Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. pkkk (п) 679d-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену yersinia enterocolitica о3 и о9 сероваров

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии, и может быть использовано при создании диагностических тест-систем для идентификации штаммов Y.enterocolitica О3 и О9 сероваров в целях лабораторной диагностики в здравоохранении, ветеринарии и для проведения научных исследований. Штамм гибридомы получен в результате слияния мышиной плазмоцитомы Sp2/0-Ag.8 и В-лимфоцитов селезенки мыши инбредной линии BALB/c, иммунизированной белково-полисахаридным комплексом Y.enterocolitica. Гибридома продуцирует моноклональные антитела изотипа IgG к Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров, используемые в составе ИФА-тест-системы для идентификации указанных сероваров, наиболее часто выделяемых на европейской территории от больных людей, сельскохозяйственных животных и из объектов внешней среды. Использование моноклональных антител, продуцируемых гибридомой по изобретению, позволяет идентифицировать штаммы Y.enterocolitica указанных сероваров, представляющих наибольшую эпидемическую опасность среди других кишечноперсиниозных бактерий. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и представляет собой штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РККК (П) 679D, продуцирующий в культуральных средах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКА) к возбудителю кишечного иерсиниоза Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров, и может быть использовано при создании диагностических тест-систем для идентификации штаммов Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров в целях лабораторной диагностики в здравоохранении, ветеринарии и для проведения научных исследований.

Кишечный иерсиниоз характеризуется полиморфизмом клинических проявлений, в результате чего постановка клинического диагноза весьма затруднена. Из-за длительности выделения возбудителя снижена эффективность и бактериологических методов исследования, особенно при остром течении заболевания. Для экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза наиболее целесообразно применение иммунологических методов идентификации возбудителя с использованием тест-систем на основе МКА, имеющих ряд преимуществ перед поликлональными диагностическими сыворотками.

Большинство эпидемически опасных циркулирующих в природе на европейской территории штаммов Y.enterocolitica относится к O3 и O9 сероварам /1/.

Известны штаммы гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к Y.enterocolitica O9 серовара /2/, на основе которых сконструированы иммунофлуоресцентные диагностические тест-системы, предназначенные для идентификации штаммов Y.enterocolitica O9 серовара.

Иммуноглобулиновые кишечноиерсиниозные диагностические препараты, предназначенные для идентификации обоих сероваров, как поликлональные, так и моноклональные в настоящее время отсутствуют.

Задача изобретения - получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных антител к белково-полисахаридному антигену Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров, используемых для идентификации штаммов Y.enterocolitica указанных сероваров.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния мышиной плазмоцитомы Sp2/0-Ag.8 и В-лимфоцитов селезенки мыши инбредной линии BALB/c, иммунизированной белково-полисахаридным комплексом (БПК), выделенным из биомассы бактерий Y.enterocolitica 908 O3 серовара уксуснокислым гидролизом по Р.В.White |3| в модификации Е.Э.Бахрах с соавт. /4/ в присутствии 0,1 н уксусной кислоты 1 ч при 100°С, при использовании в качестве сливающего агента 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (Merck) с молекулярной массой (м.м.) 4000 кДа и последующего клонирования и реклонирования методом предельных разведений получена габридома Y.ent. O3.O9.C10, продуцирующая МКА к Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров. Экспериментальная иммуноферментная тест-система на основе указанных МКА позволяет идентифицировать штаммы Y.enterocolitica двух сероваров. Разрешающая способность тест-системы составляет (3,7·10⁴-6,2·10⁴) м.к./мл чистой культуры в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА), (6,2·10⁴-1,2·10⁵) м.к./мл в дот-иммуноанализе (ДИА).

Штамм гибридомы получают путем слияния миеломных клеток со спленоцитами мыши, иммунизированной БПК. В первый день иммунизации вводят внутрибрюшинно 25 мкг БПК, разведенного в 0,25 мл физиологического раствора, с добавлением 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), на 14, 28, 42 сутки вводят БПК в дозе 50 мкг без ПАФ. Через 3 суток после последней иммунизации извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1·10⁷ спленоцитов мыши с 3·10⁶ клетками миеломной линии в присутствии 1 мл ПЭГ 4000 в течение 1 мин.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой фидерных клеток (лимфоцитов), выделенных из селезенки мыши аутбредной линии. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (ГАТ). Через 21 сутки клетки культивируют на среде ГТ без аминоптерина. В последующем культивирование проводят на среде RPMI-1640, не содержащей селективных компонентов. 2-кратное клонирование проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое фидерных клеток. Выход позитивных клонов 100%.

Для скрининга антителопродуцирующих клонов гибридом использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты и клетки типовых 34 сероваров Y.enterocolitica и других микроорганизмов. Отобран клон (Y.ent. O3.O9.C10), продуцирующий МКА к антигенам Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 679D.

Заявляемый штамм гибридом обладает следующими характеристиками:

1. Кариологическая характеристика.

Модальный класс для родительской миеломной линии Sp2/0-Ag.8 - 72 хромосомы.

2. Морфологическая характеристика.

Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток, отличающихся от исходной миеломной клетки меньшими размерами.

3. Культуральные свойства.

Культивирование штамма гибридомы ведут при температуре (37,0±0,1)°С в атмосфере, содержащей (5,0±0,1) % углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640 (Flow Laboratories), содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2% L-глутамина, 2% Hepes, 10% МаНСОз, 1% пенициллина (5000 IU/ml) /стрептомицина (5000 мкг/мл). Клетки поддерживают в стационарной фазе роста в пластиковых флаконах (Costar), в 96-12 луночных планшетах.

Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2. Посевная концентрация клеток составляет 2·10⁵-3·10⁵ в 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при пассировании in vitro в течение 5 месяцев (срок наблюдения).

4. Культивирование гибридомы в организме животного.

Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 1,5·10⁶ на одну мышь. За 10 суток до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14 - тетраметиленпентадекана (пристана). Иммуноасцитическая жидкость образуется на 10-12 сутки в объеме 5-7 мл. Перевиваемость 100%. Гибридный клон сохраняет способность продукции антител на одном уровне при перевивании клеток на животных (in vivo) на протяжении 6 пассажей (срок наблюдения).

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования - 3.

5. Контаминация штамма.

Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.

6. Биотехнологическая характеристика полезного продукта.

Штамм продуцирует моноклональные антитела класса IgG. Они специфичны к микробным клеткам штаммов Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров.

Средний геометрический титр МКА в ИФА в культуральной жидкости (КЖ) составляет 1:80 ^x/:2, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) - 1:102400 ^x/:2. Концентрация МКА в КЖ составляет (28±2) мкг/мл, в ИАЖ - (7±2) мг/мл. Титр МКА, выделенных из ИАЖ, составляет 1:512000 ^x/:2.

Специфичность МКА проверяют в ТИФА с цельными клетками гетерогенных микроорганизмов: Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, Y.pestis, E.coli, Shigella sp., Salmonella sp., Br.abortus, Fr.tularensis.

Результаты исследования представлены в табл.1. Оценку результатов производят визуально.

Данные таблицы показывают, что МКА штамма РККК (П) 679D специфически взаимодействуют в ИФА с бактериальными клетками Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров и не взаимодействуют с другими микроорганизмами.

7. Иммунохимическая характеристика полезного продукта.

Методом иммуноблоттинга установлено, что МКА, продуцируемые штаммом РККК (П) 679Д, взаимодействуют с белково-полисахаридным антигеном (гликопротеином) Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров м.м. (16±2) кДа.

8. Способ криоконсервации.

Среда криоконсервирования содержит 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% криопротектора - диметилсульфоксида (ДМСО) (Serva).

Режим замораживания и отогрева. Клетки в количестве 2·10⁶-3·10⁶ в среде для криоконсервирования разливают в пластиковые ампулы по 1 см³ и помещают на 3 часа в пары жидкого азота (минус 120°С), скорость замораживания при этом составляет ˜1° в мин, после чего пробирки опускают в жидкий азот (минус 196°С). Клетки замораживают на 3-5 пассаже in vivo. Восстановление клеток после размораживания: быстрое размораживание в водяной бане при 37°С до полного оттаивания, клетки разводят в 10 мл среды RPMI-1640 с 1 мл лошадиной сыворотки и осаждают центрифугированием при 150 g 10 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования составляет (70±5)%.

Пример 1. Использование штамма РККК (П) 679D.

Штамм РККК (П) 679Д выращивают in vitro до конечной концентрации 1·10⁶-1,5·10⁶ кл в 1 мл среды. Клетки осаждают центрифугированием при 150 g 10 мин и вводят внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, предварительно обработанных пристаном, по 1,5·10⁶ клеток в объеме 0,5 мл. После формирования асцитной опухоли осуществляют забор иммуноасцитической жидкости. Клетки осаждают из ИАЖ центрифугированием при 150 g 10 мин и используют для последующего пассажа in vitro и in vivo.

Супернатант, содержащий МКА, используют в ИФА для идентификации штаммов Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров, либо применяют в качестве полуфабриката для выделения моноклональных антител путем двукратного осаждения раствором сульфата аммония 45% и 40% насыщения, более пригодных для длительного хранения при температуре минус 20°С, не теряя специфической активности в течение 2 лет (срок наблюдения), которые могут использоваться при разработке иммуноглобулиновых препаратов и тест-систем для лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза.

Пример 2. Использование продукта штамма.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного планшета отечественного производства вносят по 100 мкл взвеси выделенной чистой культуры Y.enterocolitica в концентрации 1·10⁹ м.к./мл, приготовленной в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2, и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 ч, либо выдерживают при 4°С в течение 18-20 ч. Затем в каждую лунку вносят по 150 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), рН 7,2, и инкубируют при температуре 37°С 30 мин. Лунки трижды отмывают PBS по 200 мкл. Во все лунки планшета вносят МКА (или иммуноасцитическую жидкость), продуцируемые штаммом гибридомы РККК (П) 679Д, в установленном рабочем разведении в объеме 100 мкл и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После этого лунки планшета трижды отмывают PBS и в каждую лунку вносят антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) в рабочем разведении. Планшет выдерживают при температуре 37°С 1 ч, затем лунки планшета отмывают 6 раз PBS. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора хромогена (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонат]а (ABTS)) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Реакцию оценивают визуально по появлению зеленого окрашивания продуктов распада Н₂О₂ в присутствии хромогена. При необходимости реакцию останавливают добавлением в лунки 3 М NaOH. Положительная реакция свидетельствует о принадлежности идентифицируемого штамма к O3 либо к O9 серовару Y.enterocolitica.

Отличительная особенность заявляемого штамма гибридомы заключается в том, что он продуцирует моноклональные антитела как к O9, так и к O3 сероварам Y.enterocolitica.

На основе МКА была сконструирована экспериментальная диагностическая иммуноферментная тест-система, апробированная на 55 штаммах Y.enterocolitica Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (г. Саратов). Результаты исследований подтвердили высокую специфичность сконструированной тест-системы (табл.1).

Таким образом, штамм гибридных культивируемых клеток мыши продуцирует моноклональные антитела к белково-полисахаридному антигену Y.enterocolitica O3 и O9 сероваров, позволяющие идентифицировать штаммы Y.enterocolitica указанных сероваров, наиболее часто выделяемых на европейской территории от больных людей, сельскохозяйственных животных и из объектов внешней среды и представляющих наибольшую эпидемическую опасность среди циркулирующих в природе кишечноиерсиниозных бактерий.

Источники информации

1. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез (Пособие для врачей). - Санкт-Петербург. - 1992. - 58 с.

2. Алексеева Л.П., Матяш Е.В., Чемисова О.С., Смоликова Л.М. Моноклональные антитела к Yersinia enterocolitica O9 и их диагностическое значение // Диагностика, лечение и профилактика инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Мат. юбилейной научн. конф., посв. 50-летию Центра военно-технич. проблем биологич. защиты НИИ микробиологии МО РФ (30 апр. - 1 июня 1999 г.). - Екатеринбург, 1999. - С.5-6.

3. White P.В. Observation on the polisaccharide complex and variants of Vibrio cholerae // Brit. J. exp. Pathol. - 1936. - V.17. - P.229-234.

4. Бахрах Е.Э., Коробкова Е.И., Павлова Л.П. Полисахаридсодержащая фракция чумного микроба как аллерген для выявления активного иммунитета у морских свинок // Тр. Ин-та "Микроб". - Саратов, 1960. - Вып.4. - С.63-65.

Таблица 1
Взаимодействие МКА штамма РККК (П) 679D в ТИФА со штаммами бактерий
Виды микроорганизмов	Количество штаммов	Специфическое взаимодействие МКА штамма гибридомы РККК (П) 679Д
Y.enterocolitica O3 серовара	11	+
Y.enterocolitica O9 серовара	10	+
Y.enterocolitica других сероваров (с O1, 2а, 3 по O34)	34	-
Другие микроорганизмы	42	-
(Y.pseudotuberculosis, Y.pestis, E.coli, Shigella sp., Salmonella sp., Br.abortus, Fr.tularensis)
Примечание: + - наличие реакции - - отсутствие реакции

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.-продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica O3 и O9 сероваров, депонированный в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК(П) 679D.