Способ получения коллагена

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической, медицинской и других областях промышленности. Способ включает очистку белкового сырья, добавку воды и льда, измельчение смеси с последующим гидролизом. По окончании гидролиза гомогенизируют коллагенсодержащий раствор и отделяют коллаген. Гидролиз проводят в две стадии. Первую стадию выполняют путем обработки реакционной смеси липазой из гриба Rhizopus oryzae, а на второй стадии используют протеолитический фермент в виде нейтральной протеазы. Изобретение позволяет получить коллаген, близкий по своим физико-химическим и структурно-механическим свойствам к природному. 3 з п. ф-лы.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической, медицинской и других областях промышленности.

Хорошо известно, что коллаген является основным структурным белком всех существующих живых существ. Любые изменения этого структурного белка приводят к заболеваниям кожи, внутренних органов и, в конечном итоге, к старению всего организма в целом («Trends Glycosci. Glucotetechnol.», 1992, V.4, №19, стр.465-498; «Белки» / ред. Нейрат Г. и Бейли К.М.: Из-во Иностранной литературы, 1959 г., с.400-438, Антипова В.А., Глотова И.А. / «Основы рационального использования коллагенсодержащего сырья в мясной промышленности». Воронеж.: Воронежская гос. технол. Академия, 227 с., 1998 г.).

Из литературы также известно, что коллаген частично меняет свою конформацию и свои уникальные свойства при низких (ниже 5) и высоких (выше 10) значениях рН. Поэтому в большинстве случаев исследователи получают не природный коллаген, который особенно ценен в силу своих физико-химических свойств, позволяющих использовать его в различных областях промышленности, даже в такой, как электронная промышленность, в качестве одного из лучших диэлектриков, а его высокомолекулярные фракции (Jesperson L., Tompson P. Eur. 1992. Eur. 14254. Composting compact Quel Assur. Criter., стр.197-203).

В настоящее время хорошо известны многочисленные способы получения коллагена из различных сырьевых источников (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. «Биологически активные соединения из природных объектов. Свойства, структурно-функциональные взаимосвязи». М.: МГУЛ, 2003, стр.369-412). Однако приведенные методы дают возможность получения не самого коллагена, а его фракций, которые, в лучшем случае, приближаются по своим свойствам к предшественнику коллагена, на основе которого он строит свои цепи - тропоколлагену.

Известен способ получения коллагена, в котором сырье, содержащее коллаген, предлагается вначале замачивать в воде, охлаждаемой льдом при рН 5,5, а затем, увеличив рН до 10,5, обрабатывать полученный конгломерат алкалазой и затем вновь снижать рН раствора до 5,5. Фильтрация и последующая стерилизация раствора обеспечивает получение коллагена (см. патент РФ №2094999, кл. А 22 С 13/00, С 07 К 1/36, 1997 г. - прототип).

Недостатком известного способа является применение в качестве протеолитического фермента щелочной алкалазы в течение 3 часов при значении рН выше 10, что, как известно из приведенных источников, может привести к частичному гидролизу связей коллагена между оксилизином и глутаминовой кислотой, разрушению основных аминокислот и частичному дегликозированию белковой молекулы, в результате чего нарушается структура коллагена и, следовательно, все его ценные физико-химические свойства. Кроме того, гомогенизацию коллагена осуществляют при рН 3,0. При этих значениях рН происходит гидролиз пептидных связей между Гли-Про и Гли-Опро, а также между Гли-Иле и Гли-Лей и другими аминокислотами. Применять фермент после коагуляции коллагена в изоэлектрической точке (рН 5,5) является малоэффективным процессом, поскольку происходит одновременный захват других сопутствующих белков, в связи с чем становится малоэффективной их последующая обработка алкалазой. Кроме того, белок сохраняет свою конфигурацию, а следовательно, и свои химико-физические и структурно-механические свойства в нейтральных условиях при рН, равном 6,5-7,5, т.е. в тех условиях, которые наиболее приемлемы для существования большинства млекопитающих.

Целью предлагаемого изобретения является получение коллагена, близкого к природному белку по своим физико-химическим и структурно-механическим свойствам с применением известных и доступных протеолетических ферментов.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения коллагена, включающем очистку белкового сырья, добавку воды и льда в массовом соотношении 1:1, измельчение смеси, гидролиз измельченной смеси в течение 1,5-3 часов с протеолетическим ферментом при технологических значениях рН не более 11 и температуре в диапазоне 37-40°С, гомогенизацию коллагенсодержащего раствора посредством центрифугирования, затем отделение коллагена посредством промывки водой при рН, равном 5,5, и последующее получение искомого продукта в чистом виде, предварительно белковое сырье измельчают в куттере при температуре 0-5°С и замачивают в холодной воде в течение одного часа, затем проводят двухстадийный гидролиз полученной реакционной смеси в присутствии 5% этанола от объема с промежуточным центрифугированием и промывкой водой, обеспечивая технологические значения величины рН в пределах 7,5-8,0 и ионной силы реакционной смеси в пределах 0,05-0,1 н посредством добавки карбоната натрия и хлорида натрия соответственно, причем первую стадию гидролиза выполняют путем обработки реакционной смеси липазой из гриба Rhizopus oryzae, а вторую стадию путем обработки протеолетическим ферментом, например нейтральной протеазой, трипсином или химотрипсином.

Для осуществления предлагаемого изобретения в качестве сырья используются промытые кишки, каныга или кожный покров млекопитающих и птиц, а также плавательные пузыри гидробионтов и рыб, отделенных от сопутствующих им белков. Полученную массу измельчают в куттере при 0÷5°С, замачивают в холодной воде в течение часа. После этого воду отделяют и к полученной массе вновь добавляют воду, содержащую NaCl и 5% этанола от объема смеси, доводят значение рН до 7,5 посредством карбоната натрия, полученную массу нагревают до 40°С и к смеси добавляют липазу с активностью не ниже 40000, определенную по гидролизу оливкового масла. Смесь перемешивают 1-3 часа при вышеуказанной температуре, следя за изменением рН и поддерживая его в интервале 7,5-8,0. По окончании этой процедуры водный раствор сливают, оставшуюся массу тщательно промывают холодной водой. После промывки к ней добавляют воду и NaCl, сохраняя ионную силу раствора в пределах 0,05-0,1 н. Полученную суспензию вновь нагревают до 37-40°С, добавляют к реакционной смеси 5% этанола и нейтральную протеазу любого происхождения для гидролиза белков, сопутствующих коллагену, при полном отсутствии в них коллагеназы. Гидролиз проводят при перемешивании в течение 1-3 часов, в зависимости от активности выбранного фермента, поддерживая температуру реакционной массы 37-40°С и следя за ходом проведения процесса по приросту азота аминогрупп, освобождающихся при гидролизе, при помощи метода формольного титрования. Процесс заканчивают после того, как заканчивается прирост аминного азота. После окончания процесса доводят значение рН до 5,5 (изоэлектрическая точка коллагена), реакционную массу центрифугируют, несколько раз промывают водой, высушивают в вакууме при температуре не выше 40°С и полученный сухой продукт измельчают. В результате получают порошкообразный коллаген, содержащий 5-6% влаги, около 1% золы и имеющий молекулярную массу, определенную методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле, равную 1000-1100 кДа. Кроме коллагена с молекулярной массой 1000 кДа, продукт содержит около 5-7% его высокомолекулярных примесей с молекулярной массой 300-500 кДа. Белок также содержит свыше 10% углеводов, определенных после его кислотного гидролиза, что свидетельствует о сохранении в коллагене его гликозидной оболочки. Нижеследующий пример иллюстрирует предлагаемое изобретение.

Пример 1. 10 кг каныги после механической обработки измельчают в куттере с добавлением 10 кг льда так, чтобы температура реакционной массы не превышала 5°С, после чего переносят в реактор, куда добавляют 10 л холодной воды. Смесь перемешивают при этой температуре в течение часа, после чего центрифугированием отделяют воду от биомассы, несколько раз промывают холодной водой и вновь переносят в реактор, куда добавляют 100 л воды, 365 г NaCl и 5 л этанола. Реакционную массу медленно нагревают до 37-40°С, после чего к ней добавляют 45-50 г, например, грибной липазы из гриба Rhizopus oryzae с активностью 50000 ед., для гидролиза липидов, присутствующих в реакционной массе, постоянно поддерживая рН раствора в интервале 7,5-8,0 с помощью карбоната натрия. После окончания процесса гидролиза (около 1 часа) реакционную массу центрифугируют. Промывают водой и вновь помещают в реактор. Добавляют 250-300 г NaCl, так чтобы ионная сила реакционной среды была не ниже 0,05-0,1 н, и 10-15 г самого фермента в зависимости от его первоначальной активности. В качестве фермента используют нейтральную протеазу Г-10х из Bas. Subtilis. Реакционную смесь перемешивают при 37-40°С в течение 1,5-3 часов до прекращения прироста аминного азота, после чего к ней добавляют раствор Na₂CO₃ до получения рН реакционной смеси 5,5. Реакционную смесь охлаждают до 7-10°С, после чего центрифугируют, промывают несколько раз обессоленной водой и высушивают в вакуум-выпарном аппарате при 40°С до остаточной влажности 6-8%. Полученный сухой продукт измельчают и определяют его физико-химические показатели. Выход сухого коллагена из 10 кг каныги с влажностью 40% составляет 5 кг (83%), считая по белку в сырье. Продукт имеет влажность 5%, содержание углеводов, определенное с антроновым реактивом, 10%, золу 0,7%, молекулярную массу 970-1120 кДа. В качестве протеолетического фермента может быть использован трипсин, химотрипсин, грибная протеаза.

Пример 2. Проводится аналогично примеру 1, но вместо каныги берется рыбный пузырь. Выход сухого порошка коллагена 90%, зольность 0,5%, содержание углеводов 12%, молекулярная масса 1 000 кДа. Содержание других белков практически отсутствует.

Пример 3. Проводится аналогично примеру 1, но вместо каныги используются промытые кишки жвачных животных. Выход сухого порошка коллагена 89%, зольность 0,7%, содержание углеводов 15%, молекулярная масса 1200 кДа.

Таким образом, можно получить коллаген, близкий по своим физико-химическим и структурно-механическим свойствам к природному, из белковосодержащих отходов пищевого сырья.

1. Способ получения коллагена, включающий очистку белкового сырья, добавку воды и льда в массовом соотношении 1:1, измельчение смеси, гидролиз измельченной смеси в течение 1,5-3 ч с протеолитическим ферментом при технологических значениях рН не более 11 и температуре в диапазоне 37-40°С, гомогенизацию коллагенсодержащего раствора посредством центрифугирования, затем отделение коллагена посредством промывки водой при рН 5,5 и последующее получение искомого продукта в чистом виде, отличающийся тем, что предварительно белковое сырье измельчают в куттере при температуре 0-5°С и замачивают в холодной воде в течение одного часа, затем проводят двухстадийный гидролиз полученной реакционной смеси в присутствии 5% этанола от объема с промежуточным центрифугированием и промывкой водой, обеспечивая технологические значения величины рН в пределах 7,5-8,0 и ионной силы реакционной смеси в пределах 0,05-0,1 н посредством добавки карбоната натрия и хлорида натрия соответственно, причем первую стадию гидролиза выполняют путем обработки реакционной смеси липазой из гриба Rhizopus oryzae, а на второй стадии используют протеолитический фермент в виде нейтральной протеазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют протеолитический фермент в виде трипсина.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют протеолитический фермент в виде химотрипсина.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют протеолитический фермент в виде грибной протеазы.