Способ флокуляции биомассы из суспендирующей среды и способ определения дозировки полимерных веществ, добавляемых в суспендирующую среду
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам флокуляции биомассы из суспендирующих сред. Способ включает добавление в суспендирующую среду первого полимерного вещества, являющегося катионным и имеющим характеристическую вязкость не более 2 дл/г, с последующим или одновременным добавлением в суспендирующую среду второго полимерного вещества, являющегося катионным или в основном неионным и имеющего характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, дозы которых дают оптимальные эксплуатационные характеристики с последующей флокуляцией биомассы. Изобретение позволяет повысить прочность хлопьев, что позволяет использовать различные методы выделения, включая те, в которых хлопья подвергают механическому перемешиванию. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 табл.
Настоящее изобретение относится к способам флокуляции биомассы из суспендирующих сред. Часто бывает желательно выделять биомассу (такую как клетки и/или клеточный дебрис) из жидкой суспендирующей среды, содержащей биомассу. Один из способов заключается во флокуляции биомассы таким образом, чтобы образующиеся хлопья можно было выделить из жидкой суспендирующей среды. После выделения саму биомассу можно использовать в дальнейших процедурах. Альтернативно биомассу можно отбросить с последующим использованием содержимого суспендирующей среды.
Однако доказано, что трудно найти системы флокуляции, которые приводят к получению приемлемых характеристик флокуляции в суспендирующей среде, из которой часто необходимо выделять биомассу. В частности, зачастую необходимо выделять биомассу из составных сред, таких как среда для выращивания. Обнаружено, что в таких условиях весьма проблематична флокуляция с использованием стандартных флокулянтов, таких как полимеры.
Sitkey и др. в журнале Biotechnology Techniques, том 6, №1, стр.49-52 (1992), описывают выделение клеток, твердых тел и коллоидов из ферментационного бульона. Целью выделения является регенерация внеклеточных ферментов, присутствующих в суспендирующей среде. 16 полимерных веществ описаны для использования в качестве флокулянтов. Типами используемого флокулянта являются слабо катионные, среднекатионные, сильнокатионные, слабоанионные, среднеанионные и неионные. Однако согласно утверждениям авторов только два полимера приводят к эффективной очистке. Ими являются анионные полимеры Sedipur T1 и Sedipur TF5, поставляемые фирмой BASF. Также описывается добавление различных катионных и неионных полимеров. Каждый добавляют в форме однократной дозы в качестве единственного флокулянта, который неэффективен в очистке ферментационного бульона.
Mukhopadhyay и др. в журнале Biotechnology Techniques, том 4, №2, стр.121-126 (1990), также описывают попытку выделить суспендированные твердые тела из ферментационного бульона в целях отыскания внеклеточных ферментов, растворенных в суспендирующей среде. Авторы используют различные системы для того, чтобы улучшить коагуляцию или флокуляцию. Используемыми флокулянтами являются ледяная уксусная кислота, хлористый кальций, сульфат алюминия и катионный полиакриламид. Также используются системы этих веществ, причем в суспендирующую среду добавляют два или более таких веществ. В частности, авторы описывают системы, в которых в качестве флокулянтов используются сульфат алюминия и катионный полиакриламид. Количество используемого катионного полиакриламида составляет 0,1, 0,3 и 0,5 г/л (100, 300 и 500 частей на миллион). Количество используемого сульфата алюминия всегда составляет 5,0 г/л (5000 частей на миллион). Хотя очистка ферментационного бульона достигается с использованием этой системы, авторы указывают, что при высоком сдвигающем усилии образующиеся хлопья распадаются на более мелкие частицы. Это препятствует осаждению. Таким образом, данная система может очищать ферментационный бульон, но не приводит к получению прочных хлопьев. По этой причине ограничены способы, которые впоследствии можно использовать для выделения хлопьев из надосадочной жидкости (супернатанта). В частности, авторы даже советуют не пользоваться умеренным центрифугированием.
В ЕР-А-448926 раскрывается система для флокуляции фермента. Биомассу, такую как клетки и клеточный дебрис, выделяют из суспендирующей среды, такой как ферментационный бульон, механическими средствами, такими как центрифугирование, а остающийся в супернатанте фермент флокулируют с использованием флокулянта. Флокулянт представляет собой смесь полиакриламида Манниха и полимера на основе галогенида диаллилдиметиламмония. В описанной системе биомассу необходимо вначале удалить из ферментационного бульона с помощью механических средств, с тем, чтобы она не могла засориться продуктами, химически осаждаемыми позднее.
Weir и др. в журнале Biotechnology Techniques, том 7, №3, стр.199-204, 1993, раскрывают флокуляцию клеток из ферментационного бульона с использованием хитозана, катионного полиэлектролита, который, как сообщается, нейтрален при значении рН (водородный показатель) свыше 7,9. Те же авторы в журнале Biotechnology Techniques, том 8, №2, стр.129-132, 1994, также описывают использование различных анионных полимеров как веществ для предварительной обработки, проводимой перед использованием хитозана в качестве флокулянта.
Известно, что флокуляция микробных клеток в жидкой культуральной среде с помощью катионных полиэлектролитов способствует выделению клеток из среды. Если среда содержит высокие концентрации анионных полиэлектролитов, которые являются компонентами среды и/или продуцируются клетками, добавление высокомолекулярных катионных флокулянтов приводит к получению хлопьев. Эти хлопья будут загрязнены смесью концентрированного флокулянта и полиэлектролитного комплекса, образованного из анионного и катионного полимера (полисоли), и/или осадка из анионного и катионного полимера, который вызывает прилипание хлопьев к поверхностям технологического оборудования. Альтернативная методика добавления флокулянтов на основе низкомолекулярного катионного полимера в бактериальные культуры, содержащие высокие концентрации анионных полиэлектролитов, требует наличия больших дозировок полимера, в целях достижения достаточной флокуляции, из-за образования анионного и катионного полимерного комплекса и/или осадков. Кроме того, обнаружено, что хлопья, полученные с использованием флокулянтов на основе низкомолекулярного катионного полимера, значительно слабее хлопьев, полученных с использованием высокомолекулярных полимеров. В условиях сдвигающего усилия клетки высвобождаются из хлопьев, полученных с использованием флокулянтов на основе низкомолекулярного катионного полимера, и это приводит к снижению производительности выделения.
Было бы желательно предложить эффективную систему выделения биомассы из суспендирующей среды, такой как ферментационный бульон. Было бы также желательно использовать разнообразные методы выделения после флокуляции и предложить хлопья, достаточно прочные, чтобы выдерживать и влияние методик выделения, и, если необходимо, последующее использование.
В соответствии с изобретением предлагается способ флокуляции биомассы из суспендирующей среды, содержащей биомассу, в котором в суспендирующую среду добавляют первое полимерное вещество, являющееся катионным и имеющее характеристическую вязкость не более 2 дл/г, с последующим или одновременным добавлением в суспендирующую среду второго полимерного вещества, являющегося катионным или в основном неионным и имеющего характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, с последующей флокуляцией биомассы.
Заявитель обнаружил, что использование определенных первого и второго полимерных веществ, в целях флокуляции биомассы, приводит к получению прочных хлопьев, пригодных для выделения в условиях высокого сдвигающего усилия без необходимости применения избыточных дозировок полимера. В частности, заявитель обнаружил, что за счет предварительной обработки микробного бульона, который содержит высокие уровни анионного полиэлектролита, катионным полимером, имеющим характеристическую вязкость не более 2 дл/г, а затем полимерным флокулянтом, имеющим характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, получаются прочные хлопья, не содержащие липкого концентрированного полимера. Общая доза полимера выше, чем в известном способе, с использованием полимера, имеющего характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, однако ниже, чем в известном способе, с использованием полимера, имеющего характеристическую вязкость не более 2 дл/г.
Заявитель с удивлением обнаружил, что общая дозировка полимера в двухполимерной системе изобретения может быть уменьшена до 30%, когда два полимера добавляют в основном одновременно или в виде смеси. Также неожиданно было обнаружено, что добавление полимера, имеющего характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, одновременно или в виде смеси с полимером, имеющим характеристическую вязкость не более 2 дл/г, не приводит к получению липких хлопьев.
Поэтому изобретение предоставляет гибкость в использовании различных типов процесса выделения, не разрушающего хлопья.
В соответствии с изобретением биомассу флокулируют из суспендирующей среды. Под биомассой заявитель подразумевает клетки, клеточный дебрис и/или биологические корпускулярные вещества, в особенности клетки и/или клеточный дебрис. Заявитель не охватывает флокуляцией только клеточные продукты, такие как фермент или полимер.
Изобретение может быть использовано для флокуляции биомассы из различных микроорганизмов. Поэтому изобретение ценно для флокуляции любой микробной биомассы в суспендирующей среде. Она включает в себя бактерии, такие как Bacillus subtilis, в суспендирующей среде.
Концентрация биомассы в суспендирующей среде обычно составляет, по меньшей мере, 0,5 г (сухая масса)/л, часто, по меньшей мере, 2 или 3 г/л, и может доходить до 100 или 150 г/л.
Суспендирующая среда часто является средой для выращивания, с тем, чтобы биомасса флокулировалась из ферментационного бульона. Это - сложная среда, содержащая стандартные компоненты среды для выращивания, такие как крахмал (например, картофельный крахмал), кукурузная мучка, кукурузная мука, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука, маисовая клейковина, дрожжевой экстракт, дистиллят мелассы, рыбная кормовая мука, пептон и другие коммерчески доступные лизаты. Величина рН суспендирующей среды не имеет решающего значения и обычно составляет от 3 до 10, часто от 4 до 9, например от 6 до 8. Питательная среда склонна содержать высокие уровни анионного материала, такого как анионные полиэлектролиты, или как часть компонентов питательной среды, или как продукты растущих клеток. Изобретение имеет особое значение для использования в таких средах, поскольку доказано, что флокуляция биомассы из них особенно затруднена.
В соответствии с предлагаемым способом изобретения первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду, содержащую биомассу. Два полимерных вещества можно добавлять в суспендирующую среду последовательно, то есть добавляют первое катионное полимерное вещество с последующим добавлением второго катионного полимерного вещества. При применении последовательного добавления первое катионное полимерное вещество предпочтительно примешивать в суспендирующую среду перед добавлением второго катионного полимерного вещества.
Предпочтительно, если первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду одновременно. Их можно добавлять отдельно, но интервал между добавлением каждого не должен превышать 30 секунд. Практически никакого смешивания одного полимерного вещества с суспендирующей средой не проводят перед добавлением другого вещества.
Предпочтительно, если эти вещества добавляют в виде предварительно сформованной смеси. Заявитель обнаружил, что одновременное добавление, особенно в виде предварительно сформованной смеси, имеет особое преимущество по сравнению с последовательным (т.е. неодновременным) добавлением двух полимерных веществ. На самом деле, количества полимерных веществ можно уменьшить при одновременном добавлении по сравнению с последовательным добавлением, сохраняя при этом приемлемые эксплуатационные качества.
Полимерные вещества можно добавлять в суспендирующую среду в любой пригодной форме. Пригодные формы добавления включают порошок, хотя предпочтителен водный раствор. Например, если первое и второе катионные полимерные вещества добавляют в отдельности, каждое предпочтительно добавлять в виде раствора в воде с концентрацией, по меньшей мере, 0,05% в отношении массы к объему, часто не более чем 1,0% в отношении массы к объему. Пригодная концентрация в водном растворе составляет около 0,1% в отношении массы к объему, однако может достигать более высоких концентраций, например свыше 8,0% в отношении массы к объему, а в некоторых случаях до 50,0% в отношении массы к объему.
Количество активного первого катионного полимерного вещества, добавляемого в суспендирующую среду, может быть не более чем 1000 частей на миллион, предпочтительно не более чем 500 частей на миллион, в расчете на общую массу суспендирующей среды (включая биомассу и добавляемый полимер). Часто это количество составляет не более чем 300 или 200 частей на миллион. Хорошие результаты можно получить при количествах менее 150 частей на миллион и даже ниже, а оптимальные результаты можно достичь при количествах менее 120 частей на миллион. Обычно это количество составляет, по меньшей мере, 50 частей на миллион, часто, по меньшей мере, 100 частей на миллион. Тем не менее, если необходимо флокулировать высокие концентрации биомассы, могут потребоваться намного более высокие дозы, например до 4000 частей на миллион. Аналогичным образом для полимеров, обладающих характеристической вязкостью, по меньшей мере, 4 дл/г, могут потребоваться еще более высокие дозы.
Количество активного второго полимерного вещества, добавляемого в суспендирующую среду, как правило, составляет не более чем 500 частей на миллион, предпочтительно не более чем 250 частей на миллион. Часто это количество ниже 100 или 80 частей на миллион, а оптимальные результаты можно достичь при количествах 50 частей на миллион или ниже. Обычно это количество составляет, по меньшей мере, 25 частей на миллион.
Эти количества первого и второго полимерных веществ пригодны для их добавления в отдельности (последовательно или одновременно) и для использования двух полимерных веществ в виде предварительно сформованной смеси. Однако одновременное добавление, особенно в виде предварительно сформованной смеси, позволяет использовать меньшие количества, нежели последовательное добавление.
В предварительно сформованной смеси отношение первого полимерного вещества ко второму (активный полимер, отношение по массе) предпочтительно составляет от 40:60 до 95:5 (отношение первого ко второму полимерному веществу). Более предпочтительно, это отношение составляет от 50:50 до 90:10, наиболее предпочтительно от 60:40 до 80:20. Особенно хорошие результаты достигнуты с использованием смесей, в которых отношение первого ко второму полимерному веществу составляет от 65:35 до 75:25, в особенности около 70:30.
Общее количество смеси активных полимеров, добавляемой в суспендирующую среду, обычно ниже 1000 частей на миллион, часто ниже 500 частей на миллион. Оно может быть ниже 300 или 250 частей на миллион. Хорошие результаты получены при количествах ниже 200 частей на миллион, а оптимальные результаты можно достичь при количествах менее 170 частей на миллион. Общее количество активного полимера, добавляемого в суспендирующую среду, обычно составляет, по меньшей мере, 50 частей на миллион, предпочтительно, по меньшей мере, 100 частей на миллион.
Когда первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду в виде смеси, она может принимать любую пригодную форму, например порошок или, предпочтительно водный раствор. Общая концентрация полимера в водном растворе обычно составляет, по меньшей мере, 0,05% в отношении массы к объему, обычно не более чем 1,0% в отношении массы к объему.
Заявитель также изобрел новый способ "предсказания" любого конкретного сочетания суспендирующей среды и биомассы, причем дозировки каждого типа полимера дают оптимальные эксплуатационные характеристики. Данный способ заключается в следующем.
1. Отбирают пробу суспендирующей среды. Биомассу выделяют из пробы суспендирующей среды механическими средствами, такими как периодическое центрифугирование, с получением отделенной биомассы и отработанной суспендирующей среды.
2. Первое полимерное вещество добавляют в отработанную суспендирующую среду, после чего увеличение спектральной поглотительной способности (оптической плотности) тщательно перемешанной пробы измеряют при длине волны 600 нм. Количество первого полимерного вещества, которое приводит к максимальному увеличению оптической плотности, отмечают как Доза 1.
3. Отделенную биомассу ресуспендируют в солевом растворе, имеющем такой же объем, ионную силу и величину рН, что и отработанная суспендирующая среда.
4. Затем в ресупендированную биомассу постепенно добавляют второе полимерное вещество и наблюдают уменьшение помутнения, измеренного в качестве оптической плотности пробы при длине волны 600 нм, как описано выше. Дозу второго полимерного вещества, которая приводит к максимальному уменьшению помутнения, отмечают как Доза 2.
5. Первое и второе полимерные вещества при отношении Дозы 1 к Дозе 2 затем используют для флокуляции биомассы из всей суспендирующей среды.
Вышеприведенный способ дает аппроксимацию оптимального отношения первого и второго полимерных веществ. Однако на практике абсолютная доза полимеров в форме смеси будет ниже. Кроме того, оптимальное отношение смеси может незначительно расходиться с тестовым методом тем, что доля молекулярной массы может быть выше.
Первое полимерное вещество имеет характеристическую вязкость не более 2 дл/г. В этом описании характеристическую вязкость (ХВ) измеряют вискозиметром с подвешенным уровнем при температуре 25°С в 1 н. растворе хлористого натрия, забуференном до рН 7. Предпочтительно ХВ не выше чем 1,5 дл/г. Предпочтительно она составляет, по меньшей мере, 0,5 дл/г. ХВ может доходить до значения 1 дл/г или ниже. Полимерное вещество является катионным. Оно предпочтительно представляет собой синтетическое полимерное вещество и, как правило, производится путем полимеризации этиленненасыщенного мономера или смеси мономеров.
Предпочтительно первое полимерное вещество имеет относительно высокую плотность заряда. В частности, оно имеет теоретическую катионную плотность заряда, по меньшей мере, 4 мэкв/г, обычно, по меньшей мере, 5 мэкв/г. Обычно теоретическая катионная плотность заряда составляет не более чем приблизительно 25 мэкв/г. В этом описании теоретическая катионная плотность заряда представляет собой плотность заряда, полученную вычислением на основе мономерной композиции, предназначенной для использования в целях формования полимера.
Предпочтительно полимер формуют из мономеров, в числе которых, по меньшей мере, 60 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, 70 мас.% являются катионными. Содержание катионных мономеров составляет предпочтительно, по меньшей мере, 90 мас.% и может достигать 100 мас.%.
Пригодные катионные мономеры включают галогениды диаллилдиалкиламмония, например хлорид диаллилдиметиламмония (DADMAC). Можно использовать сополимеры этого вещества с небольшими добавками (обычно менее 30 мас.% и предпочтительно менее 10 мас.%) (мет)акриламида, хотя предпочтительнее гомополимеры. Также можно использовать гомополимеры четвертичной соли или кислой аддитивной соли диалкиламиноалкил(мет)акрилата и гомополимеры диалкиламиноалкил(мет)акриламида, по выбору в качестве четвертичной соли или кислой аддитивной соли, а также сополимеры этих веществ с небольшими количествами (обычно менее 30 мас.% и предпочтительно менее 10 мас.%) (мет)акриламида. Другие пригодные вещества в качестве первого катионного полимерного вещества включают полиэтиленимины, полиамины, продукты конденсации эпихлоргидриндиамина, полимеры дициандиамида и другие традиционные низкомолекулярные катионные коагулянтные полимеры. Предпочтителен полиDADMAC.
Второе полимерное вещество имеет характеристическую вязкость, по меньшей мере, 6 дл/г. Предпочтительно ХВ составляет, по меньшей мере, от 8 до 15 дл/г или от 8 до 20 дл/г или выше.
Это вещество может быть катионным или, по существу, неионным. Предпочтительно, если оно катионное. В случае, если оно катионное, второе полимерное вещество имеет относительно низкую плотность заряда. Предпочтительно теоретическая катионная плотность заряда составляет порядка 4 мэкв/г, часто около 3 или 2 мэкв/г, однако может быть всего около 0,1 мэкв/г или даже около 0,5 мэкв/г.
Второе полимерное вещество предпочтительно является синтетическим полимером, в частности полимером, образованным путем полимеризации этиленненасыщенного мономера или смеси мономеров. Если второе полимерное вещество является катионным, то количество катионного мономера в смеси обычно составляет, по меньшей мере, 2 или 3 мас.%. Оно может достигать 50 мас.%, хотя, как правило, составляет не более 20 мас.%.
Предпочтительными катионными мономерами являются диалкиламиноалкил(мет)акрилаты в виде кислых аддитивных солей или предпочтительно четвертичных солей. Можно использовать диалкиламиноалкил(мет)акриламиды, предпочтительно в виде кислых аддитивных солей или четвертичных солей, хотя предпочтительный полимер не является акриламидным полимером Манниха. Каждая группа алкила может содержать от 1 до 4 атомов углерода, а группа аминоалкила может содержать от 1 до 8 атомов углерода. Особенно предпочтительны диалкиламиноэтил(мет)акрилаты.
Эти мономеры обычно сополимеризуют с неионным мономером, таким как метакриламид или предпочтительно акриламид. Второе катионное полимерное вещество может быть амфотерным полимером благодаря включению меньшего количества анионного мономера, например акриловой кислоты, или этиленненасыщенного карбоксильного мономера.
Альтернативно второе полимерное вещество может быть в основном неионным и может содержать ионный мономер в количестве менее 3 мас.% (в расчете на массу смеси мономеров). Оно может, например, формоваться из 100% акриламида, по выбору с малым количеством гидролиза, с образованием менее 3 мас.%, обычно менее 1 или 2 мас.%, акриловой кислоты. Другие неионные мономеры включают метакриламид.
Второе полимерное вещество, особенно, если оно катионное, может быть полностью растворимым в воде веществом или может быть в форме сшитых полимеров. Полимер может быть изготовлен с содержанием небольшого количества агента сшивания так, как описано, например, в ЕР-А-202780. Предпочтительные полимеры этого типа имеют ионную равновесную влажность от 20 до 80% (как определено в ЕР-А-202780). Предпочтительным полимером является линейный полимер.
В предлагаемом способе первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду с последующей флокуляцией биомассы. Предпочтительно, если флокуляция происходит при перемешивании, которое является продолжением приготовления смеси.
После добавления обоих полимерных веществ суспензию обычно отстаивают в течение приблизительно 5-30 минут, обычно 10-20 минут. Скорости оседания измеряют, наблюдая за твердой межфазной поверхностью раздела, образованной хлопьями биомассы, и за временем, требующимся поверхности раздела, чтобы пройти 1 см в стандартной 12 мл пробирке диаметром 12 мм. В предпочтительных способах скорость оседания составляет, по меньшей мере, 3 см/мин, предпочтительно, по меньшей мере, 8 см/мин, а в особенно предпочтительных способах, по меньшей мере, 10 см/мин.
Эффективность флокуляции измеряют в виде процентного снижения помутнения (% СП). % СП - это снижение оптической плотности (при 600 нм) суспендирующей среды после флокуляции по сравнению с оптической плотностью до флокуляции. Таким образом
% СП=((A1-A2)×100)/A1,
где A1 - оптическая плотность при 600 нм суспендирующей среды до флокуляции;
А2 - оптическая плотность при 600 нм суспендирующей среды после добавления первого и второго полимерных веществ и отстаивания смеси в течение 15 минут.
В предлагаемом способе % СП может быть очень высоким, например, по меньшей мере, 90 или 95%, и может быть даже, по меньшей мере, 98% или, по существу, 100%.
В соответствии с изобретением заявитель рассчитал минимально эффективную дозу (МЭД) активного полимера. МЭД является наиболее низкой активной дозой полимера (первое и второе полимерные вещества в отдельности или в виде смеси), которая приводит к получению 90% СП.
В соответствии с изобретением МЭД может составлять всего 200 частей на миллион и даже всего 170 частей на миллион или менее.
Одно из преимуществ изобретения заключается в прочности образующихся хлопьев. В соответствии с изобретением заявитель измерил прочность хлопьев в виде показателя прочности хлопьев (ППХ). Эта величина отражает прочность хлопьев в условиях высокого сдвигающего усилия. Хлопья, образующиеся после 15-минутного отстаивания, подвергаются высокому сдвигающему усилию, которое определяется сдвигающим усилием, прилагаемым в отношении 5 мл суспензии в стандартной 12 мл пробирке в течение 30 секунд вихревого смешивания, продуцируемого на наивысшее схватывание в смесителе miximatic (Jencons). Сдвинутые хлопья затем отстаиваются в течение 15 минут, после чего измеряют % СП осажденной суспензии. Таким образом:
показатель прочности хлопьев = 100-(% СПА-% СПВ),
где % СПА = % СП после флокуляции;
% СПВ = % СП после приложения сдвигающего усилия.
% СП всегда вычисляют относительно помутнения нефлокулированной суспендирующей среды.
Предпочтительно ППХ составляет, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% и может достигать даже, по меньшей мере, 98%.
Другой способ оценки прочности хлопьев заключается в измерении скорости оседания после проведения испытания на сдвигающее усилие. Предпочтительно скорость оседания после приложения сдвигающего усилия составляет, по меньшей мере, 2 см/мин, предпочтительно, по меньшей мере, 3 см/мин и часто составляет, по меньшей мере, 5 см/мин.
Затем флокулированную биомассу выделяют из осветленной суспендирующей среды. Пригодными методами выделения являются центрифугирование (периодическое), полунепрерывная, непрерывная фильтрация, например вакуумная фильтрация, а также любой иной известный метод выделения.
Одним из преимуществ изобретения является повышенная прочность хлопьев, позволяющая использовать различные методы выделения, включая те, в которых хлопья подвергают механическому перемешиванию и/или сдвигающему усилию, в целях разложения хлопьев на более слабые хлопья.
После выделения флокулированную биомассу можно использовать в различных процессах, например, в качестве катализаторов. Содержимое супернатанта также можно использовать в различных процессах. При желании фермент, присутствующий в супернатанте, можно флокулировать из супернатанта.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Примеры
В этих примерах эффективность флокуляции выражена в % СП, измеренном в соответствии с вышеприведенным описанием. Минимально эффективную дозу измеряют, как описано выше. Скорость оседания и показатель прочности хлопьев также измеряют, как описано выше. Используют следующие полимеры:
Полимер 1: полиDADMAC, ХВ приблизительно 1 дл/г.
Полимер 2: сополимер 67 мас.% акриламида и 33 мас.% катионного мономера (диметиламиноэтилметакрилат, кватернизированный метилхлоридом), ХВ составляет приблизительно 11 дл/г.
В экспериментах флокуляцию осуществляют следующим образом, если не указано иное.
Используют суспензию клеток Bacillus subtilis с концентрацией биомассы 2,7 г (сухая масса) / литр. Аликвоты среды (4 мл) помещают в 12 мл пробирки с последующим добавлением в них флокулянтного полимера и смеси, тщательно перемешивая содержимое в вихревом смесителе в течение приблизительно 5 секунд. Каждый полимер или смесь добавляют в среду в виде 0,1% (в отношении массы к объему) раствора в воде, если не указано иное.
Пример 1
В этом примере испытывают различные смеси полимера 1 и полимера 2, с целью определения оптимального соотношения этих двух полимеров, используя описанную выше суспензию клеток В. subtilis.
В соответствии с вышеупомянутым описанием испытывают смеси, имеющие отношения полимера 1 к полимеру 2, равные 40:60, 50:50, 60:40, 65:35 и 70:30. Смесь в соотношении 70:30 приводит к получению наилучшего осадка, который полностью состоит из микрочастиц. Смесь в соотношении 65:35 также приводит к получению соответствующего осадка, в котором, правда, есть и микрочастицы и более крупные фракции. Для этих полимеров в данной суспензии смеси при соотношении 40:60, 50:50 и 60:40 не являются оптимальными, так как осадки являются в некотором смысле "свалявшимися".
Пример 2
Проводят дальнейшее испытание смеси при соотношении 70:30, которое найдено оптимальным в Примере 1. Находят значения МЭД исключительно для полимера 1, исключительно для полимера 2, а также для смеси полимера 1 и полимера 2 при соотношении 70:30.
Наблюдают природу осадка после добавления смеси, которая отражается на скорости оседания.
В соответствии с вышеупомянутым описанием также вычисляют % СП после флокуляции. Хлопья подвергают высокому сдвигающему усилию в целях получения показателя прочности хлопьев, как описано выше. После приложения высокого сдвигающего усилия вновь определяют скорость оседания. Результаты приведены в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Полимер | МЭД/части на миллион | Описание осадка | Скорость оседания, см3/мин | Скорость оседания после сдвига, см3/мин | Прочность хлопьев (ППХ) |
| 2 | 130 | "Свалявшийся" | 17,6 | 5,3 | 99 |
| 1 | 229 | Корпускулярный | 1,8 | 0,3 | 86 |
| Смесь | 166 | Корпускулярный | 10,6 | 5,3 | 99 |
Из этих результатов можно видеть, что хотя полимер 1 в отдельности приводит к получению корпускулярного осадка, скорость оседания, а также прочность хлопьев имеют низкие значения, что продемонстрировано низким ППХ и низкой скоростью оседания после применения сдвигающего усилия. Полимер 2 в отдельности приводит к получению хорошей скорости оседания и прочности хлопьев, но свалявшегося осадка. Смесь полимеров приводит к получению корпускулярного осадка, хорошей скорости оседания прочности хлопьев. Также отмечается, что в данном случае МЭД ниже, чем МЭД для полимера 1, и незначительно выше, чем МЭД для полимера 2.
Пример 3
В этом эксперименте испытания проводят с целью получения оптимального количества каждого из числа первого и второго катионных веществ.
Пробу клеток В. subtilis, выращенных до концентрации 4 г/л в среде питательного бульона, центрифугируют при 3000 г в течение 15 минут. Затем супернатант восстанавливают и отцентрифугированные клетки ресуспендируют в том же объеме солевого раствора (0,85 % [в массовом отношении] хлорида натрия).
Оптимальное количество полимера 1 достигается путем непрерывного добавления раствора полимера 1 в супернатант до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 600 нм достигнет максимума. Требуемая доза составляет 140 частей на миллион.
Оптимальное количество полимера 2 достигается путем добавления различных доз полимера 2 в суспензию клеток В. subtilis в солевом растворе вплоть до достижения 100% СП. Требуемая доза составляет 50 частей на миллион.
Смесь 140 частей на миллион полимера 1 и 50 частей на миллион полимера 2 затем используют для флокуляции клеток В. subtilis, как описано выше. % СП через 15 минут оседания составляет 100%.
В следующих примерах флокуляцию осуществляют в отношении аликвот объемом 100 куб. см в химическом стакане объемом 250 куб. см, в котором перемешивание осуществляют с использованием смесителя Lightnin А200 Impellor (диаметром 4,7 см). Затем измеряют скорость оседания в измерительном цилиндре объемом 100 куб. см, хронометрируя время, за которое флокулированные клетки В. subtilis прошли расстояние, равное 50 мм.
Полимер 3 представляет собой коммерчески доступный катионный полимер [активная композиция 40% акриламида и 60% катионого мономера (диметиламиноэтилметакрилат, кватернизированный метилхлоридом], имеющий характеристическую вязкость около 12 дл/г.
Полимер 4 представляет собой коммерчески доступный катионный полимер (активная композиция 20% акриламида и 80% мономера, как в полимере 3), имеющий характеристическую вязкость 4 дл/г, предпочтительно после приложения сдвигающего усилия (как описано в ЕР №0202780 В).
Полимеры 1 и 3 или 4 в отдельности или в смеси добавляют в среду в виде 1% и 0,2% (в отношении массы к объему) раствора, соответственно в воде, если не указано иное.
Пример 4
В этом примере определенное количество полимера 1 вначале добавляют к 4,76 г/л суспензии клеток В. subtilis, выращенных в 13 г/л питательного бульона (Oxoid) в 2-х литровых встряхиваемых (качалочных) колбах с перегородками при температуре 30°С в течение 16 часов. Первая используемая доза полимера 1 составляет 210 частей на миллион. Она, как найдено, вызывает максимальное осаждение при обработке отработанной среды, взятой в отдельности. Во втором эксперименте используемая доза полимера 1 составляет 290 частей на миллион и она значительно превышает дозу, используемую в первом эксперименте. Затем суспензию, обработанную двумя полимерами, разделяют на аликвоты, и к каждой из аликвотных суспензий (обработанных дозами 210 и 290 частей на миллион) добавляют различные дозы полимера 3 или полимера 4 вплоть до достижения МЭД полимера 3 или 4 (95% СП). Результаты приведены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Последовательное добавление полимеров | ||
| Доза полимера 1 (части на миллион) | 210 | 290 |
| Доза полимера 1 (мг/г/сухая клетка) | 44 | 60,9 |
| МЭД полимера 3 (части на миллион) | 175 | 148 |
| МЭД полимера 3 (мг/г/сухая клетка) | 36,8 | 31,1 |
| МЭД полимера 4 (части на миллион) | 250 | 200 |
| МЭД полимера 4 (мг/г/сухая клетка) | 52,5 | 42,0 |
Результаты показывают, что более высокая доза полимера 1 приводит к снижению требуемой минимально эффективной дозы полимера 3 или 4.
Пример 5
Осуществляют флокуляцию клеток В. subtilis при концентрации 4,76 г (сухие клетки)/л в отработанном питательном бульоне (Oxoid) с помощью смеси полимера 1 и полимера 3 при соотношении 65:35 и смеси полимера 1 и полимера 4 при соотношении 60:40.
Минимально эффективная доза каждой из двух смесей приведена в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Смесь полимеров | МЭД (части на миллион) | МЭД (мг/г [сухие клетки]) |
| Полимер 1: полимер 3 65:35 | 290 | 60,9 |
| Полимер 1:полимер 4 60:40 | 414 | 87,0 |
Сравнение общей дозы полимера, применяемой для флокуляции той же суспензии клеток В. subtilis, с использованием полимеров, которые добавляются последовательно (например, добавление последовательных дозировок полимера 1 плюс полимер 3 в Таблице 2 Примера 4) и в виде смеси, показывает, что общая доза полимера намного снижена.
Пример 6
В Таблице 4 показаны свойства оседания хлопьев и устойчивость к сдвигающему усилию хлопьев, продуцируемых добавлением лишь полимера 1, последовательным добавлением полимера 1 и полимера 3 или 4, а также добавлением полимера 1 и полимера 3 или 4 в виде смеси.
Как и в Примерах 4 и 5, флокулируют суспензию клеток В. subtilis при концентрации 4,76 г (сухие клетки)/л в отработанном питательном бульоне. Для испытания на устойчивость к сдвигающему усилию хлопьев, продуцируемых каждым методом, флокулированные суспензии (100 куб. см) подвергают сдвигающему усилию в химическом стакане объемом 250 куб. см, в котором перемешивание осуществляют с использованием смесителя Triton в течение 90 секунд (скорость перемешивания 300 оборотов в минуту, диаметр смесителя 6,2 см, ширина смесителя 0,5 см).
| Таблица 4 | ||||||
| Скорости оседания | ||||||
| МЭД (части на миллион) | МЭД (мг/г) | % СП | Скорость оседания (см/мин) | Скорость оседания после сдвига (см/мин) | % СП после сдвига | |
| Полимер 1 | 700 | 147 | 96,5 | 2,1 | 0,8 | 86,4 |
| Полимер 1 + Полимер 3 | 210+221=431 | 44,1+46,4=90,5 | 95,7 | 29,5 | 22,7 | 98,2 |
| Полимер 1 + Полимер 4 | 210+280=490 | 44,1+58,8=102,9 | 96,8 | 49,1 | 12,3 | 98,1 |
| 65/35 Полимер 1/Полимер 3 | 320 | 67,2 | 95,7 | 14,4 | 8,4 | 93,3 |
| 65/35 Полимер 1/Полимер 4 | 430 | 90,3 | 96,7 | 18,5 | 3,9 | 92,8 |
Использование полимера 1 в отдельности приводит к получению суспензии хлопьев, состоящих из мелких частиц, при этом скорость оседания низкая, а продуцируемые хлопья обладают плохой устойчивостью к сдвигающему усилию, о чем свидетельствует снижение % СП после приложения сдвигающего усилия. Использование последовательно добавляемых полимера 1 и полимера 3 или 4 приводит к получению быстро осаждающихся хлопьев, имеющих пониженный размер (измеренный скоростью оседания) после приложения сдвигающего усилия. Однако эти хлопья не разрушаются (о чем свидетельствует высокий ППХ). Полимерные смеси приводят к получению хлопьев, имеющих высокую скорость оседания, обладающих устойчивостью к сдвигающему усилию при использовании намного более низкой общей дозы полимера.
1. Способ флокуляции биомассы из суспендирующей среды, содержащей биомассу, в котором в суспендирующую среду добавляют первое полимерное вещество, являющееся катионным и имеющее характеристическую вязкость не более 2 дл/г, с последующим или одновременным добавлением в суспендирующую среду второго полимерного вещества, являющегося катионным или в основном неионным и имеющего характеристическую вязкость, по меньшей мере, 4 дл/г, с последующей флокуляцией биомассы.
2. Способ по п.1, в котором первое полимерное вещество имеет теоретическую катионную плотность заряда, по меньшей мере, 5 мэкв/г.
3. Способ по п.1 или 2, в котором второе полимерное вещество является катионным.
4. Способ по п.1, в котором второе полимерное вещество имеет теоретическую катионную плотность заряда не более 4 мэкв/г.
5. Способ по п.4, в котором второе полимерное вещество представляет собой сополимер мономера диалкиламиноалкил(мет)акрилата в виде четвертичной или кислой аддитивной соли с неионным этиленненасыщенным мономером и предпочтительно является сополимером акриламида и диметиламиноэтилакрилата, кватернизированного метилхлоридом.
6. Способ по п.1, в котором первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду одновременно.
7. Способ по п.6, в котором первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду в виде предварительно сформованной смеси.
8. Способ по п.1, в котором активная доза второго полимерного вещества составляет не более чем 500 частей на миллион, предпочтительно не более чем 250 частей на миллион, в расчете на массу суспендирующей среды.
9. Способ по п.1, в котором активная доза первого полимерного вещества составляет не более чем 1000 частей на миллион, предпочтительно не более чем 500 частей на миллион, в расчете на массу суспендирующей среды.
10. Способ по п.7, в котором первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду в виде предварительно сформованной смеси, а активная доза смеси составляет не более чем 500 частей на миллион, предпочтительно не более чем 250 частей на миллион, в расчете на массу суспендирующей среды.
11. Способ по п.10, в котором первое и второе полимерные вещества добавляют в суспендирующую среду при отношении первого полимерного вещества ко второму от 60:40 до 80:20, предпочтительно от 65:35 до 75:25.
12. Способ по п.10, в котором первое полимерное вещество представляет собой полиDADMAC, а второе полимерное вещество является сополимером акриламида и диметиламиноэтилакрилата, кватернизированного метилхлоридом.
13. Способ по п.1, в котором флокулированную биомассу выделяют из суспендирующей среды и используют в качестве катализатора.
14. Способ определения дозировки двух полимерных веществ, добавляемых в суспендирующую среду, содержащую биомассу, в котором
i) отбирают пробу суспендирующей среды и выделяют биомассу из пробы механическими средствами с получением отделенной биомассы и отработанной суспендирующей среды;
ii) первое полимерное вещество добавляют в отработанную суспендирующую среду и измеряют оптическую плотность;
iii) повторяют стадии i) и ii) с другими пробами суспендирующей среды и различными количествами первого полимерного вещества, после чего отмечают количество первого полимерного вещества, которое приводит к максимальному увеличению оптической плотности, как доза 1;
iv) отделенную биомассу ресуспендируют в солевом растворе, имеющем такой же объем, ионную силу и величину рН, что и отработанная суспендирующая среда;
v) в ресуспендированную биомассу добавляют второе полимерное вещество и дожидаются уменьшения помутнения;
vi) повторяют стадии iv) и v) в отношении разных количеств второго полимерного вещества и дозу этого вещества, которая приводит к максимальному уменьшению помутнения, отмечают как доза 2.
15. Способ по п.14, в котором первое полимерное вещество является таким, как оно определено в п.1, и второе полимерное вещество является таким, как оно определено в п.1, а дозировки впоследствии используют в способе по п.1.
