Способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения винограда in vitro. Проводят микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с уменьшенным количеством макроэлементов и витаминов с добавлением в ее состав индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и препарата эмистим в концентрации 10^-7-10^-10 %. Изобретение позволяет эффективно размножить перспективные сорта винограда, оздоровленные от вирусной инфекции. 6 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения оздоровленных от вирусной инфекции перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Известен способ клонального микроразмножения растений, включающий введение в питательную среду цитокининов, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам [Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. Ялта, 1986, с.25-29]. Способ осуществления этого направления связан с пролиферацией пазушных почек и побегов.

К недостатку этого способа клонального микроразмножения следует отнести большую трудоемкость процесса, так как необходима частая пересадка эксплантов; слабую их укореняемость; возможность образования каллуса на базальной части агрегата почек и побегов, что может привести к нарушению генетической стабильности размножаемых растений.

Известен способ микроклонального размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8-10 междоузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом и высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга [Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа. Рекомендации. М.,1992, с.12-13] - прототип.

Недостаток этого способа заключается в том, что при клональном микроразмножении на начальном этапе, после микрочеренкования, растения растут медленно, что ограничивает эффективность метода. Одной из причин медленного роста являются стрессовые условия, в которых оказываются микрочеренки in vitro. Наблюдается ингибирование ростовых процессов эксплантов токсическими веществами, выделяемыми ими в питательную среду. Грибные патогены также отрицательно влияют на развитие растений и могут способствовать их гибели. При многократных повторных субкультивированиях состояние их ухудшается, снижается выход микрочеренков, что ограничивает эффективность метода. Необходим способ оптимизации этого процесса. Новый класс фиторегуляторов - адаптогенов способствует активации и многоцелевой стимуляции защитных реакций растений. К ним относится препарат эмистим, который представляет собой композицию ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы, продукты метаболизма симбиотического гриба Acremonium lichenicola, выделенного из корней женьшеня. Он положительно влияет на процессы роста и развития растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов внешней среды.

Все это создает предпосылки для использования его в технологии in vitro для преодоления высказанных нами ранее трудностей.

Целью изобретения является повышение эффективности клонального микроразмножения растений винограда, оздоровленных от вирусной инфекции методом апикальных меристем, на этапе микрочеренкования побегов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе микроклонального размножения винограда in vitro, включающем микрочеренкование пробирочных растений с 8-10 междоузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с глазком и листом и высадку их в пробирки на питательную среду Мурасиге Скуга, посадку и культивирование их осуществляют на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным количеством макроэлементов и витаминов: NH₄NO₃ - 130-140 мг/л, KNO_з - 920-950 мг/л, MgSO₄·7H₂O - 180-191 мг/л, CaCl₂·2Н₂O - 290-300 мг/л, КН₂PO₄ - 65-70 мг/л; мезоинозита 48-50 мг/л, тиамина - 0,20-0,22 мг/л, индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л с добавлением в ее состав препарата эмистим в концентрации 10^-7-10^-10%.

Новым в предложенном способе является то, что микрочеренки пробирочных растений высаживают на жидкую модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты.·

Существенным является то, что содержание макросолей уменьшено следующим образом: NH₄NO₃ с 1650 до 138 мг/л, KNO₃ с 1900 до 950 мг/л, MgSO₄·7H₂O с 370 до 185 мг/л, CaCl₂·2H₂O с 440 до 296 мг/л, КН₂PO₄ с 444 до 68 мг/л; содержание мезоинозита со 100 мг/л до 50 мг/л, тиамина с 0,5 до 0,2 мг/л, исключена из состава витаминов никотиновая кислота, индолилуксусная кислота в количестве 0,1-0,3 мг/л с добавлением в состав питательной среды препарата эмистим в концентрации 10^-7-10^-10%.

Эмистим оказывает двоякое действие на микрочеренки: способствует индукции ризогенеза и, кроме этого, оказывает влияние на конус нарастания почек глазка, способствуя делению клеток и вытягиванию в длину клеток всех тканей. То есть в данном случае воздействие эмистима и направлено на микрочеренок с целью регенерации из него растения и осуществляется одновременно на тканевом и организменном уровне.

В результате его применения происходит оптимизация метаболических процессов, усиливаются функции иммунитета у растений, активизируются защитные механизмы растений против многих патогенов. Гиббереллиновая и цитокининовая активность препарата положительно влияет на процессы роста растений. Таким образом, препарат эмистим является препаратом широкого спектра действия.

Замена твердой питательной среды (агаризированной) на жидкую питательную среду, уменьшение в ее составе количества макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты обеспечивает улучшение приживаемости микрочеренков, соотношения между развитием у растений ризогенной зоны и надземной части, образование большего числа листьев, а также лучшее развитие растений после субкультивирования, то есть снимается торможение ростовых процессов, которое наблюдается при высоких концентрациях. Кроме этого, за счет замены агара жидкой питательной средой и уменьшения количества реактивов происходит удешевление процесса клонального микроразмножения растений винограда.

Таким образом, налицо неоднозначность предлагаемого приема

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Растения должны иметь 8-10 междоузлий. Затем приступают к приготовлению жидкой питательной среды Мурасиге и Скуга следующего состава, мг/л: макроэлементы - аммоний азотнокислый - NH₄NO₃ - 138, калий азотнокислый - KNO₃ - 950, магний сернокислый 7-водный - MgSO₄·7Н₂O - 185, калий фосфорнокислый однозамещенный - КН₂PO₄ - 68, кальций хлористый 2-водный - CaCl₂·2H₂O - 296; микроэлементы - борная кислота - Н₃ВО₃ - 6.2, марганец сернокислый 4-водный - MnSO₄·4H₂O - 22.3; медь сернокислая 5-водная - CuSO₄·5Н₂О - 0.025, кобальт хлористый 6-водный - CoCl₂·6Н₂О - 0.025; цинк сернокислый 4-водный - ZnSO₄·4Н₂О - 8.6, натрий молибденовокислый 2-водный - Na₂MoO₄·2H₂O - 0.25, калий иодистый - KJ - 0.86; хелат железа: железо сернокислое 7-водное - FeSO₄·7H₂O - 27.8, трилон-Б - Na₂ЭДТА - 37.3; витамины - мезоинозит - 50, тиамин HCl - 0,2; ИУК - 0,1-3 мг/л; рН среды перед автоклавированием 5,7-5,9. В состав питательной среды добавляют эмистим в концентрации 10^-7-10^-11%, которая определена ранее опытным путем для каждого размножаемого сорта.

Изготавливают мостики из фильтровальной бумаги, помещают их в пробирки, разливают в них приготовленную питательную среду, закрывают фольгой, штатив с пробирками закрывают целлофаном, обвязывают шпагатом и автоклавируют в автоклаве ГК-100-3.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе "Фотран". Побеги, имеющие 8-10 междоузлий, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка 10-12 мм, 2 мм над глазком, остальные под глазком. Полученные микрочеренки высаживают в пробирки на мостики из фильтровальной бумаги, которые погружены в жидкую питательную среду. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25-27±2°С, влажности воздуха 70-75%.

Наблюдения за ростом растений осуществляют через 15 дней.

Результаты развития пробирочных растений винограда на 50-й день культивирования на питательных средах с различным содержанием ИУК и эмистима представлены в табл.1.

Таблица 1 Состояние пробирочных растений винограда сорта Рупестрис дю Ло на питательных средах различного состава
Варианты	Корни	Побеги	Коэффициент полярности	Выход растений, %
питательная среда	ИУК, мг/л	эмистим, %	число, шт	длина, мм	ризогенная зона, мм	длина, мм	число листьев, шт
Мурасиге и Скуга (прототип)	0	-	0,6	12,2	7,3	21,0	3,0	0,9	53,5
	0,1	-	1,0	18,2	18,2	24,9	4,2	1,3	67,8
0,3	-	0,9	24,1	21,6	29,3	4,0	0,7	78,6
Мурасиге и Скуга (техн. решение без эмистима)	0	-	1,3	47,6	61,8	52,0	5,4	1,8	89,2
	0,1	-	3,2	40,2	128,6	74,7	4,8	1,7	96,4
0,3	-	5,3	28,4	150,5	75,1	4,8	2,0	96,2
Мурасиге и Скуга (заявл. техн. решен. с эмистимом)	0,3	0	3,1	54,0	168,0	85,7	5,2	2,0	89,4
	0,3	10-10	3,4	71,8	246,4	110,0	5,7	2,2	100,0
	0,3	10-9	4,6	55,9	258,4	91,1	5,5	2,8	92,8
	0,3	10-8	4,7	50,1	237,8	85,3	4,8	2,8	89,8
0,3	10-6	5,4	49,0	266,5	63,7	5,0	4,2	82,1

Как следует из приведенных данных, на питательной среде Мурасиге и Скуга (прототип) образование корней и их рост, образование побегов и листьев происходило намного слабее, чем на модифицированной питательной среде (техническое решение без эмистима).

ИУК в концентрации 0,3 мг/л на этой питательной среде до 50-го дня культивирования не оказывал отрицательного влияния на растения. Позже (на 64-й день культивирования) отмечено угнетение образования и роста корней и, как следствие этого, уменьшение величины ризогенной зоны, а также снизилось число образовавшихся листьев и коэффициент полярности, то есть нарушилось оптимальное соотношение между развитием корней и побегов.

Таблица 2 Скорость роста пробирочных растений винограда сорта Рупестрис дю Ло на питательных средах различного состава
Варианты	Скорость роста мм/день на день культивирования
питательная среда	ИУК, мг/л	эмистим, %	ризогенной зоны	растений
17	31	49	64	17	31	49	64
Мурасиге и Скуга (прототип)	0	-	-	0,05	0,1	0,5	0,2	0,3	0,4	0,6
	0,1	-	0,03	0,01	0,1	0,9	0,4	0,4	0,5	0,7
0,3	-	0,03	0,06	0	0,7	0,3	0,4	0,6	0,7
Мурасиге и Скуга (техн. решен. без эмистима)	0	-	0,7	1,3	1,2	2,0	0,3	0,5	1,0	1,1
	0,1	-	0,02	1,6	2,6	2,9	0,4	0,8	1,5	1,7
0,3	-	0,05	2,1	3,0	2,8	0,1	0,6	1,5	1,8
Мурасиге и Скуга (заявл. техн. решен. с эмистимом)	0,3	0	0,1	3,3	3,4	-	0,4	1,6	1,7	-
	0,3	10-10	2,3	4,0	5,0	-	0,4	1,8	2,2	-
	0,3	10-9	1,0	4,0	5,3	-	0,5	1,4	1,9	-
	0,3	10-8	1,5	3,3	4,8	-	0,4	1,2	1,7	-
0,3	10-6	2,1	2,1	5,4	-	0,5	1,2	1,3	-

На питательной среде Мурасиге и Скуга (техническое решение без эмистима) улучшились все показатели развития растений: число корней увеличилось в 2,1-5,8 раз, их длина в 1,1-3,9 раза, величина ризогенной зоны в 7,0-8,4 раза, в 2,2-3,0 увеличилось высота растений и несколько увеличилась образование листьев.

При применении ИУК в концентрации 0,1-0,3 мг/л существенной разницы в развитии растений не отмечено. Длина корней уменьшилась, но число их увеличилось, что не оказало отрицательного влияния на величину ризогенной зоны и на процесс стеблеобразования. Таким образом, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным количеством макроэлементов и витаминов возможно применение ИУК в концентрации 0,1-0,3 мг/л.

При применении эмистима продолжалось улучшение всех показателей развития растений, установилось оптимальное соотношение между развитием корней и побегов (коэффициент полярности = 2,2-2,8), что обеспечило при оптимальных концентрациях препарата (10^-9-10^-10%) выход растений 92,8-100,0%.

Кроме этого, эмистим оказал влияние на скорость роста ризогенной зоны и побегов (табл.2). Показатели скорости роста при добавлении эмистима в питательную среду уже на 49 день культивирования превосходили почти в 2 раз показатели роста пробирочных растений на питательных средах без эмистима на 64 день культивирования. То есть происходит ускорение процесса клонального микроразмножения более чем на две недели и, как следствие, повышение его эффективности.

Стимулирование развития корней и побегов отмечено у всех сортов и подвоев, но концентрации, обеспечивающие стимулирование, были различными для каждого сорта (табл.3). Так у сорта Дружба, подвоев Кобер5ББ, 1615-2 лучшее развитие растений произошло при разведении эмистима 10^-7-10^-8 мл/л, у сорта Цветочный при разведении 10^-10.

При добавлении эмистима в питательную среду у сорта Рупестрис дю Ло (табл.3) происходит увеличение числа корней, причем более значительное, чем меньше разведение препарата. Влияние эмистима на длину корней менее значительное. Увеличение числа корней и их длины сказалось на величине ризогенной зоны во всех вариантах опыта. При разведении 10^-10 она составила 246,4 мм, а при разведении 10^-7- 266,5 мм.

Под воздействием эмистима произошли изменения и в надземной части пробирочных растений. Увеличение высоты растений отмечено при концентрации препарата 10^-10 и 10^-9%. При концентрации эмистима 10^-7% произошло торможение роста растений, что связано с чрезмерным развитием корневой системы. Аналогичные изменения произошли и с образованием листьев, большее их число отмечено при разведении эмистима 10^-10 и 10^-9.

Таким образом, по длине корней, высоте растений и образованию листьев выделился вариант с добавлением в питательную среду препарата эмистим в разведении 10^-10.

Таблица 3 Развитие пробирочных растений различных сортов винограда при различных концентрациях эмистима
Варианты	Выход растений, шт.	Корни	Побеги
число, штук	длина, мм	ризогенная зона, мм	длина, мм	число листьев, шт
Кобер 5ББ
Контроль	89,2	9,8	18,4	180,3	73,5	6,6
Эмистим 10-9	75,0	8,9	18,8	167,3	81,9	7,1
Эмистим 10-8	78,6	8,7	23,5	204,4	87,8	8,1
Эмистим 10-7	71,4	7,9	19,1	150,8	59,4	6,2
Эмистим 10-6	64,2	5,6	19,3	108,0	55,3	5,8
1615-2
Контроль	82,1	3,8	11,7	44,4	65,1	1,4
Эмистим 10-9	96,4	2,8	21,8	61,0	58,6	1,1
Эмистим 10-8	85,7	2,3	17,0	55,3	60,9	1,7
Эмистим 10-7	85,7	4,0	14,4	57,6	65,8	1,9
Эмистим 10-6	100,0	1,8	18,4	33,1	48,6	0,9
Дружба
Контроль	50,0	2,2	27,3	60,0	13,2	1,4
Эмистим 10-9	60,7	2,2	35,4	77,8	-	-
Эмистим 10-8	60,7	3,2	23,4	74,9	23,9	1,7
Эмистим 10-7	67,8	2,8	26,4	73,9	18,5	1,9
Эмистим 10-6	75,0	0,9	8,6	7,7	2,5	0,9
Цветочный
Контроль	92,8	4,0	21,0	84,0	29,5	3,1
Эмистим 10-10	100,0	3,6	25,1	90,3	33,8	3,4
Эмистим 10-8	85,7	4,85	14,5	69,6	23,3	2,5
Эмистим 10-6	92,8	2,8	12,8	35,8	15,0	1,8
Рупестрис дю Ло
Контроль	89,4	3,1	54,0	168,0	85,7	5,2
Эмистим 10-10	100,0	3,4	71,8	246,4	110,0	5,7
Эмистим 10-9	92,8	4,6	55,9	258,4	91,1	5,5
Эмистим 10-8	89,2	4,7	50,1	237,8	85,3	4,8
Эмистим 10-6	82,1	5,4	49,0	266,5	63,3	5,0
Каберне северный
Контроль	25,0	3,7	7,6	37,2	26,0	3,3
Эмистим 10-10	67,8	7,6	14,9	113,2	44,7	3,1
Эмистим 10-9	67,8	6,4	15,8	100,2	33,4	3,0
Эмистим 10-8	67,8	5,2	16,8	87,3	36,3	3,0
Эмистим 10-7	75,0	3.8	17,9	68,0	32,2	2,7

Аналогичные результаты получены при культивировании на питательной среде с эмистимом сорта Каберне северный. Увеличение числа корней, их длины, величины ризогенной зоны отмечено во всех вариантах с эмистимом, но наиболее значительное увеличение этих показателей произошло при разведении 10^-10%. В этом варианте также отмечены более высокие показатели роста растений и образования листьев.

Следует отметить, что у обоих сортов винограда при концентрации эмистима 10^-7% отмечалось торможение роста растений и образования листьев, что отрицательно влияет на коэффициент размножения этих сортов.

Наблюдение за ходом развития пробирочных растений сорта Рупестрис дю Ло (табл.4) показало, что в варианте с эмистимом 10^-10%произошло самое незначительное в опыте, причем с начала культивирования, отставание в росте корней и побегов. В контроле и других вариантах с эмистимом наблюдалось как отсутствие роста корней, так и отсутствие роста побегов до 49-го дня культивирования. В связи с этим выход растений в этих вариантах был 82,1-92,8%, а в варианте с эмистимом 10^-10-100%.

Таблица 4 Ход развития пробирочных растений винограда при добавлении эмистима в питательную среду
Варианты	Отсутствие роста	Выход растений, %
	корней, штук на день		побегов, штук на день
15	34	49	63	15	34	49	-
Рупестрис дю Ло
Контроль	5	3	2	-	15	34	49	-	89,4
Эмистим 10-10	3	1	-	-	5	5	-	-	100,0
Эмистим 10-9	6	2	2	-	6	2	2	-	92,8
Эмистим 10-8	10	3	2	-	9	2	2	-	89,2
Эмистим 10-7	13	6	3	-	8	3	3	-	82,1
Каберне северный
Контроль	25	22	22	21	24	23	21		25,0
Эмистим 10-10	12	5	8	7	27	15	11	9	67,8
Эмистим 10-9	15	8	10	7	26	15	13	8	67,8
Эмистим 10-8	13	8	8	6	28	15	10	7	75,0
Эмистим 10-7	14	15	11	12	26	17	13	14	50,0

У сорта Каберне северный под влиянием эмистима также улучшилось образование и рост корней и побегов, а выход растений по сравнению с контролем увеличился в 2-3 раза.

Анализ применения эмистима при микрочеренковании сортов винограда показал, что препарат эмистим способствует повышению эффективности клонального микроразмножения оздоровленных растений. Это происходит за счет улучшения приживаемости микрочеренков, более быстрого образования и роста корней, побегов и листьев, что обеспечивает, как мы отмечали выше, ускорение процесса клонального микроразмножения более чем на две недели и, как следствие, повышение его эффективности.

Добавление препарата эмистим в питательную среду на этапе микрочеренкования, помимо вышеизложенного, способствует улучшению процесса адаптации растений к нестерильным условиям, благодаря чему при высадке пробирочных растений в торфоперегнойные горшочки практически отсутствует их гибель, и выход растений составляет 99,0-100%.

Большое значение имеет правильно подобранная концентрация препарата, так как помимо стимулирующего эффекта может наблюдаться и ингибирование, чрезмерное развитие ризогенной зоны, тормозящее развитие побегов и образование листьев, что ведет к снижению коэффициента размножения.

Таблица 5 Влияние препарата эмистим на эффективность клонального микроразмножения оздоровленных растений винограда
Показатели	Заявленное техническое решение	Прототип
Рупестрис дю Ло
Число корней, штук	3,4	0,3
Длина корней, мм	71,8	2,3
Величина ризогенной зоны, мм	246,4	20,8
Высота растений, мм	110,0	49,6
Число листьев, штук	5,7	4,0
Выход растений, %	100,0	78,6
Каберне северный
Число корней, штук	8,3	4,6
Длина корней, мм	22,0	16,6
Величина ризогенной зоны, мм	182,6	76,3
Высота растений, мм	92,0	51,0
Число листьев, шт	6,9	5,0
Выход растений, %	67,8	25,0

Технико-экономическое обоснование

Заявленное техническое решение способствует усилению функций иммунитета размножаемых растений, активации их защитных механизмов их против многих патогенов, улучшению приживаемости микрочеренков.

При уменьшении концентраций макросолей и витаминов в составе питательной среды улучшаются показатели развития растений, что способствует улучшению выхода (до 99-100%) и качества адаптированных растений и, в конечном итоге, ускорению процесса закладки базисных маточников для перевода виноградарства на сертифицированную основу.

Способ микроклонального размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов, отличающийся тем, что посадку и культивирование осуществляют на жидкой питательной среде с добавлением индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и эмистима в концентрации 10^-7-10^-10 %.