Штаммы микроорганизмов-деструкторов saccharomyces sp. и pseudomonas sp., используемые для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, и ассоциация на их основе

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, водных стоков, а также для ликвидации аварийных разливов нефти. Штаммы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать нефть различных месторождений, отличающуюся фракционным составом. Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. и Pseudomonas sp., входящие в состав ассоциации, способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4-35°С), рН среды (4-8,5), повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%). Преимуществами ассоциации являются высокая степень деструкции углеводородов и способность расти на обедненной минеральной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нефть. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, водных стоков, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Микроорганизмы природных экосистем являются важным звеном в самоочищении почв и водоемов от загрязнений, а также основой для разработки высокоактивных биопрепаратов для интенсификации этого процесса. Применение микроорганизмов в ассоциациях представляется более перспективным в связи с тем, что, обладая разными ферментными системами, они способны извлекать нефтепродукт из субстрата с большей эффективностью.

Известен штамм Rhodococcus species 56 Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов [1].

Недостатком данного штамма является медленная скорость роста и относительно низкий процент биодеструкции нефти (69,8%). Кроме того, использование монокультуры является менее эффективным в связи с ограниченностью спектра окисляемых углеводородов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является консорциум штаммов дрожжей Candida maltosa для биодеградации нефтезагрязнений [2, прототип]. Консорциум утилизирует нефтезагрязнения при температуре до 41°С в широком диапазоне рН и может работать в засоленных экосистемах. При использовании консорциума для очистки воды содержание углеводородов нефти снижается на десятые сутки на 90%.

Недостатком данного штамма является относительно низкий показатель утилизации углеводородов за данный промежуток времени.

Технической задачей изобретения являлось получение новой ассоциации штаммов-нефтедеструкторов, характеризующейся высокой скоростью утилизации углеводородов за короткий промежуток времени в широком диапазоне рН среды и температур, в т.ч. пониженных (4-6°С); а также при повышенных концентрациях соли.

Поставленная задача решается применением штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 для утилизации углеводородов нефти.

Характеристика штамма Saccharomyces sp. Y-979. Штамм выделен из образца реликтового торфа, взятого на глубине 4-х метров (Васюганская низменность. Западная Сибирь, окрестность г.Нефтеюганск) на среде 8Е с нефтью (1.0%) в качестве единственного источника углерода, при температуре 23°С. Штамм хорошо растет на РПА и среде Сабуро, формирует белые, непрозрачные, блестящие, гладкие, пастообразные, выпуклые колонии с ровным краем. В жидкой среде образует равномерное помутнение, белый осадок и четко выраженное пристеночное кольцо. Диаметр колоний 2-3 мм. Клетки округлые, овальные, капсулированные, почки многосторонние. Размер клеток 4-6 мкм. Псевдомицелий, хламидоспор, баллистоспор не образует. Аски формируются из вегетативных клеток. Аскоспоры круглые по 1-4 в аске. Штамм У-979 является аэробом, факультативным анаэробом, его достоинством является способность к активному росту и нефтедеструкции в диапазоне температур от 4-6 до 35°С и рН среды 5.0-8.5 (оптимум роста достигается при температуре 23-28°С и рН среды 5.6-6.8). Штамм Y-979 не гидролизует крахмал, казеин, образует кислоту из лактозы, сахарозы, глюкозы; не сбраживает сорбит, мальтозу, рамнозу, манит; не разжижает желатин, способен к росту при концентрации NaCl до 10%; не обладает гемолитическими свойствами. Идентификация штамма проведена согласно руководству [3].

Характеристика штамма Pseudomonas sp. B-980. Штамм Pseudomonas sp. B-980 выделен при высеве на плотную среду 8Е с нефтью пробы воды озера Кротовая Ляга Новосибирской области. Штамм B-980 на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамотрицательные подвижные палочки размером 0.8×1.7-2 мкм. Штамм В-980 является аэробом, не гидролизует крахмал, казеин, не обладает протеолитической активностью, каталазоположительный, сбраживает глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу, сорбит с газообразованием, не разжижает желатин. Обладает нитратной активностью, растет на РПА с концентрацией NaCl 5%; не обладает гемолитическими свойствами. Важной особенностью штамма В-980 является способность к росту и нефтедеструкции при диапазоне температуры от 4-6 до 35°С (оптимум роста - 22-30°С и значениях рН 6.5-7.5). Идентификация проведена согласно [4, 5].

Хранение штаммов осуществляется периодическими пересевами на косячках агаризованной минеральной среды 8Е с глюкозой (1%) и при низкотемпературном замораживании в 15% растворе глицерина [4]. Хранятся штаммы Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 в музее Научно Исследовательского Института, Коллекция Культур микроорганизмов Федерального Государственного Унитарного Предприятия Государственный Научный Центр Биотехнологии и Вирусологии "Вектор" (НИИ ККМ ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор"). Справки о депонировании штаммов прилагаются.

Посевной материал получают при выращивании штаммов на жидкой или агаризованной среде 8Е.

Состав среды 8Е (г/л): (NH₄)₂HPO₄ - 1.5; КН₂РО₄ - 0.7; MgSO₄×7H₂O - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2.

При выделении штаммов в качестве источника углерода к среде 8Е добавляют глюкозу (1%); для определения способности штаммов к деструкции - сырую нефть или нефтепродукт, добавленные по весу (до 0,5-2%).

Испытуемую культуру или ассоциацию микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 4-25 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре.

Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980, входящие в состав ассоциации, способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4-35°С), рН среды (4-8.5), повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%). Соотношение штаммов в ассоциации 1:1.

Исследование способности к деструкции и биоэмульгации нефти штаммами Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 показывает, что штаммы Y-979 и В-980, использованные в опытах по отдельности, дают худшие результаты в сравнении с применением их для деструкции нефти совместно. Штамм В-980 с большей активностью эмульгирует пленку нефти, но отстает от штамма Y-979 по скорости роста. В случае штамма Y-979 наблюдается обратная картина: оптическая плотность среды была более 3.5 на третьи сутки, биоэмульгация также была интенсивной, но наблюдается неоднородность эмульсии, наличие небольших пристеночных фрагментов остаточной пленки нефти. Совместное использование штаммов позволяет ускорить и улучшить как процесс эмульгации, так и деструкции нефти (визуальный контроль оптической плотности среды и состояния пленки нефти в опытных и контрольных колбах, фиг.6). В опытах по деградации нефти эти штаммы использованы в ассоциации.

Стабильность используемых ассоциаций нефтедеструкторов контролируют микроскопически, высевая культуральную жидкость на плотную среду 8Е с глюкозой. Для количественных опытов отбирают ассоциации, где не наблюдают вытеснения одних штаммов другими. Наиболее стабильно сохраняются в условиях опыта сочетание штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980. Посевной материал содержит штаммы Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 в соотношении 1:1 с небольшими колебаниями. Это же соотношение сохраняется в течение длительного времени культивирования. Однако следует заметить, что численность штамма В-980 уменьшается по сравнению с количеством клеток дрожжей при пониженных значениях рН примерно на треть, оставаясь при этом значительной.

Исследуют также наличие антагонистической активности штаммов ассоциации Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 относительно друг друга методом отсроченного антагонизма, [6]. Наличия зон лизиса или угнетения штаммов под воздействием друг друга не обнаружено.

Преимуществами ассоциации являются высокая степень деструкции углеводородов (до 93% за 4 сут) и способность расти на обедненной минеральной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нефть.

Исследованная ассоциация микроорганизмов-деструкторов предложена впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемой ассоциации критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Фиг.1 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 6 суток инкубирования при температуре 23°С и рН среды 5.0.

Фиг.2 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 6 суток инкубирования при температуре 23°С, рН среды 7.0 и 5% концентрацией NaCl.

Фиг.3 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 4 суток инкубирования при 23°С и рН среды 7.0.

Фиг.4 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 4 суток инкубирования при температуре 4°С и pH среды 7.0.

Фиг.5 - газовая хроматограмма экстракта Васюганской нефти после биодеструкции ассоциацией (А) и без ее добавления (Б) в течение 20 суток при температуре 23°С и рН среды 7.0 (I - нафталин и его производные; II - антрацен и его производные).

Фиг.6 - визуальный контроль оптической плотности среды и состояния пленки нефти в опытных и контрольных колбах.

Далее следуют примеры конкретного применения заявляемой ассоциации.

Пример 1. Утилизация углеводородов при различных рН

Минеральную среду 8Е с разными значениями рН (5; 7; 8.5) разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть вносят из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре. Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью с разными значениями рН (5.0; 7.0; 8.5) без добавления штаммов микроорганизмов. Через 2 сут культивирования в опытных колбах наблюдают мощную биоэмульгацию, которая наиболее выражена при рН 7. Для остаточной нефти, содержащейся в среде с нормальным значением рН 7, анализ проводят на 4-ые сутки, для остальных - на 6-ые сутки.

Пробу культуральной жидкости после биодеструкции (15 мл), содержащую первоначально 30 мг нефти, количественно переносят в делительную воронку объемом 250 мл, экстрагируют хлороформом (2×50 мл, 2×40 мл, 1×10 мл). Хлороформные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре 30°С, количественно переносят хлороформом в мерную колбу объемом 50 мл, содержимое колбы доводят до риски хлороформом. Полученный образец используют для анализа.

Количественное определение содержания предельных углеводородов проводят методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J & W Scientific DB-5, 30 м×0.22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320°С), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335°С), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Bruker). В ходе анализа программируют изменение температуры колонки: 50°С - 2 мин, 50°С - 320°С - 15°С/мин, 320°С - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняют по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, Hewlett Packard.

Штаммы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать нефть различных месторождений, отличающуюся фракционным составом. Степень деструкции изучали на примере легкой (Западная Сибирь: Меретояхинская), средней (Западная Сибирь: Сугмутская, Муравленковская, Спорышевская, Западно-Салымская, Холмогорская, Средне-Итурская, Романовская, Васюганская) и тяжелой нефти (Республика Коми: Усинская).

Деструкция н-алканов ассоциацией, включающей в свой состав штаммы Pseudomonas sp. B-980 и Saccharomyces sp. Y-979 (соотношение 1:1) исследована при трех значениях рН среды (5.0, 7.0, 8.5) и разной ее засоленности (0.5, 5.0. 7.0% NaCl). Для данной ассоциации оптимальным для утилизации н-алканов является рН 7, где степень деструкции достигает 93% за 4 сут. При рН 5 утилизация нефти составляет 87,07% (фиг.1), а при рН 8.5-68.7% (табл. 1) за 6 сут. Штаммы Pseudomonas sp. B-980 и Saccharomyces sp. Y-979, использованные индивидуально, утилизируют н-алканы с меньшей эффективностью

Таблица 1
Утилизация углеводородов нефти в культуральной жидкости после биодеструкции ассоциацией штаммов микроорганизмов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 при различных значениях рН среды
Углеводород	Кол-во атомов углерода	рН среды / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)
рН=5.0	рН=7.0	рН-8.5
н-Декан	C10	≈100	≈100	≈100
н-Ундекан	С11	≈100	≈100	≈100
н-Додекан	С12	≈100	≈100	99
н-Тридекан	С13	≈100	89	83
н-Тетрадекан	С14	81	93	82
н-Пентадекан	С15	68	87	78
н-Гексадекан	С16	95	98	87
н-Гептадекан	С17	74	84	42
н-Октадекан	С18	66	75	33
н-Нанодекан	С19	94	95	86
н-Эйкозан	С20	97	84	78
н-Генэйкозан	С21	87	82	55
н-Докозан	С22	91	98	83
н-Трикозан	С23	91	97	90
н-Тетракозан	С24	92	94	82
н-Пентакозан	С25	94	96	47
н-Гексакозан	С26	96	94	66
н-Гептакозан	С27	93	86	61
н-Октакозан	С28	≈100	≈100	74
н-Нанокозан	С29	≈100	≈100	≈100
н-Триконтан	С30	≈100	≈100	≈100
н-Гентриконтан	С31	≈100	≈100	≈100
н-Дотриконтан	С32	≈100	≈100	≈100
н-Тритриконтан	С33	≈100	≈100	≈100

Пример 2. Утилизация углеводородов при различных концентрациях соли (NaCl)

Минеральную среду 8Е с разными значениями концентрации NaCl (0,5; 5,0; 7,0%) разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть вносят из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре. Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью и разными значениями концентрации NaCl (0.5; 5.0; 7.0%) без штаммов микроорганизмов. Через 2 сут в опытных колбах наблюдают активную биоэмульгацию. Анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, проводят после 6 суток культивирования с помощью газового хроматографа Varian 3600. При повышенных концентрациях соли степень биодеструкции остается значительной: при 5% NaCl степень утилизации достигает 75.7% (фиг.2), при 7% NaCl - 70% (табл. 2).

Пример 3. Утилизация углеводородов при различных температурах

Минеральную среду 8Е разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть двух различных месторождений (Васюганского и Усинского, отличающуюся более тяжелым фракционным составом) вносят в разные колбы из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 суток на термостатированной качалке при комнатной температуре (23-24°С) и при пониженной (4-6°С). Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью без штаммов микроорганизмов. Уже через двое суток в опытных колбах наблюдают активную биоэмульгацию. Анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, проводят после 6 суток культивирования с помощью газового хроматографа Varian 3600. Утилизация углеводородов при 23-25°С Васюганской нефти составляет 93%, Усинской - 90.8%. При 4-6°С деструкция Васюганской нефти достигает 79.86%, Усинской - 62.4% за 6 сут (табл. 3, фиг.3, 4).

Таблица 2
Утилизация н-алканов при различных значениях концентрации NaCl ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980
Углеводород	Кол-во атомов углерода	Концентрация NaCl / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)
0,5% NaCl	5% NaCl	7% NaCl
н-Декан	C10	100	100	100
н-Ундекан	С11	100	100	100
н-Додекан	С12	100	78	100
н-Тридекан	С13	89	74	44
н-Тетрадекан	С14	93	75	54
н-Пентадекан	С15	87	71	61
н-Гексадекан	С16	98	90	74
н-Гептадекан	С17	84	54	46
н-Октадекан	С18	75	46	30
н-Нанодекан	С19	95	86	94
н-Эйкозан	С20	84	90	89
н-Генэйкозан	С21	82	85	89
н-Докозан	С22	98	95	95
н-Трикозан	С23	97	83	92
н-Тетракозан	С24	94	93	84
н-Пентакозан	С25	96	76	73

н-Гексакозан	С26	94	76	67
н-Гептакозан	С27	86	72	71
н-Октакозан	С28	100	74	87
н-Нанокозан	С29	100	64	65
н-Триконтан	С30	100	63	56
Н-Гентриконтан	С31	100	69	49
Н-Дотриконтан	С32	100	100	100
н-Тритриконтан	С33	100	100	100
Таблица 3
Утилизация н-алканов при различных значениях температуры ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980
Углеводород	Кол-во атомов углерода	Температура культивирования / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)
		Васюганская нефть	Усинская нефть
4-6°С	23-25°С	4-6°С	23-25°С
н-Декан	C10	100	100	100	100
н-Ундекан	С11	58	100	38	100
н-Додекан	С12	75	100	52	100
Н-Тридекан	С13	75	89	57	89
Н-Тетрадекан	С14	96	93	52	93
н-Пентадекан	С15	99	87	63	68
н-Гексадекан	С16	96	98	76	98
н-Гептадекан	С17	68	84	66	84
Н-Октадекан	С18	59	75	13	75
Н-Нанодекан	С19	94	95	87	95
н-Эйкозан	С20	96	84	92	94
н-Генэйкозан	С21	93	82	97	92
н-Докозан	С22	87	98	92	98
н-Трикозан	С23	86	97	97	97

н-Тетракозан	С24	91	94	100	94
Н-Пентакозан	С25	86	96	80	96
н-Гексакозан	С26	89	94	79	94
н-Гептакозан	С27	87	86	71	86
н-Октакозан	С28	83	100	55	100
н-Нанокозан	С29	73	100	44	100
н-Триконтан	С30	53	100	48	100
н-Гентриконтан	С31	63	100	45	100
Н-Дотриконтан	С32	46	100	33	100
н-Тритриконтан	С33	100	100	46	100

Пример 4. Деструкция ди- и триароматических углеводородов (нафталина и антрацена с производными)

Минеральную среду 8Е разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть Васюганского месторождения вносят в колбы из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре (23-24°С). Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью без штаммов микроорганизмов. Через 2 сут в опытных колбах наблюдают мощную биоэмульгацию. На 20-ые сутки проводят анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, с помощью милихрома А - 02 (фиг.5). Утилизация нафталина и антрацена с производными составляет 50% за 20 сут.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую степень биодеструкции углеводородов нефти как среднего, так и тяжелого фракционного состава ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 (до 93% за 4 сут).

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент РФ №2101352 "Штамм Rhodococcus sp. 56д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов", C 12 P 1/20, опубликован 30.11.1998.

2. Патент РФ №2114174 "Консорциум дрожжей Candida maltosa для биодеградации загрязнений", С 12 Р 39/00, опубликован БИ №18, 98.

3. И.П.Бабьева, В.И.Голубев. "Методы выделения и идентификации дрожжей"/М.: Пищевая промышленность, 1976.

4. Методы общей бактериологии /под ред Ф.Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - С.528.

5. "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology". 8th ed., V.1-2. / Ed. John G. Holt, - Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986, 1105 p.

6. Лебедева М.Н. / Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. Москва, Медицина, 1973. С.100-101.

1. Штамм дрожжей Saccharomyces sp. Y-979 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.

2. Штамм бактерии Pseudomonas sp. B-980 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.

3. Ассоциация штаммов дрожжей Saccharomyces sp.Y-979 и бактерии Pseudomonas sp.B-980 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.