Способ выделения нуклеиновых кислот
Владельцы патента RU 2272072:
Лактионов Павел Петрович (RU)
Власов Валентин Викторович (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Предложенный способ выделения нуклеиновых кислот предусматривает адсорбцию нуклеиновых кислот, содержащихся в образце, в присутствии хаотропного агента на стекловолокнистом сорбенте, предварительно обработанном раствором плавиковой кислоты, с последующей промывкой сорбента от примесей ненуклеотидной природы и элюцией нуклеиновых кислот. Применение изобретения позволяет получить повышенный выход целевого продукта и сократить длительность процесса выделения нуклеиновых кислот. 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых (ДНК) и рибонуклеиновых (РНК) кислот из биологических жидкостей и иных образцов.
Получение высокоочищенных нуклеиновых кислот (НК) является важной проблемой в молекулярной биологии. Для получения НК из биологических жидкостей используют такие методы, как центрифугирование в градиенте CsCl2, гельфильтрацию, обработку фенолом и осаждение спиртом. Эти методы отличаются длительностью, многостадийностью и трудоемкостью.
Наиболее распространенным способом выделения НК является способ, включающий обработку биологической жидкости фенолом с последующим осаждением выделенного целевого продукта спиртом [1]. Недостатками данного способа являются длительность выделения НК (не менее 3,5 ч в связи с переосаждением целевого продукта), неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (25-50%).
Известен способ выделения РНК, путем смешивания гомогенизованного в 4 М растворе гуанидин тиоцианата (ГТЦ) образца с водонасыщенным фенолом с формированием монофазного раствора [2]. После добавления хлороформа происходит разделение фаз: РНК находится в водной фазе, тогда как ДНК и белки ассоциированы с интерфазой и органической фазой. Недостатками данного способа являются длительность выделения РНК (около 3 ч), многостадийность процесса, неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (7%).
Известен способ выделения ДНК из клинических образцов с использованием мелкодисперсного мешированного (стандартизованного по размеру) стекла [3]. Способ заключается в том, что ДНК адсорбируют из буферного раствора, содержащего 4 М ГТЦ, 0,1 М ЭДТА (рН 8,0) в течение 10 мин., затем отделяют силикатный сорбент центрифугированием (30 сек при 1000 g), промывают силикатный сорбент дважды буфером для адсорбции, дважды 70% этанолом и один раз ацетоном. Силикатный сорбент сушат в течение 10 мин при 56°С, а затем элюируют ДНК инкубацией с буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА (рН 8.0) (ТЕ-буфер) при нагревании до 56°С в течение 10 мин.
Недостатками данного способа являются длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг мешированного мелкодисперсного стекла адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделять ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% ДНК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с мешированным мелкодисперсным стеклом. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.
Известен способ выделения ДНК из биологических жидкостей на силикатном сорбенте, обработанном азотной кислотой [4]. Для этого мелкодисперсное стекло обрабатывают в течение часа концентрированной HNO3, затем отмывают водой, адсорбцию ДНК на данное стекло и элюцию с силикатного сорбента осуществляют в условиях вышеописанного аналога.
Недостатками данного способа являются длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг мелкодисперсного стекла адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделять ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с мелкодисперсным стеклом. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.
Известен способ выделения НК, включающий адсорбцию НК на аэросиле (А-300) в среде хаотропного агента, отделение сорбента и связанной с ним ДНК, элюцию ДНК с аэросила и очистку целевого продукта. Аэросил вносят в раствор, содержащий НК до конечной концентрации 0,3-0,6%, при этом для выделения однонитевой ДНК и РНК используют среду с содержанием 0,5-2 М ГТЦ, а для выделения двунитевой ДНК используют среду с содержанием 4 М ГТЦ [5]. Недостатками данного способа являются его длительность и трудоемкость.
Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ выделения НК, включающий смешивание исходного образца с буферным раствором, содержащим хаотропный агент, адсорбцию НК путем фильтрации полученной смеси через стекловолокнистый сорбент (фильтр GF/F), промывание сорбента и связанной с ним НК, элюцию НК и очистку целевого продукта [6]. При этом для выделения ДНК к 50 мкл образца, ресуспендированного в 50 мМ трис-HCl, рН 8.0, 10 мМ ЭДТА, добавляют 350 мкл 4 М ГТЦ, содержащим 2% саркозила, и наносят на фильтр GF/F, центрифугируют 2-3 мин, промывают центрифугированием 1 раз 400 мкл 4 М ГТЦ (без саркозила), 2 раза по 400 мкл 80%-ным изопропанолом, высушивают фильтры при 37°С в течение 10 мин, ДНК элюируют 100 мкл воды. Для выделения РНК к 300 мкл образца добавляют 100 мкл 4 МГТЦ, инкубируют при 70°С в течение 2-3 мин, переносят на фильтр GF/F, центрифугируют 5-10 с, промывают центрифугированием 2 раза 1 М ГТЦ (по 400 мкл), 2 раза 80%-ным изопропанолом, высушивают фильтры при 37°С в течение 10 мин, РНК элюируют 50 мкл воды.
Недостатками прототипа являются ограниченные функциональные возможности способа, недостаточный выход целевого продукта из-за низкой сорбционной емкости сорбента. Данный способ позволяет выделять только высокомолекулярную НК, при этом удается элюировать с фильтра не более 40-50% высокомолекулярной НК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной НК необратимо связывается с носителем. Таким образом, выход высокомолекулярной НК составляет от 40 до 50%, а НК с низкой молекулярной массой выделяется значительно менее эффективно.
Технической задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, уменьшение длительности процесса, повышение функциональных возможностей способа за счет возможности выделять молекулы НК заданной длины.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в адсорбции НК на заранее обработанном плавиковой кислотой стекловолокнистом сорбенте в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, промывке сорбента от биополимеров ненуклеотидной природы и последующей элюции НК раствором, содержащим ионы бикарбоната и ЭДТА, либо дистиллированной водой, либо буферными растворами с концентрацией не более 0,1 М. В результате полученный супернатант представляет собой раствор очищенной НК, пригодной для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки и концентрирования.
Заявляемый способ включает следующие последовательные стадии:
1. Предварительная обработка стекловолокнистого сорбента (СВС) 0,1-7% плавиковой кислотой в течение 1-6 ч с последующей отмывкой и высушиванием обработанного СВС (ОСВС). Полученный ОСВС набивают в наконечник для дозатора объемом 100-1000 мкл (получают фильтр); либо запекают стекловату в пресс-форме при температуре более 500°С в течение 5-30 минут, затем формируют диски при помощи высечки, которые затем вставляют в пробирки в качестве фильтровальной перегородки (второй вариант фильтра). В качестве стекловолокнистых материалов используют стекловату из стекла марки М20, стекловату из нейтрального стекла, минеральную стекловату из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.
2. Выделение НК из биологических жидкостей адсорбцией на ОСВС путем фильтрации образца через данный сорбент в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, при этом выделение ДНК длиной 500 п.н. и более проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4; выделение ДНК длиной 50-500 п.н. проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а выделение РНК проводят в буферном растворе, содержащем 1 М ГТЦ, 20-70% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5.
3. Промывание ОСВС и связанной с ним НК сначала дважды рабочим буферным раствором для сорбции ДНК или РНК (содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4 для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более; 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6.4 для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. и более; либо 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5 для выделения РНК) и дважды буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0;
4. Элюцию НК с ОСВС буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната (НСО3 -), 5-10 мМ ЭДТА, рН 8.0-10.0 (преимущественный вариант), либо дистиллированной водой, либо другими буферными растворами с концентрацией не более 0,1 М.
Для фильтрации образца через ОСВС и его промывки могут быть использованы следующие виды фильтрации: фильтрование под давлением, вакуумная фильтрация или фильтрация при помощи центрифугирования.
Время выделения НК данным способом составляет 10 минут. Способ обеспечивает выделение НК длиной от 100 п.н. до высокомолекулярных фракций из биологических образцов с высокой эффективностью и не зависит от концентрации НК в образце.
В табл. 1 представлены данные по элюции Р32-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 100 до 200 п.н.) и Р32-радиоактивно-меченой РНК (100 н.) различными элюентами. Из табл.1 видно, что элюция НК, связанных с ОСВС, буфером, содержащим ионы бикарбоната и ЭДТА более эффективна, чем ТЕ-буфером и не зависит от количества адсорбированной ДНК. На фиг.1 изображен электрофорез ДНК в 1% агарозном геле, содержащем 0,0003% бромистого этидия. С первой по четвертую дорожку нанесены разведения исходного маркера длины ДНК М13 (от 100 н.п. о 955 н.п.) (Сибэнзим, Новосибирск). На дорожки с пятой по восьмую - нанесены разведения маркера длины ДНК М13, после выделения М13 ДНК адсорбцией на ОСВС заявляемым способом. Из фиг.1 видно, что предложенный способ позволяет выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты ДНК. На фиг.2 изображен электрофорез РНК, выделенной различными способами: 1 - заявляемым способом, 2 - при помощи обработки фенолом. РНК выделяли из клеток линии А431. Из фиг.2 видно, что заявляемый способ позволяет более эффективно выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты РНК.
В табл.2 представлены данные по извлечению Р 32-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 1000 до 100 п.н.) и Р32-радиоактивно-меченой РНК (длиной 100 н.), внесенных в плазму крови человека предложенным способом. В табл.3 представлены данные по выделению РНК из клеток линии А 431 при помощи обработки фенолом [1], при помощи гуанидин-фенольной экстракции [3], а также по выделению РНК путем фильтрации через ОСВС предложенным способом. Из обеих таблиц видно, что заявляемый способ обеспечивает практически количественное выделение НК из биологических жидкостей за существенно меньшее время.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1) В качестве сорбента используют стекловолокно (содержащее в качестве основного компонента двуокись кремния), обработанное 0.1-7% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 часов, что позволяет увеличить рабочую поверхность и сорбционную емкость последнего. ОСВС связывает как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты НК. Из таблицы 2 видно, что емкость ОСВС в 10 раза выше, чем необработанного СВС. Более высокомолекулярные фрагменты ДНК ОСВС связывает более эффективно (данные не представлены).
2) Для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более используют буферный раствор, содержащий 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. используют буферный раствор, содержащий 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а для выделения РНК - 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5, что позволяет обеспечить количественное выделение НК заданной длины.
При этом промывку сорбента осуществляют под давлением, с использованием вакуумной фильтрации или при помощи центрифугирования, что обеспечивает выделение НК более быстрым, технологичным и воспроизводимым способом. Промывка сорбента буферным раствором для сорбции ДНК или РНК, а затем буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0 обеспечивает эффективное удаление примесей ненуклеотидной природы, отсутствие потерь НК, связанных с сорбентом. Благодаря этому выделенные НК пригодны для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки.
При этом элюцию связанных с сорбентом НК преимущественно осуществляют обработкой ОСВС буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната, 5-10 мМ ЭДТА, рН 8.0-10.0, что позволяет более быстро и количественно отделять от сорбента НК.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1
Для адсорбции ДНК проводят предварительную обработку СВС на основе нейтрального стекловолокна плавиковой кислотой с концентрацией 3,5% на качалке в течение 4 ч, ОСВС высушивают при 200°С в течение 1 ч. В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками человеческой эпидермальной карциномы А431 добавляют 0,5 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6.4, тщательно ресуспендируют и наносят на ОСВС, набитый в наконечник дозатора объемом 100-1000 мкл. Затем при помощи дозатора продавливают (фильтруют) нанесенную на ОСВС смесь, обеспечивая таким образом адсорбцию ДНК на ОСВС и одновременное удаление смеси, не содержащей ДНК. ОСВС промывают от примесей ненуклеотидной природы дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 20% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 8.0. Элюируют ДНК с ОСВС буферным раствором, содержащим 50 мМ NaHCO3, 5 мМ ЭДТА при рН 10.0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирают супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализуют 1/10 объема 100 мМ трис-HCl, рН 7.1.
Для оценки полноты выделения ДНК заявляемым способом были проведены сравнительные эксперименты по выделению ДНК путем ее осаждения трихлоруксусной кислотой и адсорбцией кислотонерастворимой фракции на нейлоновых фильтрах. Для этого клетки человеческой эпидермальной карциномы А431 выращивали на среде с Н3-тимидином. Н3-меченую ДНК выделяли из одинакового количества (106) клеток предлагаемым способом адсорбции на ОСВС и стандартным способом адсорбции ДНК на нейлоновых фильтрах. Для выделения ДНК на фильтре аликвоту клеток (106) переносили на 0,2 мкм нейлоновый фильтр, промывали 0,15 M NaCl и фиксировали 5% трихлоруксусной кислотой. Радиоактивность ДНК, выделенной различными способами, измеряли на β-сцинтиляционном счетчике RacBeta 1211. Было установлено, что радиоактивность H3-меченой ДНК, выделенной различными способами, была одинаковой. Таким образом, было показано, что предлагаемый способ обеспечивает количественное выделение ДНК. Содержание ДНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с Hoechst 32258. Флуоресценцию комплексов ДНК с Hoechst 32258 измеряли на флуориметре Hitachi MPF4 при длине волны возбуждения 350-360 нм и испускания 480-495 нм [5]. Для построения калибровочных кривых был использован стандартный раствор фрагментированной ДНК из тимуса теленка в концентрациях 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 нг/мл. Данным способом из 2×106 клеток линии А 431 было выделено 10 мкг ДНК. Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин. Емкость стекла по связыванию ДНК составляет до 2,3 мкг ДНК на 1 мг ОСВС.
Пример 2
Для адсорбции ДНК проводили предварительную обработку стекловаты из стекла марки М20 инкубированием с 7% плавиковой кислотой на качалке в течение 2 часов, отмывали, затем запекали в пресс-форме при 600°С в течение 15 мин, формировали диск необходимого диаметра при помощи высечки и помещали его в пробирку (получали фильтр с перегородкой из ОСВС).
В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками добавляли 0,5 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и затем наносили на ОСВС. Затем образцы центрифугировали 1 мин при 300 g. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 60% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали ДНК с ОСВС 5 мМ NaHCO3, 10 мМ ЭДТА при рН 8.0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g 1 мин собирали супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-HCl, рН 7.1. Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин.
Пример 3
К 0,5 мл плазмы крови человека добавляли 1 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и затем наносили на ОСВС, полученный аналогично примеру 1. Процедуру выделения и определения концентрации ДНК при помощи флуоресценции комплексов ДНК с Hoechst 32258 проводили аналогично примерам 1 и 2. Концентрация ДНК в плазме крови здоровых доноров составила 20 нг/мл плазмы.
Пример 4
Для адсорбции РНК проводили предварительную обработку базальтового стекловолокна 0,4%-ной плавиковой кислотой на качалке в течение 3 ч, затем ОСВС запекали в пресс-форме при 650°С в течение 10 мин, высекали диски необходимого диаметра и помещали их в пробирки. Для выделения РНК были использованы клетки человеческой эпидермальной карциномы А431. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для диссоциации выращенных клеток использовали 0.25% раствор трипсина. После нейтрализации трипсина, клетки переносили в пробирки и осаждали центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в 20 мкл физиологического раствора и добавляли 60 мкл лизис-буфера, содержащего 0.6% Nonidet P40, 50 мМ трис-HCl, 0.15 М NaCl, 5 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3MoO4. Клетки инкубировали 15 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин (центрифуга Eppendorf5410) для разделения мембранно-цитозольной и ядерной фракции. Супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки и добавляли 1 мл буфера, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и затем наносили на ОСВС. Для фильтрации образца через сорбент и отмывки сорбента была использована фильтрация под давлением. Супернатант удаляли, сорбент промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 2 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5, 20% изопропанол, а затем дважды буферным раствором, содержащим 80% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали РНК с ОСВС буферным раствором, содержащим 40 мМ NaHCO3,, 7 мМ ЭДТА, рН 9.0, в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин, собирали супернатант, содержащий РНК, раствор нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-HCl до рН 7.1.
Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×106 клеток линии А 431 было выделено 28 мкг РНК. Время приготовления образца с последующим выделением РНК составило 20 мин.
Пример 5
Для адсорбции РНК проводили предварительную обработку нейтрального стекловолокна 0,1%-ной плавиковой кислотой инкубированием на качалке в течение 6 ч. Сорбент изготавливали запеканием в пресс-форме при 550°С в течение 20 мин. Обработку клеток линии А-431 для получения мембранно-цитозольной фракции осуществляли аналогично примеру 4. Далее супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, добавляли 1 мл буфера, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 70% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и затем наносили на ОСВС. Для фильтрации образца через сорбент и отмывки сорбента была использована вакуумная фильтрация. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 40% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5, а затем дважды буферным раствором, содержащим 75% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали РНК с ОСВС дистиллированной водой в течение 5 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий РНК.
Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×106 клеток линии А 431 было выделено 20 мкг РНК. Время выделения РНК из супернатанта, содержащего мембранно-цитозольную фракцию, составило 10 мин.
Пример 6
К 0,2 мл плазмы крови человека добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 70% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и наносили на ОСВС. Процедуру выделения РНК проводили аналогично примерам 4 и 5. Содержание РНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с SYBR Green II. Флуоресценцию комплексов РНК с SYBR Green измеряли на флуориметре Bio-Rad при длине волны возбуждения 490 нм и испускания 520 нм [5].
Пример 7
Для адсорбции ДНК длиной 100 п.н. проводили предварительную обработку СВ С на основе нейтрального стекловолокна инкубированием с 0,1%-ной плавиковой кислотой на качалке в течение 2 ч. ОСВС высушивали при 200°С в течение 1 ч. Продукты ПЦР-реакции разгоняли в 1% агарозном геле, содержащим 0,0003% бромистого этидия, затем визуализировали ДНК под УФ-излучателем и вырезали искомый фрагмент ДНК длиной 100 п.н. Кусочек агарозы помещали в пробирку и инкубировали в течение 10 мин при 65°С. К расплавленной агарозе (0,1 мл) добавляли 1 мл смеси, содержащей 4.5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 70% этанол, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и наносили на ОСВС, набитый в наконечник дозатора объемом 100-1000 мкл. Затем нанесенную на ОСВС смесь продавливали при помощи дозатора. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 4.5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 50% этанол, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 80% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали ДНК с ОСВС при помощи ТЕ-буфера в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий ДНК.
Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:
- уменьшить расход носителя; удешевить процесс выделения НК;
- увеличить эффективность выделения НК в 10 раз за счет эффективной сорбции и элюции адсорбированной на носителе НК;
- повысить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности выделения как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фрагментов НК, а также НК заданной длины;
- уменьшить время процедуры выделения до 8-10 мин;
- увеличить чувствительность ПЦР - и ОТ - ПНР - диагностических систем за счет связывания низкомолекулярных фрагментов НК;
- обеспечить возможность использования предложенного способа для количественного определения концентрации НК в биологических жидкостях;
- уменьшить количество биологического материала, используемого для выделения НК с целью последующей амплификации или иного исследования.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.
2. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V.10. P.221-224.
3. Beld M., Sol С., Goudsmit Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms //Nucl. Acids Res. 1996. V.24. P.2618-2619.
4. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.
5. Патент РФ №2119954, кл. С 12 N 15/10, С 07 Н 21/04, опубл. 10.10.98.
6. Грибанов О., Щербаков А., Перевозчикова И., Гусев А. Использование аэросила и фильтров GF/F для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК // Биохимия 1996. Т.61. С.10.
| Таблица 1 | |||||||
| Количество НК, внесенное в пробу, нг/мл | Процент извлеченной НК, нг/мл | ||||||
| ОСВС | СВС | ||||||
| Элюция 50 мМ NaHCO3, 5 мМ ЭДТА, рН 8.0 | Элюция 0,01 М ТЕ-буфером | Элюция 0,01 М ТЕ-буфером | |||||
| ДНК | 10 | 82 | 48 | - | |||
| 25 | 85 | 48 | 15 | ||||
| 50 | 84 | 50 | 17 | ||||
| 100 | 86 | 51 | 16 | ||||
| 200 | 87 | 53 | 17 | ||||
| РНК | 10 | 75 | 40 | - | |||
| 25 | 77 | 41 | - | ||||
| 50 | 79 | 44 | 15 | ||||
| 100 | 80 | 49 | 14 | ||||
| 200 | 81 | 50 | 15 | ||||
| Таблица 2 | |||||||
| Стекловолокнистый сорбент | |||||||
| Не обработанный | Обработанный 0.1-7% HF | ||||||
| 1 ч | 2 ч | 3 ч | 4 ч | 5 ч | 6 ч | ||
| ДНК | 8±3 | 82±5 | 84±5 | 83±4 | 85±4 | 87±3 | 86±3 |
| РНК | 7±5 | 76±5 | 78±5 | 79±6 | 77±5 | 80±6 | 78±5 |
| Таблица 3 | |||||||
| Способ выделения | Время выделения (часы) | Эффективность выделения РНК | |||||
| Низкомолекулярная 32Р-меченая РНК (100н.),% | Высокомолекулярная РНК, выделенная из 106 клеток, % (мкг) | ||||||
| Фенольный | 4 | 25 | 81 (26) | ||||
| Фенол-гуанидиновый | 2,5 | 7 | 39 (13) | ||||
| На ОСВС | 0,2 | 55 | 100 (28) |
1. Способ выделения нуклеиновых кислот, включающий смешивание образца с буферным раствором, содержащим хаотропный агент, адсорбцию нуклеиновых кислот на стекловолокнистом сорбенте, промывку его от примесей ненуклеотидной природы и элюцию нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что сорбент предварительно обрабатывают 0,1-7,0% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 ч.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетата, рН 6,4.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетата, рН 6,4.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения РНК адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 1М ГТЦ, 20-70% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетата, рН 4,5.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стекловолокнистого сорбента используют стекловату из стекла марки М20, стекловату из нейтрального стекла, минеральную стекловату из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку сорбента осуществляют под давлением, под вакуумом или при помощи центрифугирования.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку сорбента от примесей ненуклеотидной природы проводят сначала дважды рабочим буферным раствором для сорбции ДНК или РНК, а затем дважды буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию нуклеиновых кислот преимущественно осуществляют буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната, 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0, или дистиллированной водой, или разбавленными буферными растворами с молярностью не более 0,1.
