Способ получения рабочих стандартов сывороток, содержащих ay и ad субтипы hbsag

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg. Сущность изобретения состоит в том, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, факторов неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование высоконцентрированных препаратов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (5-10 МЕ/мл) AY и AD субтипов. Техническим результатом является изготовление двух рабочих стандартов сывороток, содержащих AY и AD субтипы HBsAg, сохраняющих специфические характеристики этих образцов в течение длительного времени при хранении от 2 до 6°С. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg.

Рабочий стандарт (PC) - это референс-препарат, который предназначен:

1. Для приготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg.

2. Для использования в качестве полуфабрикатов стандартных препаратов с низкой концентрацией HBsAg.

Известен референс-препарат ОСО (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) для контроля диагностики гепатита В [1].

Недостатком его является то, что он изготовлен на основе неизвестного субтипа HBsAg и не позволяет эффективно контролировать образцы крови, т.к. его активность не может быть отнесена к определенному субтипу или генотипу HBV. Кроме того, одним препаратом невозможно решать проблемы контроля качества выполнения анализов в клинических диагностических лабораториях.

Наиболее близким (прототипом) является рабочий стандарт (working standard) AD субтипа (генотипа А), которые изготовляют в NIBSC и используют для контроля качества выполнения анализов на HBsAg в диагностических лабораториях инфекционных клиник и в центрах переливания крови Великобритании [2].

Британский PC приготовили следующим образом.

Используется сыворотка бессимптомного больного, который являлся носителем ВГВ (генотипа А) в течение, по крайней мере, 7 лет. Сыворотку разводят в соотношении 1:4 в воде для инъекций и последовательным нагреванием при температуре 60°С в течение 10 ч минимизируют инфекционность. Пастеризованную сыворотку разводят в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 5% БСА и 0,1% азид натрия, и разливают по ампулам по 1 мл и хранят при температуре -20° и ниже.

Этому материалу в институте стандартов NIBSC (Potter Bar, UK) присвоили статус Британского стандарта AD субтипа со специфической активностью 100 British U/ампула.

Недостатками этого препарата являются:

1. Для изготовления PC используется модельный раствор (5% БСА), а не истинная человеческая сыворотка.

2. Используется только один субтип HBsAg - (AD).

Задачей изобретения является создание такого способа, который обеспечивал бы изготовление 2-х рабочих стандартов сывороток, содержащих AY и AD субтипы HbsAg, и позволил сохранить специфические характеристики этих образцов в течение длительного времени (не менее 1 года) при хранении от 2 до 6°С.

Поставленная задача решается изготовлением рабочих стандартов сывороток (PC), содержащих AY и AD субтипы HBsAg в концентрации от 5 до 10 МЕ/мл и имеющих вязкость, равную вязкости нормальной сыворотки человека (НЧС).

Схема изготовления Рабочих стандартов HBsAg субтипов AY и AD

1. Тестирование образцов донорских сывороток с помощью лабораторного стандарта HBsAg для изучения величины подавления аналитического сигнала от введенного количества HBsAg. Стандарт лаборатории (СЛ) - стабилизированный плазменный HBsAg, оттитрованный в российских и зарубежных тест-системах. Из донорских сывороток с минимальным уровнем подавления готовят разводящий раствор (РР).

2. Титрование препаратов HBsAg AY и AD субтипов в приготовленном РР вместе с ОСО Минздрава (производство "Диагностические системы", НН) и международными стандартами - NIBSC (Англия) - AD субтипа или института П.Эрлиха (ФРГ) - AY субтипа в различных тест-системах.

3. Определение коэффициента разведения для каждого субтипа для получения кандидата PC с концентрацией HBsAg 5-10 ME/ml.

4. Приготовление кандидатов PC AY и AD субтипов (в количестве 30-50 экземпляров каждого).

5. Определение концентрации HBsAg в PC по результатам ИФА в разных тест-системах в разных лабораториях.

6. Приготовление сухой стабилизированной формы кандидатов PC методом лиофилизации.

7. Проведение теста термодеградации кандидатов PC при повышенных температурах для определения срока годности.

8. Сертификация кандидатов PC в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Для установления взаимосвязи между аналитическим сигналом ИФА и массовой концентрацией HBsAg в растворе необходимо:

- изучить и привести в соответствие фракционно-дисперсный состав (ФДС) международного стандарта и тестируемого препарата;

- использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 1,5 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл демонстрируют прямолинейную связь между оптической плотностью и количеством HBsAg в растворе.

Для аттестации массовой концентрации препарата HBsAg в PC необходимо подбирать международный стандарт с идентичным ФДС. Различие ФДС референс-препаратов может объяснить тот факт, что коэффициенты пропорциональности между стандартами, используемыми в производстве тест-систем, не согласуются друг с другом. Испытания стандартов, проведенные под эгидой ВОЗ, показали, что 1 IU ВОЗ эквивалентна 0,584 единиц стандарта ин-та П.Эрлиха или эквивалентна 5,587 нг Abbott [3, 4]. Для оценки ФДС препаратов HBsAg, использованных при изготовлении национальных стандартов, применяют методы электронной микроскопии и атомной силовой микроскопии.

Важной проблемой при использовании HBsAg тест-систем в клинических диагностических лабораториях является правильность результатов анализа. Основным критерием правильности результатов серологического анализа служит аттестованное значение аналитического сигнала (например, ОП в ИФА) для каждой серии рабочего стандарта. Кандидаты PC титровали в различных матриксах: НЧС, 5% БСА и фетальная сыворотка относительно физиологического раствора с добавкой 0,2% казеина.

Материалы для изготовления PC

1. Разводящие растворы

В качестве РР используют следующие растворы:

- Нормальная человеческая сыворотка (НЧС);

- Раствор 5,5% БСА в 0,05 М фосфатно-солевом буфере (0,15 М NaCl) - ФСБ;

- Раствор 5,5% триптона в ФСБ;

- Раствор 0,2% казеина в ФСБ.

2. Тест-системы для выявления HBsAg

3. Стандартные препараты HBsAg

Далее следуют примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Забор и предварительный анализ сывороток крови. Свежеприготовленную кровь из вены заливают в гемаконы, содержащие 0.12 мл 0.34 М ЭДТА, чтобы конечная концентрация ЭДТА составила 2 мМ (20 мл). Прямое разделение цельной крови проводят центрифугированием при 1000g в течение 15 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость - сыворотку декантируют в стерильную посуду, визуально отбраковывают и хранят до использования в замороженном состоянии. Для приготовления стандартов используют прозрачные сыворотки с янтарным оттенком. Мутные и хилезные образцы отбраковывают.

Детекция ДНК ВГВ. ДНК ВГВ выявляют в образцах пула донорских сывороток и в плазменных препаратах при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано [5].

Анализ донорских сывороток включает:

1. Определение общего содержания белка.

2. Прозрачность и цветность.

3. Концентрация ионов водорода.

4. Сыворотки доноров анализируют на наличие анти-ВИЧ, анти-ВГС, анти-HBs и антител к сифилису и на HBsAg с использованием сертифицированных коммерческих тест-систем.

Для сертификации образцов PC дополнительно используют тест-системы: "HBsAg EIA Plus" (далее "HBsAg EIA") (Labsystems, Финляндия); "HBsAg/M" (Диагностические системы, Н. Новгород) и "Monolisa Ag HBs 2eme generation" (далее "Monolisa Ag HBs") (Sanofi Pasteur, Франция) [6].

Препараты HBsAg. Для приготовления рабочего стандарта субтипа AY используют плазменный очищенный HBsAg производства НПК "Препарат" (г. Нижний Новгород, РФ) (0.4 мг/мл, субтип AYw). В соответствии с паспортными данными содержание основного белка в препаратах превышает 95%, а примеси других белков в сумме не превосходят 1%.

В качестве препаратов AD субтипа HBsAg используют высокоочищенные плазменные или рекомбинантные белки, применяемые при изготовлении вакцин против гепатита В:

- Плазменный очищенный и концентрированный HBsAg, наработанный из пула сывороток инфицированных пациентов AD субтипа (GLD's Ltd., Singapore).

- Рекомбинантная (дрожжевая) вакцина субтипа ADW "H-B VAX II" производства компании "Merck Sharp&Dohme Haarlem" (Голландия), 10 мкг/мл. В качестве примесей вакцина может содержать менее 1% дрожжевого белка. Выделение HBsAg из вакцинных препаратов проводят в условиях щадящей десорбции частиц HBsAg с сохранением их структуры в 0.4М фосфатном буфере. Десорбированные препараты аттестуют по фракционно-дисперсному составу (ФДС) и концентрации HBsAg.

Анализ чистоты препаратов HBsAg выполняют методами гель-хроматографии, электрофореза и атомной силовой микроскопии.

Референс-препараты HBsAg. Для выполнения аттестационных определений в работе используют стандартные препараты, аттестованные в абсолютных или в относительных единицах:

- Отраслевой стандартный образец "OCO-HBsAg" (ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва).

- Международный стандарт ВОЗ, код 80/549 ADW субтипа HBsAg, 100 IU/ml (NIBSC, UK).

Приготовление пула донорских сывороток. Из нативных сывороток крови, не содержащих маркеры вирусных инфекций, готовят пул не менее чем от 10 доноров.

Стабилизатор, включающий сахарозу, KCl, и Na-соль ЭДТА, добавляют в сухом виде при постоянном перемешивании в каждый пул с постоянным контролем вязкости раствора.

Стабилизированный пул сывороток используют в качестве разводящих растворов для приготовления PC субтипов AD и AY. Доводят рН раствора до 6.8-7.2 при комнатной температуре с помощью 0.1 N NaOH или 0.1 N HCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0.012% от массы раствора и гентамицин в количестве 0,02% w/v. Растворы разливают стерильно в емкости по 250-500 мл и хранят при 2-8°С в течение не более 1 месяца. В замороженном виде, при температуре ниже минус 30°С, растворы можно хранить в течение 1 года.

Стабилизированный пул сывороток нормализуют по общему белку и вязкости относительно донорской сыворотки человека и получают разводящий раствор - PP. Контроль вязкости РР проводят с использованием стеклянного вискозиметра по классической методике с использованием калиброванного капилляра.

Приготовление образцов PC. Стабилизованный пул сывороток (РР) разделяют на 2 равные части: одну часть использовать для приготовления PC AY субтипа. Вторую часть используют для приготовления PC субтипа AD. Расчетное количество препаратов HBsAg, которые необходимо внести в РР для получения концентрации 5-10 МЕ/мл, определяют по кривым ИФА титрования AY и AD препаратов в РР одновременно с титрованием стандартных препаратов тех же субтипов.

Всего таким образом готовят 30-50 образцов-кандидатов PC.

Розлив и лиофилизация PC образцов. Приготовленные образцы PC фильтруют последовательно через 1.2 мкм фильтры для удаления дебриса и нерастворимых примесей стабилизатора, а затем через 0,45 мкм - для удаления микроорганизмов из растворов. Разливают по 800 мкл каждого PC во флаконы ФИ-5 при постоянном перемешивании для создания гомогенных условий в каждом флаконе. После розлива PC немедленно замораживают при температуре ниже -30°С.

Режим лиофилизации для выбранного состава стабилизатора подбирают по специально разработанной методике [7].

Испытания стабильности. Флаконы с лиофилизированными образцами PC выдерживают в термостатированных условиях при 37°С и 50°С, так как при температурах выше 56°С резко ухудшается растворимость таблеток. Через фиксированные промежутки времени часть флаконов изымают из термостатов и хранят при минус 20°С до тех пор, пока вся серия испытаний стабильности не будет завершена.

Образцы PC, выдержанные при разных температурах разное время, анализируют одновременно с образцами, все время простоявшими при минус 20°С (точка отсчета). Дополнительно следует тестировать сохранение свойств PC в жидком состоянии при хранении при 4°С в течение не менее 3-х месяцев.

Результаты измерения активности PC приведены в таблице 1.

Таблица 1 Уменьшение активности PC после хранения при разных температурах.
Время хранения, сутки	Активность PC в процентах	Логарифм активности PC
50°С	37°С	50°С	37°С
1	2	3	4	5
0	100	100	4,60	4,6
7	94,0	97,5	4,54	4,58
14	88,4	94,9	4,48	4,55
30	76,8	89,5	4,34	4,49
162	24,1	55,0	3,18	4,01

В данной таблице 1 в графе 1 указано время хранения PC в сутках. Исходное значение активности в момент времени 0 суток принято за 100%. В графах 4-5 приведены натуральные логарифмы этих значений. Константу скорости дезактивации определяют как тангенс угла наклона прямой линии к оси абсцисс. Воспользовавшись этим, вычисляют константы скоростей, они оказываются равными 0,0037 1/сутки и 0,0088 1/сутки при температурах 37 и 50°С соответственно.

Условием стабильности будет предельное изменение активности PC не более чем на 10% от исходной величины. В этом приближении время хранения препарата составит

T=2,303·log(100/90)/K=369,7 дней или 1,03 года

Стабильность препаратов PC в жидком и лиофильном состояниях определяют термостатированием при повышенных температурах и в 3-кратном цикле замораживание-оттаивание.

По результатам теста ускоренной инактивации срок годности PC при 4-6°С составляет 1 год.

Пример 2. Экспертный отбор тест-систем

Используя метод разведения препаратов HBsAg для изготовления PC необходимо учитывать три основных фактора:

- эффективность диагностикума по отношению к AD и AY субтипам HBsAg,

- возможность подавления аналитического сигнала HBsAg в нативных сыворотках абсолютно здоровых доноров,

- исходную чистоту препаратов HBsAg, используемых для приготовления PC.

Для выполнения экспертизы по оценке эффективности тест-систем "Вектор Бест" и "БиАльгам" готовят два рабочих стандарта AD и AY субтипов разведением препаратов HBsAg в одинаковом РР, аттестованном по величине подавляющего эффекта. РР готовят из пула 9-10 донорских сывороток, каждая из которых показывает подавление аналитического сигнала в ИФА не более чем на 10%. После гомогенизации пула и введения компонентов стабилизатора

Рабочий стандарт AY субтипа готовят из плазменного AYW1-2 HBsAg (Н.Новгород) и

рабочий стандарт AD субтипа HBsAg (образец №10) готовят из плазменного ADW HBsAg компании "GLD's" (Singapore).

Аттестацию рабочих стандартов по концентрации HBsAg проводят при совместном титровании образцов PC и ОСО (20 МЕ/ампула) и с международным стандартом ADW субтипа HBsAg (100 IU/ампула, NIBSC).

Для определения специфических характеристик PC их титруют в различных буферных растворах (матриксах), т.к. в разных тест-системах используют разные РР. В таблице 2 приведены результаты титрования кандидатов PC обоих субтипов в растворах НЧС с добавками триптона и БСА качестве стабилизаторов.

Табл. 2. Концентрация кандидата PC AY субтипа по результатам ИФА в двух тест-системах
Буфер	"Рекоматгеп В" Биальгам МЕ/мл	"Рекоматгеп В" Вектор Бест МЕ/мл
0,2% казеин в 0,05 М ФСБ	7,1	6,53
Фетальная Сыворотка	11,69	8,22
5% р-р БСА в 0,05 М ФСБ	13,31	7,71
Среднее значение	10,7 +/- 3,2	7,49 +/- 0,88
Стандартный образец	СЛ, 16 МЕ/мл	ОСО, 20 МЕ/ампула

В данной таблице каждый производитель использует собственный стандарт для оценивания концентрации HBsAg. Как следует из таблицы, такой подход соответствует концентрации HBsAg, которая отличается почти в 1,5 раза.

Экономическая целесообразность набора рабочих стандартов заключается в том, что они могут быть использованы в одновременной аттестации тест-систем для выявления HBsAg в малых концентрациях и одновременно различных субтипов. В диагностических лабораториях PC могут использоваться в форме шифрованной пробы для контроля качества выполнения анализов сотрудниками лаборатории.

Источники информации

1. ОСО HBsAg Инструкция по применению, 1999 г.

2. Ferguson М., Pipkin PA, Heath AB, Minor PD: Working standards for hepatitis В surface antigen for use in the UK Blood Transfusion Service: Results of a collaborative study.//Vox Sang 1993, 65: 303-309.

3. J.A.J.Barbara. Questions of quality: how much HBsAg is there in this sample and is our assay sensitive enough to detect it? Vox sang 1993:65:249-250

4. M. Ferguson, A. Heath. WHO Working Group on Hepatitis and HIV Diagnostic Kits. WHO, Geneva, October 3-5,2003.

5. Larzul D., Guige P., Sninsky J.J. et al -Detection of hepatitis В virus sequences in serum by using in vitro enzymatic amplification. J. Virol. Methods 1988, 20, 227-237.

6. MONOLISA Ag HBs 2eme generation. Инструкция по использованию. Kit for detection of the surface antigen of hepatitis В by the enzyme immunoassay technique. Sanofi Pasteur, 1990.

7. Канев А.Н., Гутова Е.А., Шалаев Е.Ю. и др. Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов. - Пат. №048529, 1996. РФ.

1. Способ получения рабочих стандартов сывороток AY и AD субтипов HBsAg, включающий отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, разведение препарата HBsAg в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности рабочих стандартов, отличающийся тем, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, факторов неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование высоконцентрированных препаратов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (5-10 МЕ/мл) AY и AD субтипов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения разводящего раствора используют пул 9-10 донорских сывороток, каждая из которых показывает подавление аналитического сигнала HBsAg в ИФА не более чем на 10%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препарата HBsAg используют плазменные очищенные и/или рекомбинантные антигены, принадлежащие к различным субтипам HBsAg и содержащие не менее 95% основного белка (антигена), причем каждый положительный образец панели в жидком состоянии имеет вязкость, равную средней вязкости пула сывороток здоровых доноров.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовленные рабочие стандарты сывороток лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.%.