Способ осветления ферментных растворов гидролаз

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для осветления ферментных растворов. Способ предусматривает коагуляцию при рН 6,0-7,0, осаждение взвешенных частиц путем добавления к ферментному раствору хлористого кальция в количестве 0,015-0,025 моль/дм³ и эквимолярного количества орто-фосфата натрия или калия. Изобретение позволяет увеличить скорость осветления ферментных растворов и выхода целевого продукта, увеличить удельную активность ферментных препаратов гидролаз. 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для удаления взвешенных частиц в растворах ферментных препаратов с целью их осветления перед процедурами ультрафильтрации, осаждения и адсорбционного выделения ферментов.

Известен способ получения галактаназного ферментного препарата Bacillus pumilus (прототип) [US 20030022347, 30.01.2003, C 12 N 009/40], включающий стадию осветления ферментного раствора с помощью коагуляции взвешенных частиц алюминатом натрия в присутствии катионных и анионных агентов.

Недостатком данного способа является низкая скорость осветления и существенное снижение активности ферментных растворов некоторых гидролаз в процессе очистки, что снижает выход целевого продукта.

Технический результат изобретения заключается в увеличении скорости осветления ферментных растворов и выхода целевого продукта по активности при равной степени осветления, а также в увеличении удельной активности ферментных препаратов гидролаз.

Технический результат достигается тем, что в качестве коагулирующего агента вместо алюмината натрия используют хлористый кальций в присутствии эквимолярного количества орто-фосфата натрия или калия в среде, близкой к нейтральной.

Способ осуществляют следующим образом: к раствору ферментного препарата добавляют раствор хлористого кальция в количестве 1,7-2,8 г/дм³ (0,015-0,025 моль/дм³) и эквимолярное количество раствора орто-фосфата натрия или калия с рН 6,0-7,0 для того, чтобы конечный рН раствора был равен 6,0-7,0. При этом в соответствии с уравнением реакции (1) происходит образование осадка гидрофосфата кальция (CaHPO₄), способствующего коагуляции взвешенных частиц и осветлению ферментного раствора:

где Kat - катион металла.

Ферментный раствор отстаивают в течение 1-2 часов, после чего отделяют от осадка декантацией и при необходимости дополнительно фильтруют через бумажный или полимерный фильтр. Степень осветления для сильно окрашенных растворов оценивают по их прозрачности П (см), за которую принимают максимальную высоту столбика раствора в цилиндре с прозрачным дном при котором еще различим шрифт №14. Степень осветления S (%) рассчитывают по формуле S=(П_к-П_н/П)×100%, где П_н и П_к - прозрачность раствора до и после осветления, П - прозрачность раствора, фильтрованного через полимерный фильтр.

Образование объемного осадка CaHPO₄ способствует соосаждению взвешенных частиц исходного ферментного раствора, что приводит к его осветлению. При этом осадок CaHPO₄ имеет более плотную структуру по сравнению с гидроокисью алюминия, образующейся при гидролизе алюмината натрия в нейтральной среде, что способствует увеличению скорости коагуляции.

В отличие от активной гидроокиси алюминия CaHPO₄ слабо адсорбирует высокомолекулярные белки, что способствует увеличению выхода целевого продукта.

Поскольку CaHPO₄ обладает низкими адсорбционными свойствами по отношению к белкам, на его поверхности происходит преимущественное связывание неактивных низкомолекулярных белков - олигопептидов, что приводит к увеличению удельной активности ферментного раствора, рассчитанной как отношение активности раствора (ед/см³) к общей концентрации белка (мг/см³).

Способ опробован на растворах ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х. Сравнительные экспериментальные данные по применению способа приведены в примерах 1-4 и в таблице 1.

Пример 1 (прототип). К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют эффективное количество щелочного раствора алюмината натрия с концентрацией 100 г/дм³ (20-30 см³). Доводят рН раствора до 6,5-7,0 добавлением 20%-ной серной кислоты и отстаивают растворы до осаждения активной гидроокиси алюминия и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 2. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют в качестве коагулирующего агента 15 см³ 1 М раствора CaCl₂ (1,7 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка СаНРО₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 3. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют 20 см³ 1 М раствора CaCl₂ (2,2 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка CaHPO₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 4. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют 25 см³ 1 М раствора CaCl₂ (2,8 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка CaHPO₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Таблица 1
Фермент/образец	Доза коагулянта, г/дм3	Время осаждения, час	Степень осветления, %	Активность, ед/см3	Содержание белка, мг/см3	Удельная активность, ед/мг белка	Выход активности, %
Пектофоетидин Г3х исходный	-	-	-	110,7	0,75	147,6	-
пример 1 прототип	2,0	2.0	51,0	9,8	0,41	23,9	9,2
пример 2	1,7	1,5	62,3	112,1	0,68	164,9	104,3
пример 3	2,2	1.0	78,6	115,8	0,60	193,0	111,6
пример 4	2,8	1,0	92,4	79,3	0,52	152,5	75,2
Целловирин Г3х исходный	-	-	-	8,5	2,10	4,04	-
пример 1 прототип	3,0	>5,0	91,7	1,7	0,66	2,50	21,2
пример 2	1,7	1,5	64,5	8,2	2,00	4,10	99,3
пример 3	2,2	1,0	76,2	7,6	1,78	4,27	98,8
пример 4	2.8	1,0	88,9	7,0	1,46	4,79	86,5
Глюкаваморин Г3х исходный	-	-	-	9,9	1,20	8,3	-
пример 1 прототип	2,0	>2,0	94,4	3,4	0,36	9,4	35,7
пример 2	1,7	1.5	89,6	9,5	0,97	9,8	98,8
пример 3	2,2	1,0	95,3	8,8	0,85	10,4	92,1
пример 4	2,8	1,0	97,8	6,7	0,73	9,2	71,1

Данные таблицы 1 показывают, что предлагаемое изобретение позволяет увеличить скорость осветления ферментных растворов и выход целевого продукта по активности при равной степени осветления, а также увеличить удельную активность ферментных препаратов по сравнению со способом-прототипом.

Способ осветления ферментных растворов гидролаз, включающий коагуляцию и осаждение взвешенных частиц, отличающийся тем, что для коагуляции используют хлористый кальций в количестве 0,015-0,025 моль/дм³ и эквимолярное количество орто-фосфата натрия или калия, при этом коагуляцию проводят при рН 6,0-7,0.