Комбинированные композиции, содержащие экстракты из растений и морских животных
Группа изобретений относится к медицине, точнее к косметологии, и касается композиции по уходу за кожей. Композиция, которая содержит хрящевой экстракт, экстракт из семян винограда и экстракт из томатов, обладает антиоксидантным действием и ингибирует образование свободных радикалов. Композиция, которая содержит гидрофильный антиоксидант, липофильный (гидрофобный) антиоксидант и хрящевой экстракт, способствует резкому увеличению синтеза коллагена в коже. Указанная композиция способствует снижению коллагеновой активности и уровней конечных продуктов прогрессирующего гликозилирования (AGE). Композиции настоящего изобретения предназначены для лечения стареющей кожи и для замедления появления признаков старения здоровой кожи. 6 н. и 34 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 ил.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям для перорального введения, содержащим хрящ или соединения, экстрагируемые из хряща, а также гидрофильные и липофильные антиоксиданты.
Предпосылки создания изобретения
Свободные радикалы образуются в организме, например в коже, под действием УФ-излучения, загрязняющих веществ, алкоголя и т.п. Избыток свободных радикалов может вызывать серьезные повреждения структуры ткани, включая структуру кожи, и тем самым приводить к появлению признаков старения кожи.
Поэтому для ослабления действия окислительного стресса в коже, вызываемого свободными радикалами, используются комбинации гидрофильных и липофильных антиоксидантов (Maffei Facino et al., "Free Radical Scavenging and Anti-enzyme Activities of Procyanidines from Vitis vinifera" Arzneim.-Forsch/Drug Res., 44(1), Nr.5 (1994), pp.592-601).
В патенте США № 5648277 описаны композиции для перорального введения, содержащие гидрофильные и липофильные антиоксиданты.
В JP 09241637 описаны композиции, содержащие акцептор активных свободных радикалов и уроновые кислоты или мукополисахариды.
Было также установлено, что введение белковых комплексов, содержащих мукополисахариды, полученные из хряща морских животных, способствуют улучшению структуры дермального слоя кожи, что придает ей более высокую плотность и твердость (Kieffer M.E., Efsen J., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 1998, Sep; 11(2):129-136).
Краткое описание изобретение
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что уникальная комбинация хрящевого экстракта со специальной смесью растительного экстракта позволяет получить эффективную композицию для увеличения синтеза коллагена в коже, а также для снижения значительного уровня радикалов, опосредующих окисление в коже. Как снижение синтеза коллагена, так и радикальное окисление ассоциируются с процессом старения кожи.
В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для перорального введения, включающей растительный экстракт и хрящевой экстракт, где растительный экстракт включает экстракт из семян винограда и экстракт из томатов.
В качестве альтернативы настоящее изобретение относится к композиции для перорального введения, включающей растительный экстракт и хрящевой экстракт, где растительный экстракт включает экстракт из семян винограда и ликопен в массовом отношении от примерно 5:1 до 15:1, предпочтительно примерно 10:1.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для перорального введения, содержащей (i) хрящ, одно или несколько соединений, экстрагируемых из этого хряща, или их производные; (ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов и (iii) один или несколько липофильных антиоксидантов, где указанная композиция увеличивает синтез коллагена в клеточной модели, по крайней мере, на 35%.
Еще один аспект настоящего изобретения включает композицию, определенную в настоящем описании и предназначенную для общего ухода за здоровой кожей, для замедления развития дегенерации кожи, обусловленного ее старением и УФ-облучением, и для устранения признаков старения кожи.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего изобретения термин "гидрофильный", относящийся к гидрофильному антиоксиданту, в основном означает, что данный антиоксидант является в достаточной степени растворимым в водной среде организма, а поэтому он способен функционировать в данной среде. В контексте настоящего изобретения антиоксидант считается гидрофильным, если его растворимость в воде составляет выше 0,05 г на 100 г воды. Гидрофильный антиоксидант имеет растворимость в воде предпочтительно выше 0,5 г, более предпочтительно выше 1 г, а в частности выше 5 г, более предпочтительно выше 10 г, наиболее предпочтительно выше 25 г, а особенно предпочтительно выше 50 г, например выше 100 г на 100 г воды.
Аналогичным образом термин "липофильный", относящийся к липофильному антиоксиданту, в общих чертах означает, что данный антиоксидант является в достаточной степени растворимым в липидной среде организма, а поэтому он способен функционировать в данной липидной среде. Это также означает, что антиоксидант считается липофильным, если его растворимость в воде составляет ниже 0,05 г на 100 г воды. Липофильный антиоксидант имеет растворимость в воде предпочтительно ниже 0,005 г, а более предпочтительно ниже 0,0005 г на 100 г воды.
Термин "хрящевой экстракт" означает хрящ, компоненты, которые могут быть из него экстрагированы, и их производные, включая синтетические формы соединений, экстрагируемых из хряща и синтетически полученные производные. Соединения, называемые "хрящевым экстрактом", могут также обнаруживаться в другой соединительной ткани, например в коже или в шкуре животного, и могут быть экстрагированы из них. Такой хрящ может быть выбран из группы, состоящей из хряща морских животных, хряща рыб, хряща моллюсков и хряща млекопитающих, обитающих на суше. Морские животные могут быть выбраны из группы, состоящей из кита, дельфина и тюленя; рыба может быть выбрана из группы, состоящей из акулы, лосося, тунца, трески и других известных рыб; моллюском может быть кальмар; а млекопитающие, обитающие на суше, могут быть выбраны из группы, состоящей из коровы, свиньи, курицы, утки и индейки. Хрящ или экстракты из него предпочтительно выбирают из хряща коровы, хряща свиньи, хряща акулы, хряща кальмара, хряща курицы и хряща лосося и из экстрактов этих хрящей.
При этом может быть использован и сам хрящ. Обычно он используется в высушенной форме, например, в виде лиофилизованного измельченного хряща. Используемые экстракты из хряща вышеупомянутого типа или из другой ткани, содержащей соответствующие компоненты, могут быть в основном получены путем частичного ферментативного протеолитического гидролиза приготовленной ткани с последующей фильтрацией и сушкой гидролизата, например путем сушки распылением или путем лиофилизации. Такие экстракты имеют то преимущество, что они являются частично или полностью растворимыми в водных средах (полученных, как описано в патенте США 3862003).
Хрящевой экстракт обычно включает одно или несколько соединений, экстрагируемых из хряща, а предпочтительно гликозаминогликаны, необязательно связанные с пептидом. Хрящевой экстракт предпочтительно включает сульфат хондроитина, сульфат кератана, гиалуроновую кислоту, сульфат дерматана или их смеси. Термин "хрящевой экстракт" означает соединения, экстрагируемые из хряща, но фактически такие соединения могут быть получены и из других источников. А особенно предпочтительным источником хрящевого экстракта является хрящ акулы.
Термин "хрящевой экстракт" может относится к соединениям, экстрагируемым из хряща, или к их производным. Как было установлено, хрящевой экстракт может происходить от других природных источников, но он может быть получен из синтетического источника, то есть приготовлен синтетически или полусинтетически. Хрящевой экстракт получают предпочтительно из природного источника, а наиболее предпочтительно, если этот экстракт получают из хряща, при этом особенно предпочтительным является экстракт из хряща.
Как указывалось выше, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для перорального введения, содержащей растительный экстракт и хрящевой экстракт, где указанный растительный экстракт включает экстракт из семян винограда и экстракт из томатов в массовом соотношении от примерно 2:1 до 1:2, а предпочтительно примерно 1:1. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что уникальная комбинация хрящевого экстракта с определенной смесью растительного экстракта позволяет получить эффективную композицию для увеличения синтеза коллагена в коже, а также для снижения значительного уровня воздействия УФ-излучения и окислительного стресса, такого как радикальное окисление, ассоциируемое с процессом деградации в коже.
Было неожиданно обнаружено, что благоприятное действие комбинации экстракта из семян винограда и экстракта из томатов, используемых в качестве антиоксидантов, значительно усиливается при добавлении хрящевого экстракта. Эти результаты были неожиданными отчасти потому, что хрящевой экстракт сам по себе не обладает антиоксидантной активностью.
В основном хрящевой экстракт и растительный экстракт присутствуют в массовом отношении от примерно 1:2 до 2:1, а предпочтительно примерно 1:1.
Хрящевой экстракт предпочтительно включает гликозаминогликаны, выбранные из группы, состоящей из сложного эфира хондроитина, сложного эфира кератана, гиалуроновой кислоты или ее сложного эфира, сложного эфира дерматана, гепарина, сложного эфира гепарана. Они могут быть связаны с белком или пептидом, либо они могут присутствовать в виде эпимерных или полимерных форм сложного эфира хондроитина, сложного эфира кератана, гиалуроновой кислоты или ее сложного эфира, сложного эфира дерматана, гепарина, сложного эфира гепарана, а предпочтительно сульфата хондроитина, сульфата кератана, гиалуроновой кислоты или ее сложного эфира, сульфата дерматана, гепарина, сульфата гепарана.
Гликозаминогликаны могут быть выбраны из группы, состоящей из хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата и сульфата кератана, каждый из которых может быть, но необязательно, связан с пептидом. Наиболее предпочтительно композиция настоящего изобретения включает хрящевой экстракт, содержащий сульфат хондроитина, необязательно связанный с пептидом.
В типичном варианте осуществления настоящего изобретения хрящевой экстракт содержит 5-100 мас.% сульфата хондроитина.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция настоящего изобретения содержит менее чем 1 мас.% коллагена, предпочтительно, менее, чем 0,5%, а особенно предпочтительно, менее, чем 0,1 мас.% белка коллагена. При получении коллагенового экстракта обычным способом этот экстракт не содержит коллаген в каком-либо значительном количестве. Такой экстракт предпочтительно получают путем ферментативного протеолитического гидролиза, что позволяет расщеплять коллагеновые белки на пептиды. Было обнаружено, что композиция, содержащая указанный экстракт с низким уровнем коллагена, обладает неожиданным благоприятным действием. Поэтому в композицию настоящего изобретения можно и предпочтительно не добавлять коллаген или его источник. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная композиция в основном не содержит коллагена.
Аналогичным образом композиция настоящего изобретения обычно содержит менее чем 0,025% бета-каротина, предпочтительно менее чем 0,02% бета-каротина, а более предпочтительно менее чем 0,01% бета-каротина. Таким образом, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая позволяет достичь благоприятного эффекта, описанного ниже, с использованием очень небольшого количества или вообще без использования бета-каротина.
В противоположность этому недавно было установлено, что относительное или абсолютное содержание ликопена имеет особенно важное значение для неожиданно обнаруженного благоприятного эффекта композиции настоящего изобретения. Растительный экстракт, а особенно экстракт из томатов содержит ликопен. Экстракт из томатов предпочтительно содержит примерно от 5 до 12 мас.%, а обычно 10 мас.% ликопена. Такой томатный экстракт может получен из одного вида томата или из смеси томатов.
В типичном варианте осуществления изобретения видом томата, используемым для получения томатного экстракта, является Lycopersicum aesculentum, который позволяет получить подходящие абсолютные и относительные уровни ликопена.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная композиция включает 0,1-5 мас.% ликопена, предпочтительно, 0,2-4% ликопена, например 0,3-2% ликопена, наиболее предпочтительно 0,3-1% ликопена, а в частности 0,3-0,8%, например 0,3-0,6%.
В альтернативном варианте композиции настоящего изобретения композиция включает растительный экстракт и хрящевой экстракт, где растительный экстракт содержит экстракт из семян винограда и ликопен в массовом отношении примерно от 5:1 до 15:1, а предпочтительно примерно 10:1. Как указывалось выше, в соответствии с основной концепцией настоящего изобретения ликопен, используемый в указанном соотношении, имеет очень важное значение для достижения неожиданного благоприятного антиоксидантного эффекта.
В подходящем варианте осуществления изобретения антиоксидантная активность IC50 липофильного антиоксиданта составляет менее чем 1,2·10-7, для акцептирования радикалов R*/ROO* при липидном перокислении ненасыщенного фосфолипида в водной среде. Обычно липофильным антиоксидантом, обладающим антиоксидантной активностью IC50, составляющей самое большее 1,2·10-7, для акцептирования радикалов R*/ROO* при липидном перокислении ненасыщенного фосфолипида в водной среде является каротеноидное соединение ликопен (также называемый ψ,ψ-каротином). Ликопен может быть получен в основном путем экстракции из некоторых свежих плодов, таких как томаты, арбуз, красный грейпфрут или гуава, способом, известным per se, либо он может быть получен путем синтеза известным способом.
Благоприятное действие пероральной композиции настоящего изобретения обусловлено новой комбинацией трех компонентов: хрящевого экстракта, экстракта из семян винограда и томатного экстракта. Экстракт из семян винограда позволяет получить гидрофильные антиоксиданты. Томатный экстракт позволяет получить липофильные антиоксиданты. Таким образом, настоящее изобретение относится к новой комбинации антиоксидантов с соединениями, экстрагируемыми из хряща. В другом своем аспекте настоящее изобретение также относится к композиции для перорального введения, содержащей i) хрящ; одно или несколько экстрагируемых из него соединений или их производные; ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов и iii) один или несколько липофильных антиоксидантов, где указанная композиция способствует увеличению синтеза коллагена, по крайней мере, на 35%, как определено в Методе испытаний А.
Синтез коллагена способствует заметному снижению степени старения клеток кожи. Снижение уровня коллагена в коже приводит к изменению структуры или реологических свойств кожи и к появлению типичных признаков старения кожи, таких как морщины, пониженная гладкость кожи, потеря упругости и плотности кожи.
Как показано в примере 2, композиция настоящего изобретения по сравнению с другими комбинациями и отдельными компонентами приводит к неожиданно резкому увеличению синтеза коллагена. Синтез коллагена оценивают путем измерения включения радиоактивного пролина ([14С]-пролина) в пролин-содержащие белки, которые в основном рассматриваются как коллаген, где 30% от общего числа аминокислот составляет пролин.
У фибробластов дермального слоя кожи, культивированных в среде, содержащей комбинацию экстракта из семян винограда (G) и томатного экстракта (Т), GT (как описано в патенте США 5648277), уменьшен уровень включения пролина по сравнению с контролем: 3,6%-ное включение по сравнению с 4,8%-ным включением контроля, что соответствует уменьшению уровня на 25%. У клеточных культур в случае содержания комбинации рыбного экстракта (F) и томатного экстракта (Т), FT не оказывалось какого-либо значительного влияния на включение пролина, то есть степень его включения составляет 5,0% по сравнению с 4,8%-ным включением у контроля, что соответствует увеличению лишь на 4%. Клеточные культуры при содержании комбинации рыбного экстракта (F) и экстракта из семян винограда, FG обнаруживали небольшое увеличение включения пролина: 5,5%-ное включение, что соответствует 10%-ному увеличению включения пролина по сравнению с контролем. Клеточные культуры при содержании только рыбного экстракта (F) обнаруживали увеличение включения пролина: 6,2%-ное включение, то есть увеличение на 29%.
Однако клетки, культивированные в присутствии композиции настоящего изобретения, содержащей рыбный экстракт (F), экстракт из семян винограда (G) и томатный экстракт (Т), FGT, обнаруживали неожиданно резкое 80%-ное увеличение степени включения пролина (8,4%-ное включение пролина). Учитывая, что экстракт GT дает 25%-ное снижение синтеза коллагена, а экстракт F дает 29%-ное увеличение синтеза коллагена, то такое достижение 80%-ного увеличения синтеза коллагена после объединения F с GT является неожиданным.
Один или несколько гидрофильных антиоксидантов композиций настоящего изобретения могут быть получены из природных или синтетических источников, предпочтительно из природных источников. В типичном варианте осуществления изобретения указанный природный источник выбирают из группы, состоящей из сосновой коры Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus marianum, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum.
В подходящем варианте осуществления изобретения один или несколько гидрофильных антиоксидантов экстрагируют из семян винограда Vitis vinifera.
Природный источник одного или нескольких гидрофильных антиоксидантов обычно содержит вплоть до 25 мас.% катехина, эпикатехина и галловой кислоты; вплоть до 90 мас.% димера, тримера и/или тетрамера эпикатехина и/или его галлатов; и вплоть до 10 мас.% пентамера, гексамера и/или гептамера эпикатехина и/или его галлатов.
Один или несколько гидрофильных антиоксидантов могут быть выбраны из группы, состоящей из полифенолов и их сложных эфиров; аскорбиновой кислоты (витамина С) и ее сложных эфиров; и их фармацевтически приемлемых солей. Указанными полифенолами обычно являются катехины; лейкоантоцианидины и флаваноны; флаванины, флавоны и антоцианины; флавонолы; флавонолигнаны; и их олигомеры.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофильным антиоксидантом является катехин, выбранный из группы, состоящей из проантоцианина А2 и олигомерного процианидола (ОРС), а наиболее предпочтительно олигомерного процианидола.
Флавонолигнаны обычно представляют собой силимарин или один из его компонентов, такой как силибин, силидианин, силикристин и изосилибин.
В композиции настоящего изобретения гидрофильным антиоксидантом обычно является антиоксидант, обладающий антиоксидантной активностью IC50, составляющей самое большее 5·10-7 для акцептирования радикалов R*/ROO* при липидном перокислении ненасыщенного фосфолипида в водной среде.
Как указывалось выше, особенно предпочтительным гидрофильным антиоксидантом является экстракт из семян винограда, т.е. семян Vitis vinifera, причем указанный экстракт обычно получают путем экстракции из семян винограда с использованием органических растворителей, таких как ацетон и/или этилацетат или т.п., выпаривания растворителей, повторного растворения остатка в воде, фильтрации и сушки фильтрата, например путем сушки распылением или путем лиофилизации. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения такой экстракт обычно содержит вплоть до 25 мас.% катехина, эпикатехина и галловой кислоты; вплоть до 90 мас.% димера, тримера и/или тетрамера эпикатехина и/или его галлатов; и вплоть до 10 мас.% пентамера, гексамера и/или гептамера эпикатехина и/или его галлатов.
Один или несколько липофильных антиоксидантов могут быть также получены из природных или синтетических источников, обычно из природного источника. Липофильный антиоксидант может представлять собой смесь антиоксидантов, такую как экстракт из природного источника, содержащий сложную смесь липофильных антиоксидантов. Подходящим природным источником для липофильного антиоксиданата является томат определенного сорта, а в частности вида Lycopersicum aesculentum.
Указанными одним или несколькими липофильными антиоксидантами обычно являются каротеноиды, прокаротеноиды, токоферолы, фитостеролы и убихиноны. В качестве липофильных антиоксидантов особый интерес представляют каротеноиды, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из α-каротина, β-каротина, γ-каротина, δ-каротина, ликопена (ψ,ψ-каротина), зеаксантина, криптоксантина, лутеина и ксантофилла.
Как указывалось выше, каротеноидный ликопен является липофильным антиоксидантом, представляющим особый интерес. Наиболее предпочтительно, чтобы композиция настоящего изобретения содержала ликопен. Экстракты, служащие источниками липофильного антиоксиданата, предпочтительно содержат 5-12% ликопена, например 7-12% ликопена, а предпочтительно примерно 10% ликопена. Иначе говоря, композиция настоящего изобретения в основном содержит 0,1-5 мас.% ликопена, предпочтительно 0,2-4 мас.% ликопена, например 0,3-2 мас.% ликопена, наиболее предпочтительно 0,3-1 мас.% ликопена, а в частности 0,3-0,8 мас.%, например 0,3-0,6 мас.% ликопена.
Природный источник липофильного антиоксиданта предпочтительно содержит:
| 5-12% | ликопена |
| 1-1,5% | токоферолов |
| 0,05-0,15% | бета-каротина |
| 0,5-0,75% | фитоена |
| 0,5-0,55% | фитофлуена |
а наиболее предпочтительно
| 7-12% | ликопена |
| 1-1,5% | токоферолов |
| 0,05-0,15% | бета-каротина |
| 0,5-0,75% | фитоена |
| 0,5-0,55% | фитофлуена |
Источник одного или нескольких липофильных антиоксидантов предпочтительно содержит менее чем 1% бета-каротина, например менее чем 0,75%, например, менее чем 0,5%, предпочтительно, менее, чем 0,25%, наиболее предпочтительно менее, чем 0,2%, а особенно предпочтительно менее чем 0,15% бета-каротина. Аналогичным образом композиция настоящего изобретения обычно содержит менее чем 0,025% бета-каротина, предпочтительно менее чем 0,02% бета-каротина, а особенно предпочтительно менее чем 0,01% бета-каротина.
Таким образом, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая позволяет достигать благоприятный эффект, описанный ниже, с использованием очень небольшого количества или вообще без использования бета-каротина.
В типичном варианте осуществления изобретения единственным источником липофильного антиоксиданта является томатный экстракт. Альтернативно липофильным антиоксидантом является томатный экстракт.
В соответствии с типичным вариантом осуществления изобретения указанная композиция содержит: 20-40 мас.% хрящевого экстракта, например 25-35 мас.%, предпочтительно 27-35 мас.%, например 30-35 мас.% хрящевого экстракта; 1-10 мас.% экстракта из семян винограда, например 2-8 мас.%, предпочтительно 3-7 мас.%, например 3-5 мас.% экстракта из семян винограда; и 1-10 мас.% томатного экстракта, например 2-8 мас.%, предпочтительно 3-7 мас.%, например 3-5 мас.% томатного экстракта.
Типичная композиция настоящего изобретения содержит рыбный экстракт (F), экстракт из семян винограда (G) и томатный экстракт (Т) в массовом отношении примерно от 5:1:1 до 15:1:1, например примерно 10:1:1.
Как указывалось выше, композиция настоящего изобретения способствует увеличению синтеза коллагена, по крайней мере, на 35%, как определено методом испытаний А. Однако предпочтительно, чтобы использование композиции в условиях метода испытаний А приводило к увеличению синтеза коллагена, по крайней мере, на 40%, например по крайней мере, на 45%, а в частности, по крайней мере, на 50%, или по крайней мере, на 55%, предпочтительно, по крайней мере, на 60%, например, по крайней мере, на 65%, в частности, по крайней мере, на 70%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 75%.
Таким образом, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения синтеза коллагена или к уменьшению снижения синтеза коллагена в коже, где указанный способ предусматривает пероральное введение композиции, описанной в настоящей заявке.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что новая композиция настоящего изобретения не только способствует увеличению синтеза коллагена, но также может быть использована для предохранения кожи от старения или от действия УФ-излучения. В соответствии с этим, в подходящем варианте осуществления изобретения указанная композиция по сравнению с контролем способствует снижению вредного воздействия свободных радикалов, по крайней мере, на 40%, например, по крайней мере, на 45%, а в частности, по крайней мере, на 50%, как определено по активности ММР-1 в условиях Метода испытания В. Присутствие свободных радикалов кислорода и их неблагоприятное действие обычно обусловлено УФ-излучением, но оно может быть результатом воздействия и других факторов окружающей среды, физиологических или генетических факторов.
УФ-индуцирование, сверхпродуцирование ММР считается одной из главных причин старения кожи под действием света. УФ-излучение активирует дермальные клетки, что приводит к сверхпродуцированию ММР, которые представляют собой ферменты, разлагающие коллаген и другие белки, составляющие внеклеточный матрикс дермы. Деградация (разрушение) дермы сопровождается ее репарацией, которая является неполной. Неполная репарация приводит к недостаточной структурной целостности дермы и такая репарация повторяется при каждом периодическом воздействии УФ-излучения, что приводит к аккумуляции кожных рубцов и в конечном счете к видимым признакам старения кожи (2-5). Влияние УФ-излучения на индуцирование ММР было также подтверждено in vitro на культурах фибробластов (6,7). Другие исследования, посвященные механизму УФ-индуцирования ММР, позволяют предположить, что УФ-индуцированный синглетный кислород (реакционноспособный вид кислорода) оказывает непосредственное воздействие на клетки, которые продуцируют ММР (8). Таким образом, антиоксиданты, а в частности такие вещества, которые акцептируют синглетный кислород, противодействуют УФ-стимулированному синтезу ММР. Однако не исключено, что в стимуляции синтеза ММР также участвуют и другие виды свободных радикалов. Старые клетки в культуре, а также клетки, подвергнутые УФ-облучению или облучению солнечным светом, продуцируют более высокие количества ММР. Таким образом, снижение ММР-активности в результате использования композиции настоящего изобретения является показателем ее эффективности по уходу за кожей.
Кроме того, композиция настоящего изобретения ингибирует образование конечных продуктов прогрессирующего гликозилирования (AGE), по крайней мере, на 10%, например, по крайней мере, на 20%, в частности на 30%, 40%, 50% или 60%, а предпочтительно, по крайней мере, на 70%, в частности, по крайней мере, на 80% или на 90%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 100 или 110%, как измерено по сравнению с контролем в условиях Метода испытаний С.
AGE (конечные продукты прогрессирующего гликозилирования, называемые также продуктами Амадори (Amadori), образуются в результате гликозилирования (гликоокисления), то есть реакции неспецифического связывания между белками и углеводами. AGE аккумулируются как в отдельных клетках, так и во внеклеточном матриксе тканей, состоящем из долгоживущих белков, таких как коллаген в коже. Перекрестно связанные с AGE белки являются нефункциональными белками и имеют тенденцию к агрегированию во внеклеточном матриксе или в цитоплазме клеток, и, по всей вероятности, оказывают негативное воздействие на общий синтез белков. Сначала при реакции глюкозы с белком образуется продукт ранней стадии (продукт Амадори). Затем этот продукт Амадори подвергается реакции перегруппировки с образованием коричневых пигментов поздней стадии, которые могут перекрестно связываться с белками. После перегруппировки продукты поздней стадии продолжают аккумулироваться в долгоживущие белки, такие как коллаген, в течение длительного периода времени и с высокой степенью перекрестного связывания с белками. Было также показано, что образование AGE in vivo способствует ускорению процесса старения организма и клеток, как in vivo, так и in vitro. Очевидно, in vivo, уровень аккумуляции AGE соответствует уровням глюкозы в сыворотке. Критическую роль в образовании AGE последней стадии приписывают окислению, поскольку самогликозилирование является обратимым процессом. Однако окисление ответственно за непрерывную химическую деградацию и потерю функциональности белков, обусловленных непрерывным образованием перекрестных связей (9). Было показано, что AGE помимо своей неэффективности и ингибирующего действия на общий синтез белка также являются хромофорами, которые после облучения УФ-светом генерируют значительные количества активных кислородных радикалов (10).Таким образом, окислительный стресс способствует образованию AGE.
При облучении одной единственной дозой УФ-света (5 Дж/см2) уровень AGE в культурах контрольных клеток, в которые не было введено добавок, возрастал приблизительно в 20 раз по сравнению с необлученными контрольными клетками. В тех же самых условиях уровень AGE в культурах, в которые был добавлен F, увеличивался примерно в 40 раз, что указывало на то, что F не обладает действием, защищающим от образования AGE после УФ-облучения. Более резкое увеличение уровней AGE в F-обработанных клетках наблюдалось при 7,5 Дж/см2. На фиг.3 видно, что уровни AGE в клетках, к которым был добавлен FG, возрастали до 72 единиц, что находится в пределах значений, наблюдаемых для необработанных контрольных клеток (10%-ное снижение по сравнению с контролем).
Интересно отметить, что FGT-обработанные клетки неожиданно обнаруживали снижение уровня AGE приблизительно до 22 единиц по сравнению с необлученными клетками, что соответствует 120% снижению концентрации AGE по сравнению с необработаннными облученными клетками.
Таким образом, композиции настоящего изобретения способствуют увеличению уровня включения пролина, а также оказывают благоприятное воздействие на УФ-облученные клетки в отношении ММР-1-активности и образования AGE.
Таким образом, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая может быть использована для косметического устранения признаков старения кожи и для общего ухода за здоровой кожей. Указанные признаки старения кожи могут быть обусловлены рядом факторов, таких как солнечный свет, время, питание и другие условия окружающей среды.
Обычно композиция настоящего изобретения содержит:
1-80 мас.% соединений, экстрагируемых из хряща;
0,1-75 мас.% экстракта из семян винограда; и
0,002-25 мас.% ликопена.
Более предпочтительно композиция настоящего изобретения включает:
27-35 мас.%, а обычно 30-35 мас.% хрящевого экстракта,
1-10 мас.% экстракта из семян винограда, например 3-5 мас.% экстракта из семян винограда; и
0,1-5 мас.% ликопена, а обычно 0,2-1 мас.% ликопена.
Авторами настоящего изобретения были получены подходящие композиции, содержащие:
100-110 мг рыбного экстракта,
95-105 мг растительных экстрактов,
25-35 мг экстракта Acerola,
60-90 мг микрокристаллической целлюлозы,
3,5-4,5 мг диоксида кремния
где указанные растительные экстракты содержат олигомерный процианидол и ликопен, а рыбные экстракты содержат гликозаминогликан.
Другая подходящая композиция настоящего изобретения включает:
100-110 мг рыбного экстракта,
95-105 мг растительных экстрактов,
60-65 мг инулина,
25-35,00 мг аскорбиновой кислоты,
10-20 мг глюконата цинка,
10-15 мг диоксида кремния,
где указанные растительные экстракты содержат олигомерный процианидол и ликопен, а рыбные экстракты содержат гликозаминогликан.
Таким образом, композиция настоящего изобретения может, кроме того, включать другие компоненты, такие как дополнительные пищевые добавки, такие как витамины, минералы, аминокислоты и углеводы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная композиция, кроме того, содержит витамин С или экстракт, содержащий витамин С, то есть, кроме того, она содержит экстракт Acerola.
Как было недавно установлено и как уже указывалось выше, относительные и абсолютные количества компонентов имеют особенно важное значение для достижения неожиданных благоприятных эффектов композиции настоящего изобретения. В соответствии с этим, гидрофильные и липофильные антиоксиданты предпочтительно присутствуют в массовом отношении, составляющем в пределах примерно от 1:1 до примерно 200:1, например от 2:1 до 100:1, а в частности от 5:1 до 50:1, особенно от 5:1 до 20:1, предпочтительно от 5:1 до 15:1, а наиболее предпочтительно 7:1 до 12:1, например примерно 10:1.
Аналогичным образом хрящ, одно или несколько экстрагируемых из него соединений и гидрофильные антиоксиданты предпочтительно присутствуют в массовом отношении, составляющем в пределах примерно от 1:1 до примерно 200:1, например от 2:1 до 100:1, а в частности от 5:1 до 50:1, особенно от 5:1 до 20:1, предпочтительно от 5:1 до 15:1, а наиболее предпочтительно 7:1 до 12:1, например примерно 10:1.
В общих чертах в одном из своих важных аспектов настоящее изобретение относится к композиции, в которой i) хрящ, одно или несколько экстрагируемых из него соединений или их производные, ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов и iii) один или несколько липофильных антиоксидантов присутствуют вместе в количествах, достаточных для подавления активности ММР-1, для подавления образования AGE или для стимуляции синтеза коллагена в клетках фибробластов человека, культивированных in vitro.
Аналогичным образом в другом своем важном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в которой i) хрящ, одно или несколько экстрагируемых из него соединений или их производные, ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов и iii) один или несколько липофильных антиоксидантов присутствуют в соотношении, подходящем для подавления активности ММР-1, для подавления образования AGE или для стимуляции синтеза коллагена в клетках фибробластов человека, культивированных in vitro.
В комбинации предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанная композиция может содержать 0,25-15 мг ликопена и 2,5-100 мг экстракта из семян винограда, а предпочтительно 0,5-5 мг ликопена и 5-50 мг экстракта из семян винограда, а в частности 0,75-2,5 мг ликопена и 10-30 мг экстракта из семян винограда, а особенно предпочтительно 1-2,5 мг ликопена и 10-25 мг экстракта из семян винограда.
В другой комбинации предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанная композиция может содержать 1-2,5 мг ликопена, 5-50 мг экстракта из семян винограда и 50-200 мг хрящевого экстракта.
Композиции настоящего изобретения предназначены для перорального введения и могут быть введены в виде твердой дозированной формы, такой как таблетки, порошки, гранулы, капсулы, саше или в виде жидкой дозированной формы, такой как растворы, суспензии, тоники или сиропы. Такие лекарственные формы могут быть получены хорошо известным способом, обычно применяемым в фармацевтической практике, и могут содержать один или несколько наполнителей, которыми могут быть любые из обычно используемых наполнителей. Для твердых композиций могут быть использованы традиционные нетоксичные твердые наполнители, включая, но не ограничиваясь ими, например, маннит, лактозу, крахмал, соевые волокна, стеарат магния, замещенный натрием сахарин, тальк, целлюлозу, например, микрокристаллическую целлюлозу, глюкозу, сахарозу, диоксид кремния, карбонат магния фармацевтической чистоты и подобные им. Жидкие дозированные формы могут быть получены путем растворения, диспергирования и т.п. активных соединений, и необязательного фармацевтически приемлемого адъюванта в наполнителе, таком как вода или жидкости на основе воды, например соки, масло или спирт соответственно с образованием раствора или суспензии. Если это необходимо, то пероральная композиция настоящего изобретения может также содержать небольшие количества известных добавок, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферы и т.п. Такие дозированные формы могут быть приготовлены методами, хорошо известными специалистам, см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15th Edition, 1975; или Martindale, The Extra Pharmacopeia, The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 31th Edition, 1996.
Указанная композиция может быть приготовлена так, чтобы липофильный антиоксидант, такой как экстракт из томатов или экстракт, содержащий ликопен, подвергался нормальному высвобождению, а гидрофильный антиоксидант, такой как экстракт из семян винограда, подвергался пролонгированному или замедленному высвобождению.
Как проиллюстрировано в примере 5, композиции при их пероральном введении оказывают заметное воздействие на состояние кожи. На фиг.4 также показано, что у волонтеров, принимающих композицию настоящего изобретения, наблюдалось улучшение общего состояния кожи, повышение мягкости кожи, улучшение состояния кожи вокруг глаз и вокруг рта. Таким образом, результаты, описанные в примерах 1-4, свидетельствуют об in vivo эффективности указанных композиций, которые при их пероральном введении очевидно, действуют системно.
Композиции настоящего изобретения могут быть использованы в качестве перорального косметического продукта, в качестве пищевого продукта или пищевой добавки или в качестве фармацевтического средства или диетического продукта.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, предназначенной для общего ухода за кожей, для замедления дегенерации кожи, обусловленной старением и УФ-облучением, и для устранения признаков старения кожи. Композиции настоящего изобретения могут быть использованы для лечения стареющей кожи; кожи, подвергшейся воздействию солнечного света или другими видами УФ-излучения; сухой кожи; грубой кожи; обесцвеченной кожи; кожи с угревой сыпью; зарубцевавшейся кожи; кожи со шрамами; экземы и псориаза.
Одним из важных аспектов настоящего изобретения является способ косметической и профилактической обработки кожи в целях устранения признаков старения кожи и повреждения кожи под действием УФ-излучения, предусматривающий пероральное введение композиции, определенной выше. Аналогичным образом другим аспектом настоящего изобретения является способ косметического и профилактического лечения кожи; кожи, подвергшейся облучению солнечным светом или другими видами УФ-излучения; сухой кожи; грубой кожи; обесцвеченной кожи; кожи с угревой сыпью; зарубцевавшейся кожи; кожи со шрамами; экземы и псориаза, где указанный способ предусматривает пероральное введение композиции, определенной выше. Предполагается, что композиция, определенная выше, может быть использована в целях получения средства для предупреждения или замедления появления признаков старения кожи, предупреждения или снижения негативного воздействия УФ-излучения, для лечения шрамов, для лечения угрей, для ослабления симптомов экземы, для стимуляции образования рубцов и заживления ран, для уменьшения степени рубцевания, для ослабления симптомов псориаза или для лечения грубой, обесцвеченной или сухой кожи.
При таком применении типичная суточная доза определенной выше смеси хрящевого компонента, гидрофильного антиоксиданта и липофильного антиоксиданта составляет в среднем от 55 до 3700 мг для взрослого индивидуума, например от 70 до 1000 мг. Введение этой смеси может быть осуществлено в виде одной суточной дозы или в виде дробных доз вплоть до 4 раз в день, например 1,2,3 или 4 раза, а предпочтительно 1 или 2 раза в день.
Указанные композиции могут быть упакованы в соответствии с хорошо известной практикой, например, в упаковки для таблеток, в блистерные упаковки или во флаконы. В случае, когда один из компонентов является чувствительным к действию света, а в частности, в том случае, если липофильным антиоксидантом является ликопен, то указанные композиции следует держать в защищенном от света месте. При использовании, например, блистерных упаковок это может быть достигнуто в случае, если указанные блистерные упаковки представляют собой хорошо известный тип упаковок, образуемых двумя листами алюминиевой фольги и покрытой алюминием пластиковой пленки, соответственно таких как сформованный (образующий углубления) лист пластикового/алюминиевого ламината (например, ламината из ПВХ, алюминиевой фольги и пленки из ориентированного полиамида) и станиолью, необязательно покрытой лаком алюминиевой фольгой соответственно.
Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.
Примеры
Пример 1
Определение эффективных концентраций липофильных антиоксидантов, гидрофильных антиоксидантов и хрящевого экстракта.
Различные концентрации экстракта из семян винограда (1-200 мг/мл), хрящевого экстракта (0-1000 мг/мл) и томатного экстракта (0-200 мг/мл) тестировали на дозозависимую эффективность по отношению к in vitro культивируемых фибробластам кожи человека. После оценки выживания клеток и скорости роста при всех условиях культивирования отбирали одну оптимальную концентрацию для каждого ингредиента.
Метод
Рабочие растворы хрящевого экстракта, экстракта из семян винограда и томатной пасты, содержащей ликопен, получали следующим образом:
Хрящевой раствор (40 мг/мл): 200 мг рыбного порошка (хрящевого экстракта, полученного путем ферментативного протеолитического гидролиза хряща, фильтрации и сушки гидролизата распылением) растворяли в 5 мл забуференного солевого раствора Хенкса (Hanks) и подвергали стерильной фильтрации.
Раствор из семян винограда (40 мг/мл): 200 мг экстракта из семян винограда (Indena, Milano, Italy) растворяли в 5 мл забуференного солевого раствора Хенкса (Hanks) и подвергали стерильной фильтрации.
Томатный раствор (предварительный исходный раствор 100 мг/мл):
Предварительный исходный раствор: 400 мг томатной пасты (содержащей 40 мг ликопена) растворяли в 4 мл тетрагидрофурана, подвергали стерильной фильтрации и хранили при -80°С вплоть до использования.
Рабочий томатный раствор (100 мкг/мл):
Рабочий томатный раствор: предварительный маточный раствор непосредственно перед использованием разводили в среде для культивирования клеток, DMEM, в отношении 1:1000.
Клетки фибробластов человека культивировали следующим образом: 10000 клеток/лунку высевали в 24-луночные планшеты. Клетки оставляли на ночь для адгезии, а затем среду заменяли средой, содержащей различные концентрации хрящевого экстракта (F), экстракта из семян винограда (G) и томатного экстракта (Т). Среду для культивирования клеток, DMEM (10% фетальная телячья сыворотка, + глутамин, пенициллин/стрептомицин) заменяли через день или через два дня, за исключением среды, содержащей ТЕ, которую меняли каждый день. Клетки культивировали до конфлюентности (37°С, 5% CO2, влажность 95%) и через день подсчитывали с использованием 300 мкл трипсина/EDTA на лунку для отделения клеток путем 10-минного выдерживания в инкубаторе при 37°С, причем для подсчета клеток/мл использовали 200 мкл указанной смеси.
Выживание и рост клеток оценивали до 15-дневного роста. Выживание клеток оценивали путем измерения поглощения МТТ в клетках. Уровень поглощения МТТ соответствует уровням митохондриальной активности, которая может быть использована как признак жизнеспособности клеток. МТТ восстанавливался с образованием окрашенного в синий цвет соединения, формазана, который детектировался по поглощению УФ-видимого света при 595 нм, по сравнению с поглощением при 655 нм.
Рост клеток оценивали как число клеток на колбу с культурой, которое подсчитывали с использованием электронного счетчика Coulter®.
Результаты
Клеточные культуры, к которым были добавлены 70 мкг/мл хрящевого экстракта, 10 мкг/мл экстракта из семян винограда и 10 мкг/мл томатного экстракта (=1,0 мкг/мл ликопена), представляют собой оптимальную среду для клеточного роста. Указанные концентрации не обнаруживали токсического действия и не изменяли скорость деления клеток. Эти результаты, кроме того, были подтверждены посредством длительного, 50-дневного культивирования фибробластов в культуральной среде, в которую была добавлена выбранная комбинация (описанная выше). Мониторинг кумулятивных уровней удвоения популяций (CPDL) показал, что эти уровни соответствуют числу делений клеток и что тестируемые ингредиенты не влияют на рост клеток. Результаты представлены в таблице 1 и на фиг.1.
| Таблица 1 | ||||
| День | O | F | FGT | GT |
| 0 | 18 | 18 | 18 | 18 |
| 3 | 19,17 | 19,34 | 18,87 | 18,8 |
| 9 | 21,4 | 21,52 | 21,28 | 21,32 |
| 14 | 23,08 | 22,93 | 23,05 | 23,02 |
| 21 | 25,65 | 25,87 | 25,59 | 25,67 |
| 28 | 27,53 | 27,57 | 27,73 | 27,78 |
| 35 | 28,88 | 28,88 | 29,2 | 29,15 |
| 42 | 31,45 | 31,54 | 31,4 | 32,03 |
| 50 | 32,98 | 33,14 | 32,42 | 33,39 |
Пример 2
Действие композиции на синтез коллагена
В системе in vitro тестов было установлено влияние F, G и Т на синтез коллагена. Синтез коллагена оценивали путем измерения включения радиоактивного пролина ([14С]-пролина) в пролин-содержащие белки, которые, главным образом, рассматривались как коллаген, где более чем 30% от общего числа аминокислот составляли пролиновые остатки. К среде для культивирования клеток добавляли различные комбинации F, G и Т в оптимальных концентрациях, определенные как описано примере 1, и через 24 ч измеряли радиоактивность секретированных и меченых белков.
Метод
Экстракты F, G и Т получали как описано в примере 1.
Включение радиоактивно меченого пролина в клеточные культуры фибробластов человека осуществляли следующим образом (Метод испытания А): через один день после высевания клеток добавляли различные комбинации F, G или Т и клетки культивировали до конфлюентности (приблизительно 1 неделю). Культуральную среду меняли ежедневно. При достижении конфлюентности среду заменяли на 0,5 мл радиоактивных растворов (25 мкКи) + 2,5 мл среды без F, G и Т.
Клетки оставляли в инкубаторе еще на 24 ч, а затем среду собирали и измеряли радиоактивность в соответствии с нижеследующей процедурой: ТСА-осаждение: 5 мкл среды смешивали с 20 мкл BSA (0,5 г/л) и 1 мл ТСА (10%) и оставляли на 30 мин при -20°С. Образцы оттаивали и пропускали через нитроцеллюлозный фильтр для отделения свободного радиоактивного пролина от меченых белков. Фильтр переносили в пробирку, в которую добавляли 2,5 мл сцинтилляционной жидкости. Пробирку оставляли в темноте на 1 ч, а затем на сцинтилляционном счетчике измеряли радиоактивность 5 мкл образца.
Результаты
Суммарные результаты представлены в табл.2. Клеточные культуры, содержащие экстракт GT, продемонстрировали снижение степени включения пролина по сравнению с контролем: 3,6%-ное включение по сравнению с 4,8%-ным включением у контроля, что соответствует снижению на 25%. Клеточные культуры, содержащие экстракт FT, не продемонстрировали какого-либо значительного влияния на уровни включения пролина, то есть уровень его включения составлял 5,0% по сравнению с 4,8%-ным включением у контроля, что соответствует увеличению лишь на 4%. Клеточные культуры, содержащие экстракт FG, продемонстрировали небольшое увеличение уровня включения пролина: 5,5%-ное включение, что соответствует 10%-ному увеличению включения по сравнению с контролем.
Клеточные культуры, содержащие экстракт F, обнаруживали увеличение уровня включения пролина, а именно 6,2%-ное включение, то есть увеличение включения на 29%. Однако экстракты FGT неожиданно давали резкое, т.е., 80%-ное увеличение уровня включения пролина (8,4%-ное включение пролина).
В экспериментах этого типа различие свыше 30% считалось значимым.
| Таблица 2 | ||||
| Обработка | Активность, число распадов/мин | Активность в мкКи, выход | % включенного пролина | Результат по сравнению с контролем |
| GT | 4516 | 0,0015 | 3,6 | 20%-ное снижение |
| Контроль | 5787 | 0,0020 | 4,8 | - |
| FT | 4516 | 0,0021 | 5,0 | изменений нет |
| FG | 5137 | 0,0023 | 5,5 | 10%-ное увеличение |
| F | 5787 | 0,0026 | 6,2 | 30%-ное увеличение |
| FGT | 7738 | 0,0035 | 8,4 | 80%-ное увеличение |
Пример 3
Влияние композиции на человеческие фибробласты после УФ-облучения УФ-излучение ответственно за ряд дегенеративных изменений в коже, которые приводят к видимым признакам старения (старение под действием света). Потенциальное протективное действие экстрактов F, G и Т и их комбинаций против УФ-индуцированного повреждения кожи было протестировано путем мониторинга биохимических признаков, ассоциированных со старением кожи под действием света (уровни ММР-1 и AGE) в культуре фибробластов кожи после ее УФ-облучения.
Клеточные культуры фибробластов кожи ежедневно экспонировали одной дозой УФ-излучения в течение 4 дней подряд. При этом были использованы две различные дозы (5 и 7,5 Дж/см2), соответствующие максимальной дозе, которая не вызывает гибели клеток.
В клеточные культуры добавляли различные комбинации F, G и Т (F, FG, FT, GT и FGT) с использованием оптимальных концентраций F, G и Т (как было определено и описано в примере 1) и через 1 и 4 дня оценивали ММР-1-активность и образование AGE.
Методы
Экстракты получали как описано в примере 1.
Культивирование клеток осуществляли следующим образом:
У клеток в зависимости от конкретного пассажа заменяли среду, содержащую комбинации экстрактов F, G и Т. При достижении конфлюентности клетки разделяли 1:4 с получением 4 колб для каждой обработки. Затем при достижении конфлюентности одну культуру (разделение (1:4) или две культуры (разделение 1:2) серийно пассировали в четыре новые колбы.
УФ-облучение клеточной культуры осуществляли следующим образом: УФ-дозу получали с использованием УФ-ламп (6 х Philips 40W UVA Cleo Perfomance tubes). Для измерения дозы в В/м2 использовали УФ-метр Хангера и вычисляли время, необходимое для достижения желаемой дозы, 5; 7,5; 10 и 15 Дж/см2. Предварительные эксперименты показали, что оптимальная доза облучения, которая не вызывает гибели клеток, составляет 7,5 Дж/см2.
Определение ММР-1-активности (эндогенной активности плюс латентные уровни) осуществляли с использованием коммерчески доступной тест-системы, поставляемой APBiotech, Code RPN2629 (Метод испытания В).
Определение AGE осуществляли с использованием методики ELISA (Метод испытания С):
День 1: Микропланшеты покрывали 50 нг AGE/лунку, разводили карбонатным буфером и выдерживали в течение ночи при +4°С.
День 2: Лунки 4 раза промывали PBST (PBS и 0,05% Твин 20), а затем блокировали при помощи PBS-молока (6%) из расчета 200 мкл/лунку в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ). Затем лунки 4 раза промывали PBST, после чего в лунки сначала добавляли 50 мкл AGE-стандарта (20-20,000 единиц/лунку) или 50 мкл образца (50 мкг белка/мл), а затем 50 мкл поликлонального антитела против AGE (разведение 1/1000). Планшеты интенсивно перемешивали 2 ч при комнатной температуре. Лунки 4 раза промывали PBST, а затем добавляли "второе" антитело (кроличье поликлональное антитело, конъюгированное с ПХ, разведение 1/1000) в концентрации 50 мкл/лунку и интенсивно перемешивали 2 ч при комнатной температуре. И наконец, лунки снова 4 раза промывали PBST, а затем добавляли субстрат (1 таблетку OPD/3 мл ddH2O + 1/1000 (об/об) перекиси водорода (35%)) из расчета 100 мкл/лунку. Планшеты помещали в темное место и после развития соответствующей окраски реакцию прекращали добавлением 50 мкл Н2SO4 (1М). Оптическую плотность регистрировали при 490 нм (контроль при 655 нм).
Результаты
Результаты оценки ММР-1-активности и образования AGE представлены на фиг.2а, 2в и 3 соответственно в таблицах 3 и 3а.
1. ММР-1-активность
Было показано, что УФ-облучение индуцировало ММР-1-активность в необработанных клетках (контроль) на 1-й и на 4-й дни исследования, что тем самым подтверждало возможность индуцирования ММР-1 в культивированных фибробластах под действием УФ. Активность ММР-1 контрольных клеток возрастала примерно в два раза в процессе старения под действием света.
Клетки, обработанные GT, обнаруживали 34%-ное и 58%-ное увеличение уровней ММР-1 на 1-й и 4-й день соответственно.
В противоположность этому в клеточных культурах с добавлением F индуцировалась значительная ММР-1-активность. После УФ-облучения ММР-1-активность возрастала приблизительно в три и в четыре раза соответственно.
Объединение F с GT с образованием FGT не приводило к увеличению ММР-1-активности у УФ-облученных клеток, что оказалось неожиданным результатом. Так, например, FGT-обработанные клетки обнаруживали ММР-1-активность, которая была вдвое меньше по сравнению с контрольными клетками при идентичных условиях.
| Таблица 3 День 1 | |||
| 0 Дж/см2 | 5 Дж/см2 | 7,5 Дж/см2 | |
| контроль | 1 | 2,01 | 1,80 |
| GT | 1 | 1,34 | 1,34 |
| FGT | 1 | 0,97 | 0,99 |
| Таблица 3а День 4 | |||
| 0 Дж/см2 | 5 Дж/см2 | 7,5 Дж/см2 | |
| контроль | 1 | 2,02 | 2,3 |
| GT | 1 | 1,37 | 1,58 |
| FGT | 1 | 1,04 | 0,99 |
II. Образование AGE
Результаты представлены на фиг.3 и в таблице 4. После экспонирования одной дозой УФ-излучения (5 Дж/см2) уровни AGE в контрольных клетках, к которым не были добавлены экстракты, возрастали приблизительно в 20 раз по сравнению с необлученными контрольными клетками. При тех же самых условиях уровни AGE в культурах, в которые был добавлен экстракт F, возрастали в 40 раз, что указывало на то, что F не обладает протективным действием, направленным против образования AGE после УФ-облучения. На фиг.3 видно, что уровни AGE в клетках, к которым добавляли FG, возрастали до 72 единиц, что находится в пределах значений, полученных для необработанных облученных контрольных клеток (10%-ное снижение по сравнению с контролем).
Интересно отметить, что FGT-обработанные клетки обнаруживали неожиданное снижение уровня AGE приблизительно до 22 единиц по сравнению с необлученными клетками, что соответствовало 120%-ному снижению концентрации AGE по сравнению с необработанными облученными клетками.
Таким образом, композиции настоящего изобретения способствуют увеличению уровня включения пролина, а также оказывают благоприятное воздействие на УФ-облученные клетки в отношении их ММР-1-активности и образования AGE.
| Таблица 4 | ||
| 5 Дж/см2 | 7,5 Дж/см2 | |
| контроль | 80,06 | 67,88 |
| F | 152,72 | 258,21 |
| GT | 72,04 | 118,58 |
| FGT | -21,94 | -34,92 |
Пример 4
Композиции настоящего изобретения были получены с использованием нижеуказанных ингредиентов, смешанных в определенном соотношении (количества даны в расчете на конечную дозировочную единицу).
Поскольку ликопен чувствителен к окислению, то смешивание гранулята и обработку, прессование в таблетки, хранение таблеток и их упаковку в алюминиевые блистерные упаковки (типа alu-alu-блистера) осуществляли в защитной атмосфере азота.
Композиция 1 (таблетка, код SF)
- 105 мг хрящевого экстракта (полученного посредством ферментативного протеолитического гидролиза хряща, фильтрации гидролизата и его сушки распылением);
- 100 мг растительного экстракта (содержащего приблизительно 1,5 мг ликопена, экстрагированного из томатов, и приблизительно 14 мг флавоноидов, экстрагированных из семян винограда, а остальное количество составляли соевые волокна, томатное масло и двуокись кремния; Alextan® от Indena, Milano, Italy);
- 30 мг экстракта Acerola (содержащего приблизительно 7,5 мг аскорбиновой кислоты, а остальное количество приходилось на компонентны Acerola и мальтодекстрин);
- 66 мг микрокристаллической целлюлозы;
- 4 мг двуокиси кремния (размер частиц 2,4-3,6 мкм).
Смешивание осуществляли в миксере Лёдига в течение 6 мин. Порошкообразную смесь прессовали в таблетки массой 305 мг.
Композиция 2 (таблетка, код SF-1)
- 105 мг хрящевого экстракта (полученного посредством ферментативного протеолитического гидролиза хряща, фильтрации гидролизата и его сушки распылением);
- 100 мг растительного экстракта (содержащего приблизительно 1,5 мг ликопена, экстрагированного из томатов, и приблизительно 14 мг флавоноидов, экстрагированных из семян винограда, а остальное количество составляли соевые волокна, томатное масло и двуокись кремния; Alextan® от Indena, Milano, Italy);
- 30 мг экстракта Acerola (содержащего приблизительно 7,5 мг аскорбиновой кислоты, а остальное количество приходилось на компонентны Acerola и мальтодекстрин);
- 81 мг микрокристаллической целлюлозы;
- 4 мг двуокиси кремния (размер частиц 2,4-3,6 мкм).
Смешивание осуществляли в миксере Лёдига в течение 6 мин. Порошкообразную смесь прессовали в таблетки массой 320 мг.
Композиция 3 (таблетка, код SS)
- 105 мг хрящевого экстракта (полученного посредством ферментативного протеолитического гидролиза хряща, фильтрации гидролизата и его сушки распылением);
- 100 мг растительного экстракта (содержащего приблизительно 1,5 мг ликопена, экстрагированного из томатов, и приблизительно 14 мг флавоноидов, экстрагированных из семян винограда, а остальное количество составляли соевые волокна, томатное масло и двуокись кремния; Alextan® от Indena, Milano, Italy);
- 62 мг инулина;
- 30 мг аскорбиновой кислоты;
- 15 мг глюконата цинка;
- 13 мг двуокиси кремния (размер частиц 2,4-3,6 мкм).
Смешивание осуществляли в миксере Лёдига в течение 6 мин. Порошкообразную смесь прессовали в таблетки массой 325 мг.
Типичная композиция
FE: 105 мг
G: 13,75 мг
ТЕ: 14,38 мг (из них ликопен составляет 10%=1,44 мг)
Пример 5
Композицию примера 1 подвергали потребительскому тестированию для оценки самими потребителями изменений в коже.
В трехмесячном исследовании участвовали 129 волонтеров, которые ежедневно принимали две таблетки, содержащие композицию примера 1. Перед проведением теста регистрировали внешний вид и состояние их кожи. Через 1, 2 и 3 месяца после приема композиции оценивали изменение внешнего вида и состояние кожи потребителя в соответствии со следующими баллами: 0 - состояние не изменилось, 1 - состояние слегка улучшилось, 2 - состояние улучшилось, 3 - состояние значительно улучшилось.
На фиг.4 представлены результаты оценки параметров: "общее состояние кожи", "мягкость" кожи, "состояние кожи вокруг глаз" и "состояние кожи вокруг рта". Улучшение этих параметров у волонтеров, участвовавших в эксперименте, выражены в процентах.
Литература
1. Emonard.H. & Grimaud,J-A. Matrix metatloproteinases. A review. Celt Mol. Biol. 36, 131-153 (1990).
2. Fisher.GJ. et al. Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light. N. Engl. J. Med. 337, 419-1428 (1997).
3. Fisher.G.J. & Voorhees, J.J. Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce Ap-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo. J. jnvestig. Dermatol. Symp. Proc. 3. 61-68 (1998).
4. Fisher,G.J-, Tatwar.H.S., Lin,J. & Voorhees,J.J. Molecular mechanisms of photoaging in human skin in vivo and their prevention by all-trans retinoic acid. Photochem- Photobiol. 69, 154-157(1999).
5. Hase,T. et al. Histologicat increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects: the possible involvement of matrix metalloproteinase-1 produced by inflammatory infiltrate on collagen degradation. Br. J. Dermatol. 142, 267-273 (2000).
6. Petersen,MJ., Hansen.C. & Craig,S. Ultraviolet A irradiation stimulates collagenase production in cultured human fibroblasts. J. Invest Dermatol. 99,440-444(1992).
7. Scharffetter,K. et al. UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo. Arch. Dermatot. Res. 283, 506-511 (1991).
8. WlaschekX, Briviba.K. & Stricklin.P. Singlet Oxygen May Mediate Ultraviolet A-Induced Synthesis of Interstitial Collagenase. J. Invest Dermatol. 104,194-198 (1995).
9. fu.m.x., Knecht.KJ., Thorpe,S.R. & Baynes.J.W- Role of oxygen in cross-linking and chemical modification of collagen by glucose. Diabetes 41 Suppi 2, 42-48 (1992).
10. Masaki.H., Okano,Y. & Sakurai,H. Generation of active oxygen species from advanced glycation end- products (AGEs) during ultraviolet light A (UVA) irradiation and a possible mechanism for cell damaging. Biochim. Biophys. Acta 1428, 45-56 (1999).
1. Пероральная композиция по уходу за кожей, содержащая
i) хрящевой экстракт, полученный путем ферментативного протеолитического гидролиза, или синтетические формы соединений, экстрагируемых из хряща путем ферментативного протеолитического гидролиза;
ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов, где указанные гидрофильные антиоксиданты экстрагированы из семян винограда или представляют собой синтетические формы антиоксидантов, экстрагируемых из семян винограда, и
iii) один или несколько липофильных антиоксидантов, где одним из указанных антиоксидантов является ликопен и где указанные липофильные антиоксиданты экстрагированы из природных источников или представляют собой синтетические формы липофильных антиоксидантов, экстрагируемых из природных источников,
где хрящевой экстракт, полученный путем ферментативного протеолитического гидролиза, или синтетические формы соединений, экстрагируемых из хряща путем ферментативного протеолитического гидролиза, и гидрофильные антиоксиданты присутствуют в массовом отношении в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 200:1, и где гидрофильные и липофильные антиоксиданты присутствуют в массовом отношении в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 200:1.
2. Композиция по п.1, содержащая
i) хрящевой экстракт, полученный путем ферментативного протеолитического гидролиза;
ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов, где указанные гидрофильные антиоксиданты экстрагированы из семян винограда или получены методом синтеза, и
iii) один или несколько липофильных антиоксидантов, где одним из указанных антиоксидантов является ликопен и где указанные липофильные антиоксиданты экстрагированы из природных источников или из синтетического источника.
3. Композиция по п.1, содержащая
i) хрящевой экстракт, полученный путем ферментативного протеолитического гидролиза;
ii) один или несколько гидрофильных антиоксидантов, где указанные гидрофильные антиоксиданты экстрагированы из семян винограда или получены методом синтеза, и
iii) один или несколько липофильных антиоксидантов, где одним из указанных антиоксидантов является ликопен и где указанные липофильные антиоксиданты экстрагированы из природных источников или из синтетического источника.
4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный хрящевой экстракт и соединения, экстрагируемые из хряща, включают гликозаминогликаны, выбранные из группы, состоящей из сложного эфира хондроитина, сложного эфира кератана, гиалуроновой кислоты или ее сложного эфира, сложного эфира дерматана, гепарина, сложного эфира гепарана, и их эпимеры и полимеры, каждый из которых может быть необязательно связан с пептидом.
5. Композиция по п.4, где указанные гликозаминогликаны выбраны из группы, состоящей из хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата и сульфата кератана, каждый из которых может быть необязательно связан с пептидом.
6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный хрящевой экстракт содержит сульфат хондроитина, необязательно связаннный с пептидом.
7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, которая содержит менее чем 1 мас.%, предпочтительно менее чем 0,5%, особенно предпочтительно менее чем 0,1 мас.%, коллагена, а наиболее предпочтительно вообще не содержит коллагена.
8. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов экстрагированы из источника, выбранного из группы, состоящей из сосновой коры, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus marianum, Vaccimum myrtillus, Silybum marianum.
9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов содержат олигомерный процианидол.
10. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов экстрагирован из семян винограда Vitis vinifera.
11. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов получены из экстракта семян винограда.
12. Композиция по п.8, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов экстрагированы из Vitis vinifera.
13. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько гидрофильных антиоксидантов получены из семян винограда Vitis vinifera.
14. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где один или несколько липофильных антиоксидантов экстрагированы из одного вида томата.
15. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где, по крайней мере, один из указанных одного или нескольких липофильных антиоксидантов экстрагирован из одного вида томата.
16. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный липофильный антиоксидант представляет собой томатный экстракт.
17. Композиция по любому из пп.13 и 14, где видом томата является Lycopersicum aesculentum.
18. Композиция по п.1, где указанный липофильный антиоксидант, кроме того, содержит каротеноид, выбранный из группы, состоящей из α-каротина, β-каротина, γ-каротина, δ-каротина, зеаксантина, криптоксантина, лутеина и ксантофилла.
19. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая примерно 0,1-5 мас.% ликопена, предпочтительно 0,2-4% ликопена, например 0,3-2% ликопена, наиболее предпочтительно 0,3-1% ликопена, а в частности 0,3-0,8%, например 0,3-0,6 мас.% ликопена, из расчета на единичную дозу.
20. Композиция по любому из предыдущих пунктов, которая, кроме того, содержит токоферолы, фитоен и фитофлуен.
21. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая 0,025% бета-каротина, предпочтительно менее чем 0,02% бета-каротина, а более предпочтительно менее чем 0,01% бета-каротина.
22. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где гидрофильные и липофильные антиоксиданты присутствуют в массовом отношении, составляющем в пределах примерно от 1:1 до примерно 200:1, например от 2:1 до 100:1, а в частности от 5:1 до 50:1, особенно от 5:1 до 20:1, предпочтительно от 5:1 до 15:1, а наиболее предпочтительно от 7:1 до 12:1, например примерно 10:1.
23. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный хрящевой экстракт, получаемый путем ферментативного протеолитического гидролиза, или синтетические формы соединений, экстрагируемые из хряща путем ферментативного протеолитического гидролиза, и гидрофильные антиоксиданты присутствуют в массовом отношении, составляющем в пределах примерно от 2:1 до 100:1, а в частности от 5:1 до 50:1, особенно от 5:1 до 20:1, предпочтительно от 5:1 до 15:1, а наиболее предпочтительно от 7:1 до 12:1, например примерно 10:1.
24. Композиция по любому из пп.11-23, содержащая 0,25-15 мг ликопена и 2,5-100 мг экстракта из семян винограда, а предпочтительно 0,5-5 мг ликопена и 5-50 мг экстракта из семян винограда, а в частности 0,75-2,5 мг ликопена и 10-30 мг экстракта из семян винограда, а особенно предпочтительно 1-2,5 мг ликопена и 10-25 мг экстракта из семян винограда, из расчета на единичную дозу.
25. Композиция по любому из пп.11-24, содержащая 1-2,5 мг ликопена, 5-50 мг экстракта из семян винограда и 50-200 мг хрящевого экстракта из расчета на единичную дозу.
26. Композиция по любому из пп.16-22, содержащая
i) 20-40 мас.% хрящевого экстракта, например 25-35 мас.%, предпочтительно 27-35 мас.%, например 30-35 мас.% хрящевого экстракта;
ii) 1-10% экстракта из семян винограда, например 2-8%, предпочтительно 3-7%, например 3-5 мас.% экстракта из семян винограда, и
iii) 1-10 мас.% томатного экстракта, например 2-8 мас.%, предпочтительно 3-7 мас.%, например 3-5% мас. томатного экстракта, из расчета на единичную дозу.
27. Композиция по любому из пп.1-26, которая, кроме того, содержит экстракт из Acerola.
28. Композиция по любому из пп.11-27, содержащая 100-110 мг хрящевого экстракта, 95-105 мг объединенных экстрактов из семян винограда и томатов, 25-35 мг экстракта Acerola, 60-90 мг микрокристаллической целлюлозы, 3,5-4,5 мг диоксида кремния, из расчета на единичную дозу, где экстракт из семян винограда содержит олигомерный процианидол, томатный экстракт содержит ликопен, а хрящевой экстракт содержит гликозаминогликан.
29. Композиция по любому из пп.13-28, содержащая 100-110 мг хрящевого экстракта, 95-105 мг объединенных экстрактов из семян винограда и томата, 60-65 мг инулина, 25-35 мг аскорбиновой кислоты, 10-20 мг глюконата цинка,10-15 мг диоксида кремния, из расчета на единичную дозу, где указанный экстракт из семян винограда содержит олигомерный процианидол, указанный томатный экстракт содержит ликопен, а указанный хрящевой экстракт содержит гликозаминогликан.
30. Композиция по любому из пп.11-29, которая приготовлена так, что указанный экстракт из семян винограда подвергается замедленному высвобождению, а ликопен подвергается нормальному высвобождению.
31. Композиция по любому из предыдущих пунктов, предназначенная для использования в качестве перорального косметического продукта пищевого продукта или пищевой добавки, фармацевтического средства или диетического продукта.
32. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция вводится в виде твердой дозированной формы, такой как таблетки, порошки, гранулы, грануляты, капсулы, саше, или в виде жидкой дозированной формы, такой как растворы, суспензии, тоники или сиропы.
33. Композиция по любому из предыдущих пунктов, предназначенная для общего ухода за кожей, для замедления дегенерации кожи, обусловленной старением и УФ-облучением, и для устранения признаков старения кожи.
34. Композиция по любому из предыдущих пунктов, предназначенная для лечения стареющей кожи; кожи, подвергшейся воздействию солнечного света или других видов УФ-излучения; сухой кожи; грубой кожи; обесцвеченной кожи; кожи с угревой сыпью; зарубцевавшейся кожи; кожи со шрамами; экземы и псориаза.
35. Композиция по любому из предыдущих пунктов, предназначенная для использования при получении средства для предупреждения или замедления появления признаков старения кожи, для предупреждения или снижения негативного воздействия УФ-излучения, для лечения шрамов и угрей, для ослабления симптомов экземы, для стимуляции образования рубцов и заживления ран, для снижения степени рубцевания, для ослабления симптомов псориаза или для лечения грубой, обесцвеченной или сухой кожи.
36. Способ косметического и профилактического лечения стареющей кожи, кожи, подвергнутой воздействию солнечного света или других видов УФ-излучения, сухой кожи, грубой кожи, обесцвеченной кожи, кожи с угревой сыпью, зарубцевавшейся кожи, кожи со шрамами, экземы и псориаза, предусматривающий пероральное введение композиции по любому из пп.1-32.
37. Способ косметического и профилактического лечения кожи для устранения признаков старения кожи и повреждения кожи под действием УФ-излучения, предусматривающий пероральное введение композиции по любому из пп.1-32.
38. Способ увеличения синтеза коллагена или уменьшения снижения синтеза коллагена в коже, где указанный способ предусматривает пероральное введение композиции по любому из пп.1-32.
39. Способ снижения вредного влияния свободных радикалов кислорода в коже, определяемого по ММР-1 активности, пероральным введением композиции по любому из пп.1-32.
40. Способ уменьшения образования поздних гликозилированных конечных продуктов (AGE) пероральным введением композиции по уходу за кожей по любому из пп.1-32.
