Композиция для хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида (тмб) и пероксида мочевины

Изобретение относится к области биохимии и используется для одновременного хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида с пероксидом мочевины, применяемое в качестве субстратной смеси, готовой к использованию, например, в иммуноферментном анализе. Предложено создание композиции для хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида и пероксида мочевины, содержащей 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид 0,1-0,4 г/л; пероксид мочевины 0,1-1,7 г/л; гидроксипропил-β-циклодекстрин 2-5 г/л; поливиниловый спирт 1-4 г/л; проклин 150 0,05 г/л; гидрохлорид 2-меркаптоэтиламина 0,007-0,03 г/л; глицерин 62-500 г/л; в среде цитратного буфера с рН 3,77, которая также может дополнительно содержать 0,004-0,02 г/л моногидрата орцина. Достигнутый технический результат заключается в создании таких субстратных растворов, являющихся основным компонентом диагностических иммуноферментных наборов, когда входящие в состав наборов субстраты однокомпонентны и стабильны, что позволяет избежать дополнительной стадии при проведении анализа, а именно смешивания двух компонентов ТМБ и пероксида мочевины перед началом измерения ферментативной активности, и использовать один и тот же набор в течение длительного времени. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к области биохимии и используется для одновременного хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида с пероксидом мочевины, применяемое в качестве субстратной смеси, готовой к использованию, например, в иммуноферментном анализе (ИФА).

Для проведения анализа обычно используются коммерческие тест-системы, включающие полный набор реагентов, достаточный для одновременного проведения нескольких десятков анализов. Основными компонентами наборов являются полистирольные планшеты с иммобилизованными антителами или антигенами, конъюгаты антител или антигена с ферментом, стандарты определяемого вещества, компоненты буферных растворов, субстраты ферментной метки. В большинстве коммерческих наборов в качестве ферментной метки используют пероксидазу. В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в продукт, имеющий синюю окраску, которая переходит в желтую при остановке ферментативной реакции добавлением стоп-раствора (0,2 М раствором серной кислоты), с максимумом поглощения при длине волны 450 нм.

В стандартных наборах реагентов субстратный раствор в основном поставляется в стабильном двухкомпонентном виде, т.е. в одном флаконе раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в органическом растворителе и отдельно в другом флаконе буферный раствор перекиси водорода. Однако после приготовления субстратной смеси путем смешения двух реагентов раствор быстро теряет активность, при этом быстро синея. Все это вызывает необходимость быстрого его использования. На практике, однако, часто возникает необходимость постановки лишь небольшого числа анализов.

Субстратные растворы являются основными компонентами диагностических иммуноферментных наборов. Предпочтительно, когда входящие в состав наборов субстраты - однокомпонентны и стабильны, т.е. находятся в готовом к использованию виде. Это позволяет избегать выполнения дополнительной стадии при проведении анализа - смешивание двух компонентов - ТМБ и пероксида мочевины перед началом измерения ферментативной активности и использовать один и тот же набор в течение длительного времени.

3,3',5,5'-Тетраметилбензидин представляет собой неполярное органическое нерастворимое в воде вещество. Известны различные органические растворители для растворения молекул 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, такие как N-метилпирролидон (NMP) [1], диметилсульфоксид (ДМСО) [2], диметилформамид (ДМФА) [3, 4, 6], различные спирты с молекулярным весом от 40 до 100, т.е. этанол [6], н-пропанол, изопропанол, метоксипропанол [6], н-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрилы и кетоны [5].

Для безопасности окружающей среды токсичные и летучие растворители заменяют безвредными компонентами, которые способствовали растворению гидрофобной молекулы 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в водном растворе. В качестве таких растворителей используют различные поверхностно-активные вещества (ПАВ), молекулы которых состоят из двух частей - гидрофильной и гидрофобной. Гидрофобные части молекул ПАВ взаимодействуют с гидрофобной молекулой, например 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, окружая ее плотным слоем. В результате чего внешняя поверхность такого клубка (мицеллы) образована гидрофильными концами молекулы ПАВ, которая имеет сродство к воде. Таким образом, ПАВ, не меняя структуру 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, позволяет перевести его в воду, образующаяся при этом система называется дисперсией. С течением времени в дисперсионной системе начинается коагуляция (постепенное слипание гидрофобных частиц), приводящая к разрушению лиофильной коллоидной системы. Для устойчивости термодинамической дисперсии на единицу гидрофобного вещества в более ранних работах подбирали большое количество подходящих разных ПАВ.

Известны различные ПАВ, например, водорастворимые полимеры - полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, поливинилпирролидон [7, 11], акриламидные полимеры, полимеры акриловой и метакриловой кислот, [8], поливиниловый спирт (ПВС) [10, 12], также циклические олигосахариды, например β-циклодекстрины [2, 9]. Молекула циклодекстрина состоит из нескольких глюкозидных колец, соединенных в одно большое кольцо. Циклодекстрины легко взаимодействуют с органическими молекулами с образованием комплексов включения - комплексов, в которых органическая гидрофобная молекула находится внутри молекулы циклодекстрина. Такие комплексы являются гидрофильными из-за внешней гидрофильной сферы молекулы циклодекстрина.

Все эти ПАВ позволяют создать устойчивую дисперсионную систему ТМБ и поддерживать ее стабильность в течение длительного времени, что дает возможность использовать данную композицию в качестве готового коммерческого продукта. Однокомпонентность субстрата позволяет избежать стадии смешивания двух компонентов субстрата перед проведением анализа, что сокращает время проведения анализа. Отсутствие токсичных и летучих органических растворителей и неканцерогенность 3,3',5,5'-тетраметилбензидина создает безопасность здоровью и окружающей среде при работе с данным субстратом. Высокая стабильность и однокомпонентность субстрата обеспечивает его готовность к использованию в качестве коммерческого реагента. Готовность реагентов к использованию является особенно удобным для диагностических лабораторий, выполняющих ежедневно небольшое количество анализов, и позволяет осуществить значительную экономию всех используемых реагентов в составе диагностического набора.

В качестве прототипа выбрана композиция для хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с перекисью водорода, готовая к использованию, в которой в качестве основных ингредиентов выступают гидроксипропил-β-циклодекстрин (ГПβЦ) (0,004-0,01 г/л) и лиофильная добавка - 1,2,6-тригидроксигексан (0,042-0,6 г/л) [13].

Задачей изобретения является создание композиции для хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида с пероксидом мочевины (ПМ), которое заключается в подборе двух видов компонентов: ПАВ для создания устойчивой дисперсии и антиоксидантов для предотвращения протекания окислительных процессов в водном растворе ТМБ и пероксида мочевины.

Данная задача решается предлагаемой композицией. К ее основным компонентам относятся поливиниловый спирт, гидроксипропил-β-циклодекстрин, глицерин (ГЛ), моногидрат орцина (МО), гидрохлорид 2-меркаптоэтиламина (2-МЭА) в среде 0,1 М цитратного буфера рН 3,8.

Гидрофильные комплексы включения молекулы 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с молекулой гидроксипропил-β-циклодекстрина распределяются в сетку геля, образованной из полимерных цепей поливинилового спирта и создают лиофильную коллоидную систему.

Глицерин вводится в систему в качестве лиофильной добавки, позволяющей повысить устойчивость дисперсии, предотвращая ее расслаивание.

Гидрохлорид 2-меркаптоэтиламин и моногидрат орцина использовали в качестве антиоксидантов, которые реагирует со свободными радикалами, и предотвращают окисление молекул 3,3',5,5'-тетраметилбензидина.

Для предотвращения негативного влияния микрофлоры среды на стабильность препарата в качестве антибактериального средства в субстратную смесь добавляют проклин 150 (ПР150). Содержание проклина 150 в смеси не превышает 0,05 г/л, поскольку большее его количество оказывает ингибирующее воздействие на пероксидазу.

Использование предлагаемой композиции позволяет хранить субстратный раствор для определения пероксидазы на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида с пероксидом мочевины, в готовом для использования виде.

Изобретение поясняется примером.

Пример

Растворы субстратов готовят последовательным добавлением поливинилового спирта, гидроксипропил-β-циклодекстрина, глицерина, проклина 150, гидрохлорида 2-меркаптоэтиламина, моногидрата орцина, гидрохлорида 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, пероксида мочевины в водный раствор нитратного буфера рН 3,77 с разным соотношением концентраций (таблица 1, 2). Активность раствора ТМБ определяется ферментативной активностью конъюгата антивидовых антител с пероксидазой из корней хрена (АТ-Пх) (концентрация конъюгата 1×10^-8 M определяется по его ферментативной активности), и измеряется фотометрически следующим образом. В лунку 96-луночного полистиролового планшета, сенсибилизированного кроличьими антителами, вносят по 100 мкл раствора конъюгата, инкубируют в течение 1 часа при Т=37°С и далее промывают фосфатным буфером рН 7,4. Затем вносят по 100 мкл образца субстратного раствора, и инкубируют его в течение 15 минут. В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление 3,3',5,5'-тетраметилбензидина дигидрохлорида в продукт, имеющий синюю окраску. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,2 М раствора серной кислоты и измеряют оптическую плотность раствора в лунке при λ=450 нм.

Первоначальная активность растворов субстратов ТМБ представлена в таблице 1.

Выбранные образцы термостатируют при Т=37°С в течение 30 дней и измеряют в них активность субстрата ТМБ по мере инактивации способом, описанным выше.

Отношение активности ТМБ в данный момент времени инактивации к его первоначальной активности характеризует относительную активность раствора ТМБ (таблица 2).

Список литературы

1. Патент США №4596770, 1986.

2. Патент США №5792618, 1998.

3. Патент США№5006461, 1991.

4. Патент США №5013646, 1991.

5. Патент США №5176999, 1993.

6. Патент Канада №1290661, 1991.

7. Патент США №4615972, 1986.

8. Патент США №5047318, 1991.

9. Патент Канада №1277895, 1990.

10. Патент Канада №1281644, 1991.

11. Патент США №4615972, 1986.

12. Патент США №6221624, 2001.

13. Патент США №5792618, 1998.

Таблица 1.
Содержание веществ в образцах, г/л	Первоначальная активность субстрата ТМБ, D450
ТМБ	ПМ	ПР150	ПВС	ГПβЦ	ГЛ	2-МЭА	МО
0,12	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	0,828
0,16	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	1,12
0,18	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	1,413
0,2	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	1,685
0,26	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	1,9
0,32	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,265
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,413
0,38	0,4	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,642
0,38	0,645	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,587
0,38	0,89	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,524
0,38	1,137	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,264
0,38	1,382	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	2,031
0,38	1,626	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	1,791
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	125	0,0073	0,007	1,856
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	250	0,0073	0,007	0,785
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	500	0,0073	0,007	0,407
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	-	0,007	2,98
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0146	0,007	1,742
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0219	0,007	1,145
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0292	0,007	0,736
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	-	2,782
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,0045	2,629
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,01	2,299
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,015	2,052
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,0045	2,629
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,01	2,299
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,015	2,052

Таблица 2.
Содержание веществ в образцах, г/л	Относительная активность субстрата ТМБ, %
	Время, дни
ТМБ	ПМ	ПР150	ПВС	ГПβЦ	ГЛ	2-МЭА	МО	0	7	14	21	31
0,38	0,157	-	1,28	2,56	-	-	-	100	20	7	3	1
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	-	-	-	100	20	17	13	10
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	-	-	100	45	36	20	15
0,38	0,4	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	100	90	87	83	78
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	-	100	90	88	85	75
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,0045	100	92	89	87	80
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	0,0073	0,007	100	96	95	90	87
0,38	0,157	0,05	1,28	2,56	62,5	-	0,007	100	60	54	49	40

1. Композиция для хранения водного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида и пероксида мочевины, содержащая гидроксипропил-β-циклодекстрин и лиофильную добавку, отличающаяся тем, что в состав композиции входит поливиниловый спирт, проклин 150, гидрохлорид 2-меркаптоэтиамина, а в качестве лиофильной добавки используют глицерин при следующем содержании компонентов: 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида 0,1-0,4 г/л; пероксида мочевины 0,1-1,7 г/л; гидроксипропил-β-циклодекстрина 2-5 г/л; поливинилового спирта 1-4 г/л; проклина 150 0,05 г/л; гидрохлорида 2-меркаптоэтиламина 0,007-0,03 г/л; глицерина 62-500 г/л; в среде цитратного буфера с рН 3,77.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 0,004-0,02 г/л моногидрата орцина.