Способ лечения диабета

Предложено: способ лечения диабета, преддиабетического состояния или непереносимости глюкозы. Изобретение отличается тем, что пациенту вводят сульфатид, содержащий 14-18 углеродных атомов в цепи жирной кислоты, причем указанный сульфатид воздействует на метаболизм сульфатида таким образом, что приводит к повышению количества сульфатида и к повышению сохранности резерва инсулина в островках Лангерганса. 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к новым фармацевтическим препаратам и способам лечения диабета, в частности диабета типа 2.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Диабет является очень распространенным заболеванием, при котором организм не вырабатывает инсулин, или вырабатывает недостаточное количество инсулина, или не использует должным образом инсулин. Встречаются два основных типа диабета: диабет типа 1, или инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM), при котором организм не вырабатывает инсулин, наиболее часто встречающийся у детей и подростков, такой диабет рассматривают как аутоиммунное заболевание; а также диабет типа 2, или инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), наиболее распространенная форма заболевания, которая представляет собой нарушение метаболизма, являющее следствием неспособности организма вырабатывать достаточное количество инсулина или использовать инсулин должным образом. Диабет типа 2 составляет приблизительно 90% всех случаев заболевания диабетом. Диабет типа 2 является широко распространенным расстройством, которому подвержено 2-10% населения стран Запада. Причины, вызывающие диабет типа 2, полностью неизвестны, однако, по-видимому, определенную роль играют как генетические факторы, так и факторы, связанные с состоянием окружающей среды, например такие факторы, как ожирение и отсутствие физической нагрузки. Также существует форма диабета, которая может развиться у женщин во время беременности - диабет беременных, и форма аутоиммунного диабета, которая начинается в период полового созревания, которую называют LADA (латентный аутоиммунный диабет у взрослых) или медленно прогрессирующий аутоиммунный диабет.

Диабет типа 1, как правило, лечат инсулином. Другие возможные пути лечения, в частности, диабета типа 1 описаны, например, в публикации WO 92/19633, которая относится к применению сульфатированных гликолипидов, в публикации WO 97/42974, которая относится к применению гликолипидных комплексов, и в публикации WO 99/33475, которая относится к применению галактозилцерамида, глюкозилцерамида и лактозилцерамида.

Также исследовали трансплантацию поджелудочной железы или продуцирующих инсулин панкреатических клеток.

Диабет типа 2 обычно сначала лечат специальной диетой, а если этого недостаточно, то затем, как правило, лечат одним из трех различных типов лекарственных средств; либо лекарственным средством, которое стимулирует высвобождение инсулина из поджелудочной железы, либо лекарственным средством, которое повышает чувствительность пациента к инсулину, либо лекарственным средством, которое непосредственно воздействует на уровень глюкозы в крови (таким, как лекарственные средства, снижающие продуцирование глюкозы печенью, или лекарственные средства, повышающие утилизацию глюкозы в мышцах). Эти лекарственные средства также могут быть использованы в сочетании с различными диетами. Во многих случаях также используют инсулин.

Ни одна из современных стратегий лечения не дает оптимальных результатов для всех пациентов, страдающих диабетом, и таким образом имеется необходимость в эффективных способах лечения диабета, в особенности диабета типа 2.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить новый способ лечения диабета, в особенности диабета типа 2.

В исследованиях, которые привели к созданию настоящего изобретения, было обнаружено, что сульфатид представляет собой важное вещество для предотвращения и лечения диабета, в особенности диабета типа 2.

Таким образом, изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного вещества, которое при введении пациенту будет воздействовать на метаболизм сульфатида таким образом, который приведет к повышению количества сульфатида или, более точно, к повышению количества одной разновидности молекул или изоформы сульфатида для получения фармацевтического препарата для лечения диабетического состояния, где указанное вещество представляет собой изоформу сульфатида.

Изобретение также относится к способу лечения диабетического состояния, согласно которому терапевтически эффективное количество вещества, которое при введении пациенту воздействует на метаболизм сульфатида таким образом, который приводит к повышению количества сульфатида или, более точно, к повышению количества одной разновидности молекул или изоформы сульфатида, причем указанное вещество представляет собой изоформу сульфатида.

Диабетические состояния, которые могут быть подвергнуты лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают преддиабет, диабет, непереносимость глюкозы и осложнения, связанные с диабетом. Диабет, поддающийся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включает диабет типа 1, диабет типа 2, LADA (латентный аутоиммунный диабет у взрослых) и юношеский диабет.

Кроме того, было обнаружено, что специфические изоформы, а именно изоформы с 8-24 атомами углерода, и, более конкретно, изоформы с 14-18 атомами углерода, в особенности, изоформа с 16-ю атомами углерода в цепи жирной кислоты приводят к повышению поглощения сульфатида. Согласно предпочтительному осуществлению изобретения вещество, используемое для изготовления фармацевтической композиции или используемое в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, представляет собой изоформы с 14-18 атомами углерода в цепи жирной кислоты и более предпочтительно изоформу с 16-ю атомами углерода в цепи жирной кислоты.

Таким образом, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением и способ согласно настоящему изобретению, таким образом, пригодны для лечения диабетических состояний, таких как преддиабет, диабет и/или осложнения, связанные с диабетом.

Отличительные признаки настоящего изобретения будут ясны из приведенного ниже описания и прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

В подробном описании изобретения и приведенных ниже примерах приводятся ссылки на следующие рисунки:

Фиг.1 представляет собой схематическую иллюстрацию молекулы сульфатида;

Фиг.2 иллюстрирует метаболизм сульфатида;

Фиг.3 представляет собой авторадиограмму, характеризующую различие в сульфатидных фрагментах крыс линии Льюиса и Ob/Ob мышей;

Фиг.4 иллюстрирует то, что в островках Лангерганса из поджелудочной железы крыс линии Льюиса и ВВ крыс существуют два главных аналога, один с фрагментом жирной кислоты С24:0, другой с фрагментом жирной кислоты С16:0, а также то, что количество С16:0 аналога в двух типах моделей на мышах ob/ob и db/db снижено до неопределяемой концентрации (как показано методом TCX-ELISA - тонкослойной хроматографией в сочетании с иммуносорбентным анализом с применением фиксированных ферментов - с использованием антисульфатидных моноклональных антител);

Фиг.5 иллюстрирует то, что изоформа сульфатида с 16 атомами углерода в жирной кислоте оказывает значительное воздействие на сохранность кристаллов инсулина как по сравнению с С24-аналогом и с нативным сульфатидом, так и по сравнению с инсулином, хранившимся без сульфатида;

Фиг.6А иллюстрирует поглощение различных изоформ сульфатида в печени; и

Фиг.6В иллюстрирует поглощение различных изоформ сульфатида в поджелудочной железе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указывалось выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что сульфатид является важным веществом для предотвращения диабета и, в особенности, диабета типа 2.

Сульфатид, или галактозилцерамид-3-О-сульфат, представляет собой кислый гликосфинголипид. Схематическая иллюстрация строения молекулы сульфатида приведена на фиг.1. Как видно из этой фигуры, молекула сульфатида включает сульфатированную галактозу, сфингозиновое основание и жирную кислоту. Ранее было описано множество молекулярных разновидностей сульфатида, или изомерных форм сульфатида, и эти формы отличаются друг от друга числом атомов углерода, присутствующих в жирной кислоте, и степенью ненасыщенности и гидроксилирования.

Различные формы сульфатида имеют в некоторой степени различную биологическую активность. Кроме того, в некоторых случаях диабет типа 2 может быть вызван отсутствием конкретной молекулярной разновидности, или изоформы сульфатида, и тогда может оказаться важным проводить лечение согласно настоящему изобретению таким образом, чтобы повысить количество этой конкретной молекулярной разновидности.

В соответствии с настоящим изобретением возможно использовать все различные изоформы сульфатида как природного происхождения, так и полученные синтетическим путем.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным является применение изоформ сульфатида с 8-24 атомами углерода, предпочтительнее с 14-18 атомами углерода и особенно предпочтительно с 16 атомами углерода в цепи жирной кислоты и, в особенности, с 16 атомами углерода, поскольку эта изоформа приводит к наилучшему поглощению сульфатида, что показано далее в приведенных ниже примерах.

Сульфатид вырабатывается в клетках, продуцирующих инсулин множества разновидностей млекопитающих, включая человека, и изоформы специфичны для таких клеток. Тот факт, что сульфатид подвергается тому же внутриклеточному маршруту обмена веществ, что и инсулин, дополнительно подтверждает результаты, полученные благодаря настоящему изобретению. Сульфатид включен в нормальный процессинг инсулина, от проинсулина до выделяемого мономерного инсулина. Сульфатид участвует в переносе и окислении проинсулина и, таким образом, необходим для образования инсулина, он связан с сохранением кристаллов инсулина в секреторных гранулах и, таким образом, необходим для хранения запасов инсулина, предотвращения деториации и образования фибрилл и принимает участие в трансформации инсулина от гексамерной формы через димер до мономерной формы при секреции, и это последнее превращение в мономер необходимо для проявления биологической активности. Кроме того, сульфатид может быть необходим в сочетании с инсулином для того, чтобы должным образом воздействовать на рецепторы инсулина и исключить развитие резистентности к инсулину. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сульфатид в сочетании с инсулином ингибирует реакцию Т-клеток на инсулин, подтверждая тот факт, что сульфатид и инсулин обычно взаимосвязаны в процессе кровообращения и, таким образом, не вызывают иммунную реакцию, наблюдающуюся у пациентов с диабетом типа 1 и при чувствительности к введенному из внешних источников инсулину.

Измененный синтез сульфатида, таким образом, является патогенным фактором, связанным с диабетом, причем как с диабетом типа 1, так и с диабетом типа 2. Авторы настоящего изобретения, например, показали, что нарушенный метаболизм сульфатида связан с дефицитом инсулина (это далее показано в примере), а также с резистентностью к инсулину при диабете типа 2.

Метаболизм сульфатида происходит, например, в комплексе Гольджи островков Лангерганса в поджелудочной железе. Схематическая иллюстрация метаболизма сульфатида приведена на фигуре 2. Как видно из приведенного на этой фигуре, метаболический путь включает несколько стадий. Для того чтобы получить результат, необходимый в соответствии с настоящим изобретением, т.е. получить повышенное количество, по меньшей мере, одной разновидности молекул сульфатида, возможно воздействовать на этот метаболический путь посредством воздействия на содержание конечного продукта сульфатида. Это может быть выполнено. Возможно воздействовать на содержание сульфатида посредством введения изоформы сульфатида или его функционально эквивалентного аналога. Может быть использована либо одна изоформа, либо в сочетании с другими изоформами, в которых фрагмент жирной кислоты включает 8-24, предпочтительно 14-18 и наиболее предпочтительно 16 атомов углерода, или в сочетании с их функционально эквивалентными аналогами и, как указывалось выше и будет прокомментировано ниже, в некоторых случаях может быть предпочтительным вводить одну конкретную молекулярную разновидность или изоформу сульфатида, т.е. изоформу со специфическим числом атомов углерода.

Термин «лечение», который используется в настоящем описании, относится как к профилактическому лечению, т.е. к лечению для того, чтобы излечить или облегчить заболевание или состояние, а также к терапевтическому лечению, т.е. лечению для того, чтобы предотвратить развитие заболевания или состояния. Лечение может осуществляться как в остром, так и в хроническом состоянии.

Термин «пациент», который используется в настоящем описании, относится к человеку или любому млекопитающему, не являющемуся человеком, нуждающемуся в лечении согласно настоящему изобретению. Этот термин также включает пациентов с преддиабетом и/или толерантностью к глюкозе, хотя такие субъекты не рассматриваются как пациенты в другом контексте.

Термин «функционально эквивалентный аналог», который используется в настоящем описании, относится к веществу, которое по существу оказывает тот же самый биологический эффект, как и вещество, аналогом которого в смысле настоящего изобретения это вещество является. Функционально эквивалентный аналог изомера сульфатида, таким образом, представляет собой вещество, которое будет оказывать, по существу, то же самое воздействие на инсулин, что и изомер сульфатида.

Термин «терапевтически эффективное количество», который используется в настоящем описании, относится к количеству, которое приводит к необходимому терапевтическому воздействию.

Фармацевтический препарат согласно настоящему изобретению может также включать вещества, обычно используемые для того, чтобы облегчить изготовление препарата или облегчить введение препарата. Такие вещества хорошо известны специалистам в данной области техники и могут представлять собой, например, адъюванты, носители и консерванты.

Фармацевтический препарат и способ согласно настоящему изобретению также пригодны для профилактики и/или лечения различных заболеваний, связанных с диабетом или возникших вследствие диабета. Такие сопутствующие заболевания могут, например, представлять собой заболевания, воздействующие на глаза, почки и нервную систему, а также заболевания сердца и кровеносных сосудов.

ПРИМЕР 1

Этот пример иллюстрирует тот факт, что дефектный метаболизм сульфатида связан с нехваткой инсулина.

Липиды экстрагируют из клеток островков, выделенных из панкреатической ткани мышей линии Ob/Ob и крыс линии Льюиса. Липидный экстракт отделяют и анализируют методом тонкослойной хроматографии в сочетании с иммуногистохимическим анализом, используя специфические моноклональные антитела к сульфатиду. Параллельно анализируют сульфатидные стандарты в известных количествах для того, чтобы получить количественную оценку. Полученные количественные значения для сульфатида островковых клеток мышей приведены ниже в таблице 1. Результаты свидетельствуют о значительном снижении количества сульфатида в островках на модели диабета типа 2.

ТАБЛИЦА 1
Разновидность	Сульфатид (пмоль/мг белка)	Сульфатид (пмоль/островок)
Линия Ob/Ob	0,1	0,1
Линия Льюиса	3-5	1-2

Островковые клетки, выделенные из ткани поджелудочной железы мышей линии Ob/Ob и крыс линии Льюиса, выращивают в среде, содержащей ³⁵S-сульфат. Затем липиды экстрагируют, отделяют и анализируют авторадиографически после тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем. На фигуре 3 показана авторадиограмма и обнаруженное различие в липидных фрагментах сульфатида крыс линии Льюиса и мышей линии Ob/Ob, модели диабета типа 2.

ПРИМЕР 2

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ СУЛЬФАТИДА В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ И ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ЛИНИИ ОВ/ОВ ПОСЛЕ ИНТРАПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ИНЪЕКЦИИ (³H)

Этот пример иллюстрирует то, что изоформа сульфатида с цепью жирной кислоты, содержащей 16 атомов углерода, оптимизирует усвоение сульфатида и процессинг инсулина.

В этом примере выражение «Cn:х аналог» обозначает изоформу сульфатида, содержащую n атомов углерода и х двойных связей, например С8:0 - аналог, таким образом, относится к изоформе сульфатида с 8 атомами углерода и без двойных связей в фрагменте - цепи жирной кислоты.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Мыши линии Ob/ob, по данным биохимического анализа, обладают отклоняющимся от нормального типа сульфатидным метаболизмом как количественно, так и качественно (см. пример 1). Сульфатид представляет собой сульфатированный гликосфинголипид, состав липидного фрагмента которого может варьироваться. В островках Лангерганса из поджелудочной железы крыс линии Льюиса и ВВ крыс содержатся два основных аналога, один с фрагментом жирной кислоты С24:0, а другой - с фрагментом жирной кислоты С16:0. В двух моделях диабета типа 2 на мышах, ob/ob и db/db, содержание аналога С16:0 снижено до неопределяемой концентрации (по данным исследования методом TCX-ELISA - тонкослойной хроматографией в сочетании с иммуносорбентным анализом с применением фиксированных ферментов) при использовании антисульфатидных моноклональных антител. Это иллюстрирует фигура 4.

Авторы настоящего изобретения провели исследование in vitro, которое показало, что аналог С16:0 является существенным для процессинга инсулина. Сохранность кристаллов инсулина, требование для хранения резерва инсулина, который может высвобождаться при повышении содержания глюкозы в крови, повышено в случае сульфатида С16:0 по сравнению с другими изоформами сульфатида. Аналог сульфатида С16:0 оказывает значительное воздействие на сохранность по сравнению с аналогом С24:0 и по сравнению с нативной смесью сульфатидов из мозга свиньи так же, как и по сравнению с инсулином, подвергавшимся хранению без сульфатида. Это иллюстрирует фигура 5.

Гипотеза

Отсутствие аналога С16:0 сульфатида в островках Лангерганса на модели диабета типа 2 приводит к неоптимальному процессингу инсулина. Это может вызывать не только дефицит инсулина, но и резистентность к инсулину. Сохранность присутствия сульфатида С16:0 в островках посредством доставки сульфатида С16:0 представляет, таким образом, стратегию лечения диабета типа 2.

Схема эксперимента

Нативный сульфатид, выделенный из мозга свиньи и структурно охарактеризованный посредством масс-спектроскопии, был модифицирован в отношении состава жирнокислотного фрагмента, а в сфингозиновое основание введена тритиевая метка. Такие аналоги вводят интраперитонеально ob/ob мышам с диабетом и анализируют поглощение аналогов печенью и поджелудочной железой после экстракции липидов препарированных органов. Цель заключается в том, чтобы установить, поглощается ли экзогенно введенный сульфатид поджелудочной железой и появляется ли в связи с этим возможность замены в плане количественного и качественного изменения сульфатида, обнаруживаемого на модели диабета типа 2.

Введение радиоактивной метки в сульфатид

Сульфатид метили тритием в церамидной части посредством каталитического гидрирования с использованием Pd(ОАс)₂/NaB³H₄.

Меченный сульфатид смешивали с несодержащим метку сульфатидом для того, чтобы получить необходимую удельную активность.

Модификация жирнокислотного фрагмента сульфатида

Жирную кислоту удаляли из нативного сульфатида, выделенного из мозга свиньи, посредством слабого щелочного метанолиза при 80°С. Полученный лизосульфатид после хроматографической очистки подвергали повторному ацетилированию с использованием соответствующего хлорангидрида жирной кислоты в системе водный ацетат натрия - тетрагидрофуран.

Введение радиоактивно меченных аналогов сульфатида мышам линии ob/ob

Различные аналоги сульфатида, как показано в таблице 2, растворяют в забуференном фосфатом физиологическом растворе, 150 нмоль/300 мкл (образцы подвергают воздействию ультразвука в течение 20 сек) и затем вводят интраперитонеально (i.p.) мышам линии ob/ob. Возраст мышей составляет 12 недель, среднее значение максимального содержания глюкозы в крови составляет 13,4±1,3 нм. Мышей анестезировали действием СО₂ и умерщвляли посредством смещения шейных позвонков. Соответствующие данные приведены в таблице 2. Печень и поджелудочную железу сразу же иссекали. Орган быстро замораживали и размораживали для проведения анализа (в течение 4 дней).

Таблица 2
Аналог сульфатида	Количество аналога, вводимое интраперитонеально каждой мыши, нмоль	Число импульсов в минуту для каждой мыши при интраперитонеальном введении	Количество мышей, умерщвленных через 6 часов после интраперитонеального введения	Количество мышей, умерщвленных через 24 часа после интраперитонеального введения
С8	150	5×106	2	2
С16	150	3,5×106	2	2
С24	150	2×106	2	2

Экстракция сульфатида и исследования

Органы гомогенизируют и экстрагируют смесью хлороформ/метанол/вода. Экстракты липидов упаривают, повторно растворяют в смеси хлороформ/метанол/вода и разделяют хроматографией на силикагеле для того, чтобы удалить другие липиды. Фракцию, содержащую сульфатид, используют для оценки сцинтилляции.

Результаты измерения сцинтилляции представлены на фигуре 6А и на фигуре 6В - фигура 6А представляет данные анализа, относящиеся к печени, а фигура 6В представляет данные анализа, относящиеся к поджелудочной железе, в виде поглощения - суммарного количества импульсов в секунду (cpm), количества импульсов в минуту на мг массы сырой ткани (cpm/mg), количества импульсов в минуту на мг массы белка в ткани (cpm/mg) и в виде % установленного остаточного количества импульсов в секунду (cpm) для органа.

Аналог С8:0 предпочтительно поглощается в печени и быстро деградирует. В поджелудочной железе его поглощение значительно ниже, чем поглощение двух других аналогов. Данные для 6 часов и 24 часов аналогичны и, таким образом, ни ассимиляция, ни деградация не наблюдается. Для аналога С24:0 обнаружено незначительное поглощение в печени по сравнению с аналогом С8:0. Имеется незначительное снижение количества С24:0 в обоих органах при определении для 24 часов, свидетельствующее о медленной деградации и отсутствии аккумуляции. Поглощение аналога С16:0 в печени выше, чем поглощение аналога С24:0, и также свидетельствует о слабой аккумуляции. По сравнению с С8:0 аналогом поглощение в печени через 6 часов после введения ниже, но в противоположность данным относительно сульфатида С8:0, который быстро деградирует, для С16:0 наблюдается аккумуляция через 24 часа. Аналог сульфатида С16:0 является наиболее быстро поглощаемым в поджелудочной железе и наблюдается, как и в печени, аккумуляция через 24 часа.

Выводы

Поглощение сульфатида варьируется для различных аналогов, имеющих разное строение фрагмента жирной кислоты. Среди аналогов - самый короткий С8:0 быстро удаляется из системы кровообращения печенью и подвергается деградации. Кроме того, имеется относительное поглощение поджелудочной железой и отсутствует аккумуляция. Как С16, так и С24 аналоги эффективно поглощаются в поджелудочной железе, однако, хотя аналог С24 проявляет незначительную деградацию в течение 24-часового периода, имеется аккумуляция аналога С16.

Таким образом, по-видимому, имеется избирательное поглощение аналогов в поджелудочной железе, что, как было показано, отсутствует на модели диабета типа 2, таким образом, авторы настоящего изобретения показали, что введение сульфатида и, в особенности, введение изоформы сульфатида с 16 атомами углерода в жирнокислотном фрагменте представляет собой один из путей возобновления аберрантного метаболизма этой молекулы.

1. Способ лечения преддиабетического состояния, диабета, непереносимости глюкозы и/или осложнений, связанных с диабетом, в котором пациенту вводят терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одной изоформы сульфатида, содержащей 14-18 атомов углерода в цепи жирной кислоты, причем указанная, по меньшей мере, одна изоформа сульфатида при введении пациенту воздействует на метаболизм сульфатида таким образом, который приводит к повышению количества сульфатида.

2. Способ по п.1, в котором указанный диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2, LADA (латентный аутоиммунный диабет у взрослых) и/или диабет беременных.

3. Способ по п.2, в котором диабет представляет собой диабет типа 2.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором, по меньшей мере, одна указанная, по меньшей мере, изоформа сульфатида не содержит двойных связей в цепи жирной кислоты.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором вводят только одну изоформу сульфатида.

6. Способ по п.5, в котором указанная изоформа сульфатида содержит 16 атомов углерода в цепи жирной кислоты.

7. Способ по п.5 или 6, в котором указанная изоформа сульфатида не содержит двойных связей в цепи жирной кислоты.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором, по меньшей мере, одна изоформа сульфатида представляет собой изоформу природного происхождения.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором, по меньшей мере, одна изоформа сульфатида представляет собой синтетически полученное вещество.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанную изоформу сульфатида вводят перорально.