка (PS2) из штамма AJ12036 наблюдали только незначительное количественное увеличение секреторной продукции. В данных случаях практически не обнаруживали отрицательного влияния конкурентного ингибирования секреции PS2 на секрецию протрансглютаминазы или hEGF. Однако секрецию PS2 совсем не обнаруживали у штамма полностью дефектного по гену PS2, что вносило свой вклад в снижение содержания нежелательных загрязняющих белков в культуральной среде. Это является преимуществом во время выделения протрансглютаминазы или hEGF.

Пример 10: Факторы культивирования, оказывающие влияние на секрецию протрансглютаминазы

Для установления влияния условий культивирования на секреторную продукцию протрансглютаминазы использовали трансформант, полученный трансформацией Corynebacterium glutamicum штамма YDK010 ранее описанной плазмидой pPKSPTG1.

Штамм, выросший за ночь на агаровой среде CM2S, содержащей 25 мг/л канамицина, при 30°С, высевали в колбы Сакагуши емкостью 500 мл, содержащие 20 мл жидкой среды CM2S, и культивировали в течение ночи при 30°С. Этот материал использовали для посева.

Влияние внесения CaCl₂ оценивали в сосуде S-типа, содержащем жидкую среду MMTG (глюкоза - 60 г/л; MgSO₄·7H₂O - 1 г/л; MnSO₄·4H₂O - 1 г/л; FeSO₄·7H₂O - 1 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 30 г/л; KH₂PO₄ - 1,5 г/л; VB1·HCl - 450 мкг/л; биотин - 450 мкг/л, DL-Met - 0,15 г/л, рН 7,5) в качестве минимальной среды с добавлением 25 мкг/мл канамицина. В колбу вносили 300 мл среды. Количество посевного материала составляло 5% (15 мл), и концентрацию растворенного кислорода контролировали на уровне 3% или ниже. Культивирование проводили при 30°С в течение 3 суток.

После культивирования 10 мкл супернатанта культуры подвергали SDS-PAGE и проводили вестерн-блоттинг с использованием вышеуказанных антител против трансглютаминазы обычным методом. Результаты показывали, что добавление кальция повышало секрецию примерно в 1,3-2 раза в группах с внесением CaCl₂ по сравнению с группами без внесения.

Таблица 7 Влияние ионов кальция на секреторную продукцию протрансглютаминазы
CaCl2 (г/л)	Накопление протрансглютаминазы (мг/л)	Относительное соотношение
0	460	1
0,25	610	1,3
0,5	790	1,7
1,0	810	1.8
2,0	930	2,0

Далее исследовали влияние аэрации и перемешивания с использованием среды MMTG, содержащей 0,2 г/л CaCl₂, в результате было установлено, что лучшие результаты получали при контроле концентрации растворенного кислорода на уровне 3%, что было пределом определения, или ниже (таблица 8).

Таблица 8 Влияние концентрации растворенного кислорода на секреторную продукцию протрансглютаминазы
Концентрация растворенного кислорода	Накопление протрансглютаминазы (мг/л)	Относительное соотношение
Ниже 3%	930	1,43
Контролирование на уровне 3%	810	1,25
Контролирование на уровне 5%	650	1

По настоящему изобретению применимые белки, например гетерологичные белки, такие как трансглютаминаза или человеческий эпидермальный фактор роста, могут быть продуцированы и эффективно секретированы из клеток (секреторная продукция) коринеформными бактериями. Белки, продуцированные способами по настоящему изобретению, секретируются в культуральную среду, что делает возможным легко выделять белки из культуральной среды в больших масштабах с использованием соответствующих известных способов.

1. Способ получения гетерологичного белка, предусматривающий культивирование коринеформной бактерии, содержащей генную экспрессирующую конструкцию, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид белка клеточной поверхности, полученного из Corynebacterium glutamicum или Corynebacterium ammoniagenes, соединена в прямом направлении с последовательностью промотора, который функционирует в коринеформной бактерии, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гетерологичный белок, связана в прямом направлении с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный сигнальный пептид, причем коринеформная бактерия представляет собой Corynebacterium glutamicum AJ 12036 (FERM ВР-734) или ее мутант, не продуцирующие белок клеточной поверхности, что обеспечивает продукцию указанной коринеформной бактерией указанного гетерологичного белка и выделение указанного продуцированного гетерологичного белка.

2. Способ по п.1, согласно которому сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

3. Способ по п.1, согласно которому сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

4. Способ по п.1, в котором сигнальный пептид имеет последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну замену, делецию, добавление, вставку аминокислоты или их комбинацию в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 3.

5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому культивирование мутантной коринеформной бактерии проводят в среде, содержащей 2,25 мМ или более ионов кальция.

6. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому культивирование мутантной коринеформной бактерии проводят, поддерживая концентрацию растворенного кислорода на уровне 3% или ниже.